氯化镉处理人支气管上皮细胞某些翻译启动因子表达变化

目的 探讨镉恶性转化人支气管上皮细胞(16HBE)中各种翻译启动因子的表达变化.方法 利用非转化16HBE对照细胞和氯化镉(CdCl2)恶性转化16HBE成瘤细胞,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及荧光定量PCR(FQ-PCR)等方法,观察与分析CdCl2恶性转化16HBE细胞中翻译启动因子家族mRNA的表达变化情况.结果 以β-actin作为内参照,相对于对照细胞,在CdCl2转化16HBE成瘤细胞23个翻译启动因子的特异片段中,RT-PCR检测结果显示elF2a、elF2Cl、eIF4E因子的mRNA表达水平均有不同程度的升高,而eIF2β、eIF4EBP因子的mRNA表达量则有不同程度的下降;FQ-PCR结果证实,镉恶性转化成瘤细胞中,eIF2a、elF2Cl、eIF4E的表达水平相对于对照细胞分别升高22倍、21倍和325倍,而eIF2β、eIF4EBP因子的表达量分别是对照细胞的0.005倍和0.107倍.结论 研究结果提示,镉的致癌作用可能涉及到多个翻译因子的异常表达.     

硫化镍与苯并芘转化人支气管上皮细胞基因差异表达谱的研究

目的用cDNA微阵列技术探讨经硫化镍(NiS)与二羟环氧苯并芘(dihydroxyepoxy benzo pyrene,BPDE)转化后的人支气管上皮细胞(16HBE)基因的差异表达;以了解不同种类和性质的化合物在转化细胞及致癌分子机制方面的异同;为预防人类生存环境不同外来化合物对人类健康的危害和影响提供科学依据.方法取16HBE分为NiS处理组,BPDE处理组和16HBE(对照组)三组同步培养,传代至第35代;提取三种细胞的总RNA,逆转录合成cDNA并以Cy3-dCTP和Cy5-dCTP荧光素分别标记制作探针.探针混合后与含4000个人类基因的芯片杂交.以ScanArray 4000扫描仪扫描芯片,以GenPix Pro3.0软件分析荧光信号,对三组差异表达的基因进行生物学信息分析.结果 NiS转化的16HBE细胞与BPDE转化的16HBE细胞经分析比较,呈现差异表达的基因有22个,其中11个(50%)下调,另11个(50%)上调.结论 NiS与BPDE对16HBE细胞株的转化作用在抑癌基因,细胞周期蛋白相关基因,细胞凋亡和应激反应基因相关基因,DNA合成、修复和重组蛋白相关基因,DNA结合、转录和转录因子类基因,细胞受体相关基因,代谢相关基因,蛋白翻译和合成相关基因等多类基因上呈现差异表达.认为基因芯片技术在筛选不同种类和性质的化合物转化细胞相关基因的改变上,具有高通量、高敏感、快速等特点,对化合物在细胞、分子毒作用和致癌机制的研究中意义重大.     

氯化镉诱发16HBE细胞系恶性转化过程中TIF3 p36的变化

目的 探讨氯化镉诱发人支气管上皮细胞（16HBE）恶性转化过程中不同阶段蛋白翻译起始因子（TIF3）p36 mRNA表达水平的变化,为进一步阐明氯化镉的分子致癌机制提供线索.方法 应用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术,以及敏感先进的Taqman荧光定量PCR方法,检测并分析氯化镉诱发16HBE恶性转化不同阶段即转化期间细胞、转化细胞和成瘤细胞的TIF3 p36 mRNA表达量的变化.结果 相对于非转化对照细胞（16HBE）,氯化镉诱发恶性转化不同阶段细胞（转化期间细胞、转化细胞和成瘤细胞）的TIF3 p36 mRNA基因表达水平均明显升高（P＜0.01或P＜0.05）,其中低剂量组（5 μmol/L）所转化的各阶段细胞的eIF3 p36 mRNA平均表达量分别是对照细胞的3.1、5.9和9.9倍,中剂量组（10 μmol/L）的各阶段转化细胞的TIF3平均表达量分别是对照细胞的7.1、6.8和14.8倍,高剂量组（15 μmol/L）的各阶段转化细胞的TIF3 p36平均表达量分别是对照细胞的3.6、3.0和9.1倍.这些不同剂量组的研究结果提示,eIF3 p36的异常表达量与氯化镉诱发16HBE细胞恶变程度之间有正相关关系,但与镉的剂量无关.结论 氯化镉在诱发16HBE细胞恶变过程中,存在明显的蛋白翻译启动因子eIF3 p36异常表达现象,其表达水平与细胞的恶变程度密切相关,这可能是氯化镉诱发人细胞肿瘤的重要分子致癌机制之一.     

