融合基因骨形态发生蛋白-4/7重组腺相关病毒载体转染对骨髓基质干细胞成骨活性的作用

目的 应用高效细菌内同源重组系统pAd-Easy制备融合基因骨形态发生蛋白-4/7(BMP-4/7)基因的重组腺相关病毒(AAV),转染兔骨髓幕质干细胞(BMSCs),检测BMP-4/7的成骨活性.方法 采用RT-PCR一步法和基因重组法,从胎盘组织中克隆BMP-4和BMP-7成熟肽cDNA,获取BMP-4/7融合基因,克隆到pGEM质粒中;从pGEM-BMP-4/7质粒中切取BMP-4/7融合基因克隆到穿梭载体,在大肠杆菌内重组,在293细胞中构建AAV-BMP-4/7重组腺相关病毒载体;采用SDS-PAGE电泳榆测BMP-4/7融合基因蛋白在大肠杆菌的表达;采用ELISA法检测融合基因BMP-4/7在BMSCB中的表达.AAV-BMP4/7转染兔BMSCs细胞7、14 d后,行碱性磷酸酶及骨钙素含量测定,观察成骨活性,以非转染组作为对照. 结果成功构建高滴度的携带BMP-4/7融合基因的重组腺相关病毒AAV.BMP-4/7.AAV-BMPd/7重组质粒载体转化大肠杆菌进行诱导表达,SDS-PAGE电泳可见29～830 KD蛋白带,大多数蛋白存在于包涵体内.ELISA检测显示经AAV转染的BMSCs中BMP-4/7蛋白有表达,随着转染MOI值的增加,BMP-4/7蛋白的表达增高(P<0.01).AAV-BMP4/7转染细胞后,碱性磷酸酶及骨钙素含量均明显增高,并与转染后诱导培养的时间呈正相关,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01). 结论融合基因BMP-4/7可提高BMPs表达水平,有成骨活性,通过AAV可稳定表达.     

慢病毒介导兔脑红蛋白基因感染骨髓间充质干细胞的实验研究

[目的]构建携带兔脑红蛋白(neuroglobin,Ngb)基因的重组慢病毒,感染兔骨髓间充质干细胞(bonemarrow mesenchymal stem cells,BMSCs),建立稳定表达兔Ngb的BMSCs/Ngb细胞。[方法]构建携带Ngb基因的重组慢病毒载体,在脂质体Lipofectamine 2000作用下转染293 T细胞,Real-time PCR检测慢病毒滴度;以Ngb重组慢病毒感染BMSCs,通过荧光表达法判定感染复数(multiplicities of infection,MOI),实时荧光定量PCR(real-time PCR)、蛋白质印迹(Western blot)和酶联免疫吸附试验(ELISA)判定感染后的BMSCs中Ngb的表达情况。[结果]构建Ngb重组慢病毒载体,经酶切及测序鉴定完全正确,能够转染293 T细胞并表达,滴度为2×108 TU/ml,Ngb重组慢病毒感染BMSCs最佳MOI值为100,且Ngb重组慢病毒感染BMSCs能持续稳定高水平表达Ngb mRNA和蛋白。[结论]成功构建Ngb重组慢病毒,并将Ngb基因稳定感染至BMSCs中,实现Ngb的持续稳定高水平表...     

