白细胞介素-34 对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞CCL28 表达的影响

目的:初步探讨白细胞介素-34(IL-34)对类风湿关节炎(RA)患者成纤维细胞样滑膜细胞(FLS)CC 趋化因子配体28(CCL28)表达的影响。方法:选取6 例RA 患者关节滑膜分离并培养FLS,分别用IL-34、IL-34 受体拮抗剂/ IL-34、信号通路抑制剂/ IL-34 刺激。采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测FLS CCL28 mRNA 的表达;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养上清中CCL28 水平。两组间比较采用t 检验。结果:与对照组相比,IL-34 刺激后FLS 分泌CCL28 增多(P<0.05);加入IL-34 受体拮抗剂后FLS 分泌CCL28 水平降低(P<0.05);细胞培养体系中加入核因子-κB(NF-κB)、丝裂原活化蛋白激酶38(p38MAPK)信号通路抑制剂后,CCL28 表达明显降低(P<0.05)。结论:IL-34 与其受体结合可能通过激活NF-κB 和p38 MAPK 信号通路促进RA FLS 分泌CCL28,从而参与RA 的发病过程。     

TWEAK诱导成纤维样滑膜细胞合成MMP-9的研究

目的 通过探讨p38MAPK(mitogen-activated protein kinases)信号通路在肿瘤坏死因子样凋亡的微弱诱导剂(TWEAK)诱导风湿性关节炎(RA)成纤维样滑膜细胞(FLS)合成基质金属蛋白酶9(MMP-9)过程中的作用,寻求RA治疗的新靶点.方法 将rhTWEAK与FLS共培养,Western blot法检测FLS中p-p38MAPK和p65的表达;对经或未经SB203580预处理的FLS,应用ELISA法检测细胞培养液中MMP-9水平,RT-PCR法检测FLS中MMP-9 mRNA的表达水平.结果 100 ng/ml的TWEAK作用于RA FLS,能够使p38MAPK磷酸化,并使细胞核内p65蛋白表达增加;SB203580能够部分抑制TWEAK诱导RA FLS合成的MMP-9及MMP-9 mRNA的表达.结论 TWEAK诱导RA FLS合成IVlbtP-9过程中,p38MAPK信号通路处于激活状态,可诱导NF-κB表达.     

Fractalkine对类风湿关节炎患者成纤维样滑膜细胞中NF-κB活化及内源性fractalkine mRNA表达的影响

目的:观察Fractalkine(FKN)对类风湿关节炎(RA)患者成纤维样滑膜细胞(FLS)核转录因子κB (NF-κB)活化以及内源性FKN mRNA表达的影响.方法:通过组织块法培养RA-FLS.在RA-FLS中加入100 μg/L FKN,分别作用0 h、1 h及2 h,用Western blotting检测RA-FLS胞浆及胞核中NF-κB p65蛋白表达量变化以明确NF-κB的活化情况;加入100 μg/L重组人FKN分别作用0 h、12 h、18 h后,用RT-PCR检测FKN mRNA表达的变化.结果:重组人FKN刺激1 h后,RA-FLS胞浆中NF-κB p65蛋白水平明显低于无FKN刺激的对照组(P<0.05);FKN刺激后2 h,细胞核中NF-κB p65蛋白水平较对照组明显升高(P<0.05).100 μg/L重组人FKN刺激RA-FLS,呈时间依赖方式诱导内源性FKN mRNA表达.FKN刺激RA-FLS18 h,细胞中FKN mRNA的表达水平明显升高(P<0.05).结论:外源FKN可刺激RA-FLS内源性的FKN mRNA表达上升,提示RA-FLS中可能存在FKN的正反馈现象.FKN对NF-κB有活化作用,可能对RA患者关节中炎症的启动、血管生成和骨质破坏有重要作用.     