结晶型硫化镍对人支气管上皮细胞PTEN基因和miR-22表达的影响

目的分析结晶型硫化镍(NiS)诱导转化人支气管上皮细胞第35代(16HBE-T35)及其前期第18代细胞(16HBE-T18)PTEN基因及miR-22的表达水平,探讨PTEN基因与miR-22在化学致癌过程中的相互关系。方法以16HBE-T35和16HBE-T18细胞为实验组,蒸馏水处理组分别为其相应的对照细胞(16HBE-N35和16HBE-N18),用茎环结构逆转录引物实时定量RT-PCR检测4种细胞miR-22成熟体表达量。运用实时定量RT-PCR和蛋白质印迹法分别检测四种细胞PTEN mRNA和蛋白表达量。结果 16HBE-T18细胞和16HBE-T35细胞中miR-22的表达水平分别是16HBE-N18细胞的(0.27±0.09)倍和(3.50±0.31)倍。16HBE-T35细胞的PTEN蛋白表达水平是16HBE-N35细胞的(0.48±0.26)倍,但16HBE-T18细胞和16HBE-N18细胞之间PTEN蛋白表达水平无明显差异。结论在NiS诱导的恶性转化细胞16HBE-T35中,PTEN蛋白表达水平下降,而miR-22表达水平增高。恶性细胞中,miR-22可能在转录后影响PTEN蛋白的表达。     

扶正解毒含药血清对硫化镍诱导人支气管上皮细胞转化的保护作用

目的探讨硫化镍诱导人支气管上皮(16HBE)细胞恶性转化作用以及扶正解毒汤(FJD)的保护作用,研究硫化镍致癌的分子机制以及扶正解毒汤对防癌治癌的作用。方法用不同浓度的硫化镍在体外多次处理16HBE细胞,利用刀豆凝集素A(ConA)凝集实验和软琼脂集落形成实验进行转化细胞的恶性鉴定;测定16HBE细胞内镍离子和自由基含量,同时加入扶正解毒含药血清,观察其保护作用。结果硫化镍可诱导16HBE细胞的恶性转化,转化细胞的生长速度加快、排列紊乱、失去接触抑制、呈交叉重叠生长、转化率呈剂量—效应关系。转化细胞可被低浓度ConA凝集并在软琼脂内生长。硫化镍暴露组细胞内镍离子和自由基含量明显增加。中、高剂量的扶正解毒含药血清可通过细胞内、外途径发挥抗氧化、清除自由基效应。结论硫化镍有较强的诱导16HBE细胞恶性转化的能力,具有致癌性。FJD血清对于硫化镍诱导的16HBE细胞恶性转化具有保护作用。     