猪TGF-β1基因重组慢病毒载体的构建及其在BMSCs中的表达

目的构建猪TGF-β1重组慢病毒表达载体,并转染BMSCs,为构建组织工程骨软骨提供TGF-β1修饰的BMSCs,作为持续、高效的种子细胞。方法将已获取的目的基因TGF-β1cDNA包装至慢病毒载体中,通过PCR及基因测序对阳性克隆进行鉴定,并测定病毒滴度。取2月龄巴马香猪(体重约15 kg)骨髓制备BMSCs,取第2～3代用于实验。用TGF-β1重组慢病毒载体以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为10、50、70、100、150分别转染BMSCs,通过激光共聚焦显微镜观察,并以Western blot检测不同MOI值的转染效果,确定最佳MOI值。用TGF-β1重组慢病毒载体以最佳MOI值感染BMSCs作为实验组,以空载体转染的BMSCs(空载体组)及未转染的BMSCs(空白组)作为对照,通过RT-PCR、免疫细胞化学染色、ELISA等方法检测TGF-β1基因及蛋白在BMSCs中的表达情况,并检测Ⅱ型胶原表达情况。结果经PCR及基因测序鉴定TGF-β1重组慢病毒表达载体构建成功,并成功转染BMSCs,激光共聚焦显微镜下可观察到强绿色荧光;Western blot示MOI为70时转染效果最佳;RT-PCR示实验组TGF-β1基因的表达量明显高于空载体组及空白组,差异有统计学意义(P<0.05);免疫细胞化学染色示实验组TGF-β1蛋白及Ⅱ型胶原呈阳性表达,而空载体组及空白组呈弱阳性或阴性表达;ELISA示实验组TGF-β1蛋白至转染后21 d仍有较高表达。结论 TGF-β1重组慢病毒表达载体可成功转染BMSCs,TGF-β1蛋白可长期、稳定表达,促使BMSCs向成软骨细胞方向分化。     

大鼠RNAi-A2aR慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建大鼠RNAi-腺苷A2a受体(A2aR)慢病毒载体并进行鉴定。方法首先构建3对短发夹RNA(shRNA)-A2aR序列(shRNA-A2aR 1、shRNA-A2aR 2、shRNA-A2aR 3), 在shRNA慢病毒载体中分别插入3对双链shRNA oligo, shRNA慢病毒重组质粒构建成功后, 将重组质粒、包装载体、穿梭载体共转染293T细胞, 从而获得病毒液。实验Ⅰ采用随机数字表法将大鼠原代心肌细胞分为3组(n=6):空载组(V组)、shRNA-A2aR 1组和shRNA-A2aR 3组, 各组分别转染MOI为10的相应病毒液, 转染48 h时, Western blot法检测A2aR表达水平, 确定干扰效率, 以筛选最佳慢病毒载体。实验Ⅱ采用随机数字表法将大鼠原代心肌细胞分为5组(n=36):空载组(V组)、MOI5组、MOI10组、MOI15组和MOI20组, 各组分别转染相应MOI的病毒液(最佳慢病毒载体), 于转染24、48和72 h时, 采用CCK-8法测定细胞存活率, 荧光显微镜下观察细胞活力和细胞死亡情况, Western blot法检测A2aR表达水...     

hVEGF165基因转染大鼠BMSCs的实验研究

目的构建携带hVEGF165基因的重组腺病毒载体pAdxsi-增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)-hVEGF165,体外转染大鼠BMSCs,观察转染后hVEGF165的表达情况以及对BMSCs生长增殖的影响,为进行血管再生的基因治疗奠定实验基础。方法将hVEGF165从原始质粒切下连接到pShuttle-巨细胞病毒-EGFP重组穿梭载体,并转移至pAdxsi载体上,获得重组腺病毒载体质粒pAdxsi-EGFP-hVEGF165,进行酶切鉴定及基因测序。采用PacI限制性内切酶线性化pAdxsi-EGFP-hVEGF165,并转染人胚肾细胞HEK293,收获重组腺病毒,测定病毒滴度。贴壁法培养Wistar大鼠BMSCs,体外转染携带EGFP基因的重组腺病毒(pAdxsi-EGFP),荧光倒置相差显微镜及流式细胞术确定最佳病毒感染复数(multiplicities of infection,MOI)。依据最佳MOI转染pAdxsi-EGFP-hVEGF165至BMSCs,采用Western blot、RT-PCR及ELISA法检测转染后hVEGF165的表达;MTT法评价转染后BMSCs生长增殖情况。结果酶切鉴定及基因测序提示重组腺病毒载体质粒含有hVEGF165 cDNA;经多轮感染、扩增后,病毒滴度可达1×1010 pfu/mL。荧光倒置相差显微镜观察转染pAdxsi-EGFP后MOI为150 pfu/cell时转染效果最佳,流式细胞仪检测转染效率约88%。Western blot和RT-PCR检测示,pAdxsi-EGFP-hVEGF165转染BMSCs 48 h后在蛋白质和基因水平均可有效表达hVEGF165;ELISA检测示其含量在7 d达高峰,在20 d时仍有表达,1、3、5、7、9、11、13、15、20 d各时间点hVEGF165含量均显著高于EGFP基因转染组及未转染组(P<0.05)。MTT结果显示,各时间点转染pAdxsi-EGFP-hVEGF165的BMSCs与未转染组细胞的吸光度(A)值比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 BMSCs是一种较理想的基因载体细胞,成功制备的重组腺病毒载体质粒可在MOI值为150时将hVEGF165基因有效转染至BMSCs;转染后hVEGF165表达水平较高、持续时间较长,且对BMSCs的生长增殖无明显影响。     