梅毒螺旋体膜蛋白Tp0971激活MAPKs和NF-κB诱导巨噬细胞分泌TNF-α和IL-1β

目的:探讨梅毒螺旋体(Tp)膜蛋白Tp0971诱导巨噬细胞分泌TNF-α和IL-1β的分子机制。方法:课题组前期表达的Tp0971重组蛋白为研究对象,将不同浓度的重组Tp0971刺激巨噬细胞,分别采用ELISA和实时定量PCR检测TNF-α和IL-1β的分泌及其mRNA的表达。采用Western blot检测丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs) p38,ERK1/2以及JNK1/2的磷酸化,并用相应的抑制剂处理观察TNF-α和IL-1β的变化。同时采用Western blot观察核转录因子κB(NF-κB)的核转位情况,并采用抑制剂处理观察其在介导TNF-α和IL-1β分泌中的作用。结果:ELISA结果显示,重组Tp0971能在0.5～10μg/ml剂量范围内诱导巨噬细胞分泌TNF-α和IL-1β。并能促进其mRNA表达,采用转录抑制剂放线菌素D(Act D)或翻译抑制剂放线菌酮(CHX)处理后,TNF-α和IL-1β的转录和分泌水平显著降低。Tp0971也可诱导p38,ERK1/2以及JNK1/2磷酸化,采用其相应的抑制剂处理后,TNF-α和IL-1β分泌明显减少。Western blot结果也显示Tp0971能诱导NF-κB p65亚基核转位,采用NF-κB抑制剂PDTC处理后,TNF-α和IL-1β分泌水平降低。结论:Tp0971激活MAPKs和NF-κB诱导巨噬细胞分泌TNF-α和IL-1β。     

肺泡Ⅱ型上皮细胞A549对TNF-α和LPS的刺激效果研究

目的研究肺泡Ⅱ型上皮细胞A549对TNF-α和脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)刺激的反应效果,探讨急性肺损伤体外细胞模型最佳造模方法。方法体外培养的A549细胞分为正常对照组(normal control,NC组),10 ng/ml TNF-α刺激2 h组,10 ng/ml和100 ng/ml LPS分别刺激2、4、8、16 h组。Western blotting检测胞浆IκB-α含量和IκB-α、NF-κB p65磷酸化水平,qRT-PCR检测细胞TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA转录水平,ELISA检测细胞培养上清IL-1β和IL-6质量浓度。结果 TNF-α刺激导致A549细胞大量凋亡或死亡,而LPS刺激对A549细胞生长形态无明显影响,且与LPS的刺激质量浓度和时间无关。TNF-α刺激可明显增加A549细胞内IκB-α和NF-κB p65磷酸化水平(P<0.05),而LPS刺激对A549细胞内IκB-α和NF-κB p65磷酸化水平无明显影响(P>0.05),且与LPS的刺激质量浓度和时间无关(P>0.05)。TNF-α刺激可显著增加A549细胞内TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA转录水平和培养上清中IL-1β、IL-6质量浓度(P<0.05),而LPS刺激对上述炎症因子的合成和分泌并无显著影响(P>0.05),且与LPS的刺激质量浓度和时间无关(P>0.05)。结论 TNF-α可以有效刺激A549产生过度炎症反应,而LPS不能刺激A549细胞产生炎症损伤,因此建立急性肺损伤体外细胞模型时可以考虑用TNF-α代替LPS刺激。     

转化生长因子β1诱导胃癌细胞AGS分泌VEGF-C的机制研究

目的探讨转化生长因子β1(TGF-β1)诱导胃癌细胞AGS分泌血管内皮生长因子C(VEGF-C)的分子机制。方法体外培养胃癌细胞系AGS细胞,将其分为未刺激组、TGF-β1刺激组、TGF-βR抑制剂组、DMSO组、Smad3抑制剂组、NF-κB抑制剂组、MEK1/2抑制剂组、p38/MAPK抑制剂组以及JNK抑制剂组。除未刺激组外,其余各组均用TGF-β1刺激细胞,并用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养上清液中VEGF-C的水平。结果TGF-β1刺激组的VEGF-C分泌水平显著高于未刺激组,差异有统计学意义(P<0.05),TGF-β1能够诱导AGS细胞分泌VEGF-C,并具有剂量和时间依赖性。在TGF-β1刺激的条件下,TGF-βR抑制剂组及Smad3抑制剂组AGS细胞分泌的VEGF-C水平均显著低于DMSO组,差异有统计学意义(P<0.01);而NF-κB、MEK1/2、p38/MAPK和JNK抑制剂组中VEGF-C水平与DMSO组比较差异则无统计学意义(P>0.05)。结论TGF-β1可通过其受体及下游的Smad3信号通路诱导AGS细胞分泌VEGF-C,从而有助于胃癌的淋巴转移。     