双向电泳分析结晶型NiS诱发人支气管上皮细胞恶变后的蛋白表达差异

[目的]建立双向凝胶电泳分析方法，比较结晶型NiS诱发入支气管上皮细胞恶变后的蛋白表达差异。[方法]采用一步法分别提取人支气管上皮细胞系16HBE细胞和结晶型NiS诱发该细胞系的恶性转化细胞N-2细胞的可溶性总蛋白，经双向凝胶电泳分离、银染显色、用双向电泳凝胶图像分析软件ImageMaster2D3．10分析两者之间可溶性蛋白的差异表达。[结果]获得了分辨率和重复性较好的双向电泳银染图谱。图像分析显示在恶性转化细胞中检测到19个新的蛋白点，同时有47个蛋白点消失，有140个蛋白点在两种细胞中表达量有显著差异，其中89个蛋白点在N-2细胞中表达升高，51个蛋白点在N-2细胞中表达降低。[结论]双向电泳技术分析NiS诱发细胞恶性转化后蛋白质组发生了变化，这将为镍致癌相关的蛋白的研究和鉴定奠定基础。     

硫化镍对支气管上皮细胞中磷酸化细胞外信号调节蛋白表达的影响

目的通过结晶硫化镍在支气管上皮细胞(16HBE)中磷酸化细胞外信号调节蛋白(P-ERK1)的表达,探讨镍致癌的分子机制。方法用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白免疫印迹杂交(W estern b lot)法检测16HBE细胞中P-ERK1的表达。结果硫化镍不能明显激活P-ERK1的表达,染镍组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论镍不能激活P-ERK1的表达,其机制尚不清楚,硫化镍有可能激活P38和JNK通路,从而直接或间接发挥致癌作用。     

镍转化人胚肺细胞中差异表达基因的克隆

目的 分析并克降镍转化细胞与对照组细胞中差异表达的基因,以期了解镍化合物诱发癌６变的分子机制。方法 应用差异显示ＰＣＲ方法分离对照和转化细胞间具有关 表达的基因,用ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ方法将差异基因片段克隆到质粒中,循环测序,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交分析。结果 从转化与对照细胞中分离并克隆到多个差异基因片段,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ分析表明其中２个为确定的差异表达基因（暂称之为ＭＳ５１５一ＩＣ８２）。测序后与     

结晶型硫化镍诱发细胞恶性转化相关蛋白硫氧还原蛋白过氧化物酶2的鉴定

目的利用蛋白质组学技术识别结晶型硫化镍（NiS）诱发人支气管上皮细胞恶性转化相关蛋白的差异表达，探讨镍致癌的分子机制。方法应用二维凝胶电泳与相应软件分析结晶型NiS诱发细胞恶性转化后蛋白质组变化，基质辅助激光解吸电离-飞行时间-质谱（MALDI-TOF-MS）结合数据库检索鉴定恶性转化相关蛋白。结果获得分辨率和重复性较好的二维凝胶电泳图谱，在相对分子质量14400～94000、等电点3～10范围内分离出约700个不同蛋白质点，对差异表达明显的等电点约6，相对分子质量约25000的蛋白质点进行质谱分析，鉴定出等电点为5．66，相对分子质量为21890的蛋白／硫氧还原蛋白过氧化物酶2（Peroxiredoxin 2，PDX2），并发现该蛋白在恶性转化细胞中高表达。结论蛋白PDX2可能是参与结晶型NiS诱发人支气管上皮细胞恶性转化过程的重要蛋白分子，与细胞恶性转化有关。     

化学致癌物转化细胞端锚聚合酶mRNA的表达

[目的]探讨3种化学致癌物诱发细胞恶变后tankyrasemRNA的表达。[方法]用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测正常细胞和恶性转化细胞tankyrasemRNA的表达。[结果]tankyrasemRNA在转化细胞中的表达高于正常细胞。[结论]3种化合物诱发的细胞恶性转化涉及了tankyrase活性改变,提示tankyrasemRNA高表达可能与化学致癌有关。     

致癌物诱导恶变细胞中线粒体高变区序列分析

目的检测苯并（a）芘代谢产物反式二羟环氧苯并芘（反式-BPDE）及结晶型硫化镍（NiS）诱发永生化人支气管上皮细胞系（16HBE）恶性转化过程中线粒体DNA控制区序列变化。探讨线粒体DNA控制区在环境致癌物苯并（a）芘及硫化镍致癌作用中是否存在靶分子序列。方法 应用银染PCR-单链构向多态性（SSCP）方法及测序方法分析恶变细胞中线粒体DNA高变区的序列变化。结果 经反式-BPDE和NiS诱导恶变的人支气管上皮细胞系线粒体高变区均未发现异常改变。结论 线粒体基因控制区可能并非是化学致癌物诱发肺癌的靶序列。     