慢病毒介导绿色荧光蛋白基因转染大鼠软骨细胞表达的研究

[目的]构建携带绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein,GFP)的慢病毒载体系统,通过感染大鼠软骨细胞,观察其感染能力及GFP的表达情况.[方法]以载体质粒pLentiLox 3.7、包装质粒pRSV-REV、pMDL g/p RRE及包膜质粒VSV-G共转染293T细胞制备慢病毒.分离、培养大鼠关节软骨细胞,将制备好的慢病毒颗粒感染软骨细胞,在荧光显微镜下观察报告基因GFP的表达情况.[结果]重组慢病毒载体系统转染293T细胞96 h后可观测到较强的绿色荧光蛋白的表达,收集上清测得病毒滴度约为3.0×103ifu/μl,并且在80%大鼠软骨细胞中观察到GFP的表达.[结论]成功构建了携带GFP的重组慢病毒载体系统,对大鼠关节软骨细胞转染效果良好,为将来结合RNA干扰技术对软骨细胞进行基因改造提供了基础.     

胶质细胞源性神经营养因子慢病毒载体体外转染嗅鞘细胞MOI值的研究

目的 探讨胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)慢病毒载体(lentivirus vector)体外转染嗅鞘细胞(OECs)并能稳定表达目的 蛋白的最佳感染复数(MOI).方法 构建GDNF-lentivirus,体外转染293T细胞,获得高滴度的慢病毒浓缩液,测定病毒滴度达2×108 TU/ml.不同MOI的情况下,GDNF-lentivirus体外转染OECs,Western blot检测GDNF的表达.结果 相差显微镜明视野下动态观察转染后的OECs生长状态良好,荧光显微镜下见大量绿色荧光蛋白(GFP)标记的转染成功的OECs.MOI=100时,OECs的转染率最高,约为75%,MOI=50时约为68%,MOI=10和MOI=1时分别为25%和13%,阴性对照组未见有绿色荧光表达.转染后第5天,收集OECs进行Western blot检测,MOI=100和MOI=50时GDNF表达最强,两者差异无统计学意义(P＞0.05),MOI=10表达较少,而MOI=1表达最少,对照组无GDNF表达.结论 GDNF-lentivirus在体外既能高效转染OECs又不影响细胞活性,且转染后的OECs可以长期稳定表达GDNF的适宜MOI为50～100之间.     

慢病毒介导NgR基因转染骨髓基质细胞的研究

目的 构建编码大鼠NgR(Nogo receptor)细胞外功能区的慢病毒载体,转染大鼠骨髓基质细胞(BMSCs),使其能高表达NgR的细胞外功能区.方法 体外分离培养大鼠BMSCs、293FT包装制备病毒,用包装好的慢病毒颗粒感染BMSCs,间接免疫荧光及Western blot方法检测BMSCs表达NgR的情况.结果 筛选阳性重组载体plenti6-NgR,酶切后得到930 bp的条带,与设计的NgR基因片段大小一致,表明载体构建成功.转染BMSCs 48 h后,间接免疫荧光法可见胞质内明显荧光表达,Western blot得到相对分子质量为37×103的条带,与NgR蛋白相对分子质量一致.结论 ViraPowerTM慢病毒表达系统可将NgR(310)ecto基因转染入骨髓基质细胞表达,后者可以作为种子细胞拮抗脊髓损伤局部形成的抑制性微环境.     