NKp44~+NK细胞通过分泌IL-22介导Stat3信号途径依赖的RA FLS增殖效应

目的探讨类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)患者NKp44+自然杀伤(natural killer,NK)细胞促成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)增殖的作用机制。方法流式细胞术分选5例RA患者滑液NKp44+NK细胞(5×104/ml),ELISA检测NKp44+NK细胞培养上清IL-22含量。RA FLS加入NKp44+NK细胞培养上清,作用24、48、72 h后MTT法检测FLS增殖。观察不同质量浓度rh IL-22(1 500、3 000 ng/L)促RA FLS增殖作用,检测IL-22抗体及AG490对RA FLS增殖作用影响。RT-PCR检测rh IL-22及AG490作用后RA FLS Stat3 m RNA的表达,Western blot检测RA FLS Stat3、p-Stat3蛋白含量。结果 5例RA滑液NKp44+NK细胞体外分选纯度90%,培养上清IL-22质量浓度为(1 603.210±332.079)ng/L。NKp44+NK细胞上清可刺激RA FLS增殖(P0.01)。1 500、3 000 ng/L rh IL-22均能刺激RA FLS增殖。IL-22抗体及AG490能明显抑制NKp44+NK细胞上清诱导的RA FLS增殖(P0.01)。AG490能抑制rh IL-22诱导的RA FLS Stat3、p-Stat3表达(P0.05)。结论 RA患者NKp44+NK细胞可分泌IL-22,介导Stat3信号通路刺激RA FLS增殖。     

脂多糖对肺微血管内皮细胞IL-8表达的影响及其调控机理

目的探讨脂多糖(LPS)的直接诱导作用对肺微血管内皮细胞(PMVEC)IL-8表达的影响及通过核因子κB(NF-κB)的调控机理。方法肺微血管内皮(PMVEC)细胞生长至80 %以上融合度时用于实验。加入LPS以100ng/ml浓度刺激细胞分别至0、0.5、1、2、4、6、8h ,或LPS分别以1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml刺激细胞至1h或6h为检测时相点 ,每组6个标本。至预定时相点离心收集培养液上清 ,行IL -8ELISA检。用原位杂交试验检测培养液上清中分泌的IL -8及PMVEC内IL-8mRNA的表达 ;凝胶电泳迁移率分析 (EMSA)检测NF-κB的活化 ,以积分灰度值表示NF-κB的活性变化。观察NF -κB活化抑制 (PDTC)对IL-8表达的影响。结果LPS能显著促进PMVEC表达IL -8,随刺激时间延长IL -8水平逐渐升高 ,与0h相组比 ,100ng/mlLPS刺激后从2小时开始即有明显上升 (P<0.05) ,8h达到峰值 ,为5.86±0.68ng/ml(P<0.01)。与对照组比 ,1ng/mlLPS刺激6h即能显著诱导IL-8的表达(P<0.05) ,10ng/ml、100ng/ml的诱导作用非常显著(P<0.01) ,随着LPS浓度的增加而增加。LPS刺激后能明显地诱导IL -8mRNA的表达。100ng/mlLPS刺激后从1h开始即在胞浆中显示IL-8mRNA的强阳性表达 ,随作用时间延长 ,IL-8mRNA表达增加。至6h达到高峰 ,8hIL -8mRNA表达略有下降。同时显示IL -8mRN     

NF-κB通路对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞中CX3CL1表达的影响

目的观察NF-κB通路对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(RA-FLS)中CX3CL1表达的影响。方法用100μM NF-κB拮抗剂(PDTC)刺激体外培养的RA-FLS,用RT-PCR检测刺激不同时间后RA-FLS中CX3CL1 mRNA表达。结果 RA-FLS中表达CX3CL1;PDTC作用18h后,RA-FLS自身CX3CL1 mRNA表达量下降(P0.001)。结论 CX3CL1 mRNA的表达可能受到NF-κB通路的调节。     

BRAP对LPS诱导的人气道上皮细胞系黏液高分泌的影响

目的探讨蛙皮素受体激活蛋白(BRAP)对脂多糖(LPS)诱导的气道黏液高分泌的影响及相关作用机制。方法体外培养人气道上皮HBE16细胞,转染已构建好的p EGFP-N1-BRAP,以空质粒载体作为对照,给予LPS刺激,同时分别以ERK抑制剂U0126、JNK抑制剂SP600125、P38抑制剂SB203580干预。观察细胞内活性氧(ROS)含量、黏蛋白(MUC)5AC表达和核因子-κB(NF-κB)活性以及细胞活力的变化。结果转染p EGFP-N1-BRAP后ROS明显减少(P0.01);同单纯LPS刺激相比,MUC5AC蛋白含量和mRNA水平在转染p EGFP-N1-BRAP后明显降低(P0.01),NF-κB活性亦呈相同趋势(P0.05);在U0126组,MUC5AC的表达较转染重组质粒组显著降低(P0.01),NF-κB活性也显著下调(P0.05)。结论 BRAP可以通过ROS/ERK/MAPK信号通路阻止胞质内NF-κB的活化,从而下调MUC5AC的生成。