Ras基因家族在二羟环氧苯并(a)芘恶性转化细胞中的表达研究

目的检测环境致癌物苯并(a)芘代谢物二羟环氧苯并芘(BPDE)对人支气管上皮细胞Ras基因家族表达的影响。方法以正常人支气管上皮细胞为对照组,经BPDE恶性转化人支气管上皮细胞为实验组,分别利用RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学方法,检测Ras基因家族在mRNA和蛋白水平表达变化。结果RT-PCR实验表明,BPDE恶性转化细胞H-Ras、K-Ras和N-Ras mRNA表达水平分别是正常细胞的2.237、1.254和3.616;Western blot实验显示,H-Ras、K-Ras和N-Ras蛋白表达量分别是正常细胞的1.273倍、1.547和1.600倍;免疫细胞化学实验表明,恶性转化细胞H、K和N-Ras蛋白表达明显强于正常细胞。结论BPDE诱发人支气管上皮细胞恶性转化存在H-Ras、K-Ras和N-Ras基因过表达。     

反义TIF3逆转镉转化BALB/c-3T3细胞的致癌性

为探讨反义TIF3能否逆转镉转化细胞的致癌性 ,用磷酸钙介导转染法和G418细胞筛选技术 ,建立CdCl2 转化BALB c 3T3细胞反义TIF3稳定表达系统 ,再用软琼脂检测和裸鼠致瘤试验对这些转基因细胞的致癌性逆转情况进行鉴定。结果显示CdCl2 转化BALB c 3T3细胞中反义TIF3表达可逆转这些细胞的转化表型 ,与非转染细胞和载体转染对照细胞比较 ,转染反义TIF3的镉转化细胞在软琼脂上所形成的锚非依赖性生长集落减少 2 5 %～ 70 %。转染反义TIF3基因的镉转化细胞可延迟裸鼠出现肿瘤的时间 ,而且这些肿瘤的大小显著变小 ,肿瘤重量平均下降 5 0 8%～ 5 5 1%。提示反义TIF3mRNA表达可逆转镉转化细胞的致癌性 ;应用反义TIF3阻断TIF3癌基因表达对镉诱发的肿瘤可能有治疗价值     

烟草甲基亚硝胺吡啶基丁酮诱发HPV-18永生化人类支气管上皮细胞恶性转化

观察了烟草特异亚硝胺ＮＮＫ诱发ＨＰＶ－１８永生化人类支气管上皮细胞（ＢＥＰ２Ｄ）恶性转化过程中细胞生物学特征的变化。５００ｍｇ／ＬＮＮＫ处理ＢＥＰ２Ｄ细胞一天后,细胞在体外可连续传代,第５代细胞显示抗血清生长;第１５代细胞在半固体琼脂中的集落形成率（０．０３８％））为对照细胞（０．００３３％）的１１倍;第２５代细胞在裸鼠体内成瘤,组织学证实为高分化鳞状细胞癌。以上结果表明ＮＮＫ致ＢＥＰ２Ｄ细胞恶性转化是一种多阶段的发展过程。该培养体系为深入研究人类支气管上皮细胞多阶段癌变的细胞和分子机制提供了一种理想的生物材料。     