携带人胰岛素基因慢病毒载体转染人脐带间充质干细胞的实验研究

目的构建共表达增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因和人胰岛素(insulin)基因的慢病毒载体,探讨其对人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)的转染情况,为今后组织工程脂肪构建与体内回植研究奠定基础。方法采用DNA重组技术,将insulin基因克隆至带EGFP的慢病毒表达载体pLenti6.3-内部核糖体进入位点序列(internal ribosome entry site,IRES)-EGFP中,筛选阳性克隆,并用脂质体介导法将慢病毒包装系统和带目的基因的质粒pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP共同转染到293T细胞内包装病毒,荧光倒置相差显微镜观察包装细胞报告基因的表达情况。收集病毒上清,纯化浓缩,测定重组病毒的滴度。取足月儿脐带以组织块培养法分离培养hUCMSCs,以不同感染复数(multiple of infection,MOI,分别为0、1、3、5、7、10、15、20)的重组慢病毒感染hUCMSCs,通过报告基因绿色荧光蛋白的表达筛选最适MOI;以最适MOI重组慢病毒感染hUCMSCs,应用实时荧光定量PCR及Western blot法分别检测细胞中insulin基因及insulin蛋白水平的表达情况。结果成功构建了共表达insulin基因和EGFP基因的重组慢病毒载体pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP,并对其成功包装、纯化及浓缩,病毒滴度为1.3×108TU/mL。不同MOI的重组慢病毒感染hUCMSCs后,通过绿色荧光蛋白表达的阳性细胞数筛选其最适MOI为10,此时对细胞的转染效率可达到90%。实时荧光定量PCR检测示转染组insulin mRNA表达阳性,未转染组为阴性;Western blot检测示转染组细胞内及上清液insulin蛋白表达阳性,未转染组均为阴性。结论构建的携带insulin基因的重组慢病毒载体pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP可有效转染hUCMSCs,表达insulin蛋白。     

骨形态发生蛋白-7的过表达载体对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的 探讨骨形态发生蛋白-7(BMP-7)的过表达载体对骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的影响.方法 取10例健康志愿者的骨髓组织,培养原代BMSCs.采用流式细胞仪检测BMSCs的表面蛋白,对BM-SCs进行鉴定.利用基因编辑技术,构建BMP-7的过表达载体,通过慢病毒转染BMSCs,将BMSCs分成转染组和未...     

慢病毒介导的miPSC-EC YAP基因过表达及稳定感染细胞系的建立

目的建立稳定过表达Yes相关蛋白(YAP)的小鼠诱导性多能干细胞来源的内皮细胞(miP SC-EC)系,为miP SC-EC过表达YAP基因的体内外实验研究奠定基础。方法将模板质粒(p CMV-Flag-YAP2-5SA)改建成慢病毒表达质粒(p PGK-2Flag-YAP2-Puro);将慢病毒表达质粒与包装质粒组成共包装系统转染293FT细胞;包装慢病毒,收集病毒原液,超滤浓缩,测定滴度。诱导miP SC分化为EC,观察其形态特征,并行组织化学鉴定。包装好的慢病毒感染miP SC-EC,嘌呤霉素筛选稳定感染的细胞系miP SC-EC/YAP,并用RT-PCR及Western blot方法验证。结果慢病毒表达质粒(p PGK-2Flag-YAP2-Puro)构建成功,并成功包装YAP基因过表达慢病毒,滴度达到1.2×109 TU/ml。miP SC诱导分化所得细胞符合EC形态特征,几乎都表达EC标志CD31。转染YAP的miP SC-EC中YAP m RNA表达水平较未转染细胞明显升高,YAP蛋白高表达(未转染细胞中YAP蛋白几乎不表达)。结论成功构建YAP基因慢病毒过表达载体,诱导miP SC分化为EC,成功建立YAP基因稳定感染细胞系miP SC-EC/YAP。     

重组BMP4/7融合基因腺相关病毒的构建及其对兔骨髓基质干细胞生物学行为的影响

[目的] 应用重组骨形成蛋白4/7融合基因腺相关病毒载体(AAV BMP4/7)转染兔骨髓基质干细胞(BMSCs),观察其对BMSCs生物学行为的影响.[方法] (1)采用RT-PCR一步法和基因重组法,从胎盘组织中克隆BMP4和BMP7成熟肽cDNA,获取BMP4/7融合基因,克隆到质粒pGEM质粒中;(2)从pGEM-BMP4/7质粒中切取BMP4/7融合基因克隆到穿梭质粒,在大肠杆菌内重组,在293细胞中构建AAV-BMP4/7重组腺相关病毒载体;(3)不同MOI值的AAV-BMP4/7转染兔BMSCs,观察细胞形态学变化,MTT法描记细胞生物曲线,观察对细胞增殖的影响,以AAV-EDFP做对照;(4)AAV-BMP4/7转染兔BMSCs细胞7、14 d后,行ALP及OC含量测定,观察成骨活性,以AAV-EDFP做对照.[结果] (1)成功构建高滴度的携带BMP4/7融合基因的重组腺相关病毒AAV-BMP4/7;(2)AAV-BMP4/7转染BMSCs细胞后,细胞增殖活性良好,转染效率为72%,细胞形态呈典型的成骨改变,1×105 vg/cell的MOI值对细胞形态影响较小,而转染效率强于5×104vg/cell(59.38%).(3)AAV-BMP4/7转染细胞后,ALP、OC含量均明显增高,并与转染后诱导培养的时间呈正相关,与对照组比较差异统计学意义(tALP=896.88 P<0.001 tOC=543.24 P<0.01).[结论] AAV-BMP4/7融合基因转染效率高,对BMSCs细胞有明显的诱导成骨活性,对骨愈合的基因治疗提供了新的思路和途径.     

转基因干细胞构建组织工程骨的初步实验研究

目的 用转基因干细胞在体外构建组织工程骨.方法 用携带有人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)和增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的慢病毒感染骨髓基质干细胞(BMSCs)后接种于纳米羟基磷灰石/胶原/聚乳酸(nHAC/PLA)支架.荧光显微镜下观察eGFP表达,判断感染效率;RT-PCR、ELISA和Western-blot用于基因转染的表达检测;流式细胞仪检测细胞增殖;扫描电镜观察细胞在支架材料中的黏附、生长状况;ALP活性检测成骨能力.结果 慢病毒24 h对BMSCs的转染率约为90%;RT-PCR检测到BMP-2阳性表达,与实际值1191 bp基本一致;ELIISA检测24 h BMP-2蛋白含量为(148.2±21.6)pg/ml;流式细胞仪检测到细胞S期比例增加;ALP活性检测基因转染组明显强于对照组(P＜0.05);扫描电镜见细胞在nHAC/PLA支架上粘附生长良好;第8周时Western-blot仍可检测到BMP-2在相对分子质量26×103处出现阳性条带.结论 BMP-2基因可在BMSCs稳定表达并诱导其向成骨分化,与nHAC/PLA复合培养可用于组织工程骨构建.     

转基因干细胞构建组织工程骨的初步实验研究

目的 用转基因干细胞在体外构建组织工程骨.方法 用携带有人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)和增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的慢病毒感染骨髓基质干细胞(BMSCs)后接种于纳米羟基磷灰石/胶原/聚乳酸(nHAC/PLA)支架.荧光显微镜下观察eGFP表达,判断感染效率;RT-PCR、ELISA和Western-blot用于基因转染的表达检测;流式细胞仪检测细胞增殖;扫描电镜观察细胞在支架材料中的黏附、生长状况;ALP活性检测成骨能力.结果 慢病毒24 h对BMSCs的转染率约为90%;RT-PCR检测到BMP-2阳性表达,与实际值1191 bp基本一致;ELIISA检测24 h BMP-2蛋白含量为(148.2±21.6)pg/ml;流式细胞仪检测到细胞S期比例增加;ALP活性检测基因转染组明显强于对照组(P＜0.05);扫描电镜见细胞在nHAC/PLA支架上粘附生长良好;第8周时Western-blot仍可检测到BMP-2在相对分子质量26×103处出现阳性条带.结论 BMP-2基因可在BMSCs稳定表达并诱导其向成骨分化,与nHAC/PLA复合培养可用于组织工程骨构建.     