二羟环氧苯并芘诱发细胞恶变后基因和蛋白表达差异分析

目的研究苯并(a)芘代谢产物反式二羟环氧苯并芘(反式-BPDE)诱发人支气管上皮细胞系(16HBE)恶性转化的基因和蛋白表达的改变,探讨苯并(a)芘致癌的分子机制.方法应用含4096条人类全长基因的cDNA芯片检测反式-BPDE诱发人支气管上皮细胞恶性转化的基因表达谱的变化;应用二维凝胶电泳技术和相应软件ImageMaster2D 3.10分析反式-BPDE诱发人支气管上皮细胞恶性转化的蛋白质组变化,基质辅助激光解吸电离-飞行时间-质谱结合数据库检索鉴定部分表达有差异的蛋白斑点.结果BPDE诱发的恶性转化细胞与阴性对照细胞比较,cDNA芯片结果显示差异表达基因有143条,其中52条基因在BPDE诱发的恶性转化细胞中表达增高,91条基因在恶性转化细胞中表达降低;二维凝胶电泳显示有72个蛋白斑点出现表达差异,其中44个蛋白斑点在BPDE诱发的恶性转化细胞中表达升高,28个蛋白斑点在恶性转化细胞中表达降低,对其中7个表达明显差异的蛋白斑点的鉴定显示,原癌基因v-erbb2同源3、锌指蛋白127、硫氧还原蛋白过氧化物酶2、KIAA0471蛋白在恶性转化细胞中高表达,而钙结合蛋白5、锌指蛋白Aiolos、Kelch样蛋白3在恶性转化细胞中低表达.结论反式-BPDE诱发16HBE恶性转化的基因表达谱和蛋白表达谱发生了显著的变化,这些表达改变的基因和蛋白可能参与了BPDE诱发细胞恶变的过程.     

烟草甲基亚硝胺吡啶基丁酮诱发HPV—18永生化人类支气管上皮细胞恶性 …

观察了烟草特异亚硝胺ＮＮＫ诱发ＨＰＶ－１８永生化人类支气管上皮细胞（ＢＥＰ２Ｄ）恶性转化过程中细胞生物学特征的变化。５００ｍｇ／ＬＮＮＫ处理２ＢＥＰ２Ｄ细胞一天后,细胞在体外可连续传代,第５代细胞显示抗血清生长;第１５代细胞在半固体琼脂中的集落形成率（０．０３８％）为对照细胞（０．００３３％）的１１倍;第２５代细胞在裸鼠体内瘤,组织学证实为高分化鳞状细胞瘤,以上结果表明ＮＮＫ致ＢＥＰ２Ｄ细胞恶性转     

苯并(a)芘代谢物反式二羟环氧苯并芘诱发人支气管上皮细胞恶性转化

以不同浓度的苯并 (a)芘代谢物反式二羟环氧苯并芘 (BPDE)多次处理人支气管上皮细胞 16HBE ,并观察转化细胞的恶性特征。发现BPDE可诱导 16HBE细胞恶性转化 ,形成转化灶。转化灶细胞失去接触抑制 ,排列紊乱 ,无方向性 ,交叉重叠生长。转化的细胞可在软琼脂上生长 ,各浓度处理组细胞集落形成率均显著高于对照组 ,有良好的剂量—反应关系。经BPDE处理的细胞在裸鼠体内成瘤 ,病理学诊断为鳞状细胞癌。本实验以反式BPDE成功地诱发了人支气管上皮细胞恶性转化 ,为后期进一步研究其致癌的分子机制、寻找致癌相关基因提供了理想的生物学材料。     

基因芯片筛选BPDE转化16HBE相关基因

目的 采用基因芯片技术筛选二羟环氧苯并芘（BPDE）转化的人支气管上皮细胞（16HBE）相关基因，探讨该技术在分子毒理学研究中的应用。方法 将实验组（BPDE-16HBE）和对照组（16HBE）的mRNA逆转录合成cDNA掺入荧光分子为探针，杂交于H40S基因芯片。分析2组基因的差异表达。结果 在4096种人类基因中。BPDE转化的16HBE和正常16HBE问存在差异表达的基因有143条，其中高表达52条，低表达41条。结论 基因芯片技术在筛选BPDE转化的16HBE相关基因改变上，具有高通量、高敏感、快速等特点，在毒物的分子致癌机制研究中意义萤大．