转基因干细胞构建组织工程骨的初步实验研究

目的 用转基因干细胞在体外构建组织工程骨.方法 用携带有人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)和增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的慢病毒感染骨髓基质干细胞(BMSCs)后接种于纳米羟基磷灰石/胶原/聚乳酸(nHAC/PLA)支架.荧光显微镜下观察eGFP表达,判断感染效率;RT-PCR、ELISA和Western-blot用于基因转染的表达检测;流式细胞仪检测细胞增殖;扫描电镜观察细胞在支架材料中的黏附、生长状况;ALP活性检测成骨能力.结果 慢病毒24 h对BMSCs的转染率约为90%;RT-PCR检测到BMP-2阳性表达,与实际值1191 bp基本一致;ELIISA检测24 h BMP-2蛋白含量为(148.2±21.6)pg/ml;流式细胞仪检测到细胞S期比例增加;ALP活性检测基因转染组明显强于对照组(P＜0.05);扫描电镜见细胞在nHAC/PLA支架上粘附生长良好;第8周时Western-blot仍可检测到BMP-2在相对分子质量26×103处出现阳性条带.结论 BMP-2基因可在BMSCs稳定表达并诱导其向成骨分化,与nHAC/PLA复合培养可用于组织工程骨构建.     

神经生长因子β亚基基因修饰大鼠脂肪源干细胞的构建

目的构建过表达神经生长因子β亚基(h NGFβ)大鼠脂肪源性干细胞(ADSCs),为基因修饰ADSCs移植治疗神经损伤性勃起功能障碍(ED)大鼠模型提供种子细胞。方法获取人NGFβ基因,并与线性化的慢病毒载体p LV5-EGFP定向克隆连接。构建p LV5-h NGFβ-EGFP穿梭质粒转染HEK293T细胞,采用Western Blot检测h NGFβ基因在HEK293 T细胞中的表达情况。利用LV5慢病毒包装系统包装产生重组慢病毒,包装后扩增纯化并测定病毒滴度。h NGFβ基因重组慢病毒转染大鼠ADSCs,观察EGFP表达情况,用Western Blot检测h NGFβ基因表达情况。结果经实时荧光定量(PCR)鉴定、限制性酶切分析、测序鉴定和目的质粒Western Blot表达检测鉴定,证实p LV5-h NGFβ-EGFP重组慢病毒载体构建成功。重组慢病毒包装成功且病毒滴度为1.0×10~9 PFU/ml。Western Blot于大鼠ADSCs中检测到约13.5 KDa大小条带,其与h NGFβ蛋白分子量大小相一致。结论h NGFβ基因修饰的ADSCs构建成功,从而为基因修饰ADSCs移植治疗ED提供了良好的基因工程细胞。     

LMP-1基因慢病毒载体构建及其在大鼠骨髓间充质干细胞的表达

目的：构建人LMP-1重组慢病毒载体,体外转染大鼠骨髓间充质干细胞,检测LMP-1基因在大鼠骨髓间充质干细胞的表达。方法：利用PCR法从cDNA文库中钓取LMP-1基因,将其与经AgeI酶切线性化的慢病毒载体pGC-FU-EGFP相连接,转化感受态大肠杆菌,筛选出阳性克隆pGC-FU-LMP-1-EGFP,基因测序对其鉴定。经293T细胞包装后,收集富舍病毒颗粒LV-LMP-1-EGFP的细胞上清,浓缩并标定滴度,RT-PCR检测并鉴定。以最佳MOI值体外转染大鼠骨髓间充质干细胞,荧光显微镜观察转染是否成功,流式细胞仪检测转染效率,RT-PCR和Westernblot检测转染细胞LMP-1基因的表达。结果：①基因测序及RT-PCR检测证实携带人LMP-1基因的慢病毒载体构建成功,包装后获得滴度为2×10^8 TU／ml的LV-LMP-1-EGFP。②以MOI=100转染大鼠骨髓间充质干细胞,荧光显微镜下可见大量绿色荧光蛋白表达,转染效率可达93．5％,经RT-PCR与Westernblot检测,被转染细胞内有LMP-1基因表达。结论：成功构建携带人LMP-1基因的慢病毒载体,可高效转染大鼠骨髓间充质干细胞,被转染细胞可高效表达LMP-1基因。     

转BMP-7基因BMSCs复合nHAC体外培养的实验研究

目的 建立能够稳定表达骨形态发生蛋白-7(BMP-7)的骨髓基质干细胞(BMSCs),并与纳米羟基磷灰石胶原(nHAC)材料复合培养体外构建组织工程骨.方法 用慢病毒把人BMP-7基因和增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因导入大鼠BMSCs,用G418筛选获得阳性细胞后接种于nHAC支架体外复合培养.荧光显微镜下观察eGFP表达, 判断感染效率;以四唑盐(MTT)实验检测细胞活力;RT-PCR、ELISA检测目的基因表达;碱性磷酸酶(ALP)活性检测成骨能力;扫描电镜观察细胞在支架材料中的黏附、生长状况.结果 慢病毒24 h对BMSCs的转染率约为90%;MTT实验显示细胞活性较未转染组无明显差异(P＞0.05);RT-PCR检测到BMP-7表达,在1 300 bp处出现特异性条带;ELISA检测24h BMP-7蛋白含量为(150.2±18.3)pg/ml;ALP活性以第16天左右最强;扫描电镜见细胞种植nHAC支架后粘附、生长良好.结论 BMP-7可在BMSCs内稳定表达,并诱导其向成骨分化;与nHAC复合培养可构建组织工程骨.     

免疫基因CD1d和绿色荧光蛋白融合基因慢病毒载体的构建

目的:构建人免疫基因CD1d与绿色荧光蛋白(GFP)融合基因慢病毒载体。方法:实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增获得CD1d的全外显子片段,使之克隆到带GFP荧光报告基因慢病毒表达载体质粒中,慢病毒包装质粒和穿梭质粒转染293T细胞,包装成功后收集上清,浓缩,鉴定。取浓缩纯化后的病毒上清感染293T细胞,荧光显微镜观察荧光表达。结果:电泳鉴定结果与目的基因表达条带完全吻合,克隆测序结果与NCBI收录的CD1d基因序列完全一致。重组慢病毒质粒可高效转染293T细胞,荧光显微镜下可观察到大量绿色荧光。结论:成功构建了CD1d与GFP融合基因慢病毒表达载体,为进一步研究CD1d基因的相关功能提供了适合的稳定转染载体。     

分化抑制因子1基因对BMP-2促进兔椎间盘软骨终板细胞软骨特性基因表达的影响

目的探讨通过慢病毒干扰细胞分化抑制因子1(inhibitor of differentiation 1,Id1)基因表达,对BMP-2促进兔椎间盘软骨终板细胞软骨特异性基因Ⅱ型胶原、蛋白多糖表达的影响。方法取新西兰大白兔椎间盘软骨终板组织分离培养软骨终板细胞,取第2代细胞进行实验。使用绿色荧光蛋白慢病毒、高表达Id1基因慢病毒及RNA干扰(RNA interference,RNAi)Id1基因慢病毒转染椎间盘软骨终板细胞,采用荧光显微镜、实时荧光定量PCR及Western blot法观察慢病毒转染情况以及对细胞Id1基因和蛋白表达的影响。使用上述慢病毒与BMP-2慢病毒共同转染软骨终板细胞,并设置BMP-2慢病毒转染对照,通过实时荧光定量PCR、ELISA法观察Id1基因表达差异对BMP-2促进椎间盘终板软骨细胞合成Ⅱ型胶原和蛋白多糖的影响。结果慢病毒转染对细胞形态无明显影响,高表达Id1基因和RNAi Id1基因慢病毒能有效转染软骨终板细胞,并干扰内源性Id1基因的表达。BMP-2慢病毒和高表达Id1基因慢病毒共同转染软骨终板细胞后,Ⅱ型胶原、蛋白多糖基因表达和蛋白合成均显著高于BMP-2慢病毒、高表达Id1基因慢病毒单独转染,差异有统计学意义(P0.05)。Id1基因表达下降后,软骨终板细胞Ⅱ型胶原、蛋白多糖合成明显下调(P0.05)。结论 Id1基因表达上调能协同BMP-2促进软骨终板细胞Ⅱ型胶原、蛋白多糖表达。