多重聚合酶链反应方法在结核杆菌检测中的应用

[目的]建立结核病诊断及快速检测方法。[方法]将结核杆菌标准菌株、临床病例标本、对照标本采用多重PCR体系进行检测，以研究多重PCR方法对上述菌株检测的敏感性和特异性。[结果]多重PCR体系检测结核杆菌DNA的灵敏性最低为30～210个结核杆菌，对结核病病例和对照标本检测的灵敏度为94．6％，特异度为100％。[结论]多重PCR技术用于结核分支杆菌的鉴定简便、快速、特异，适于在卫生检疫系统和临床实验室应用。     

多重聚合酶链反应检测流感嗜血杆菌

目的 建立检测流感嗜血杆菌的多重聚合酶链反应(M-PCR)方法 .方法 合成扩增流感嗜血杆菌编码P6外膜蛋白基因的引物(Hi),鉴定流感嗜血杆菌种特异性;合成扩增流感嗜血杆菌编码荚膜基因的引物(Hi-cap),鉴定菌株是否具有荚膜;设计并合成6对扩增流感嗜血杆菌不同血清型(荚膜型)编码摹因的引物(Hia-Hif),鉴定菌株的血清型,以其他呼吸道常见病原体菌株做对照,应用M-PCR方法 对200株临床分离的疑似流感嗜血杆菌菌株进行鉴定和血清分型.结果 M-PCR方法 检测流感嗜血杆菌具有高度的敏感性和特异性.对照菌株应用种(Hi)、荚膜(Hi-cap)和荚膜型(Hia-Hif)特异引物没有扩增出DNA片段.M-PCR方法 检测DNA的最低检测量为0.935 Pg.对临床分离的200株疑似流感嗜血杆菌鉴定,189株为流感嗜血杆菌,与API R NH鉴定结果 一致.其中1株具有荚膜,为f血清型,与玻片凝集法鉴定结果 一致.结论 M-PCR方法 检测流感嗜血杆菌具有较高的敏感性和特异性,可用于流感嗜血杆菌感染病例标本的快速检测和病例诊断.     

基于聚合酶链式反应的肠道病原菌检测技术

正肠道感染性疾病重要病原菌,如志贺菌和沙门菌等感染发病率高、传播速度快、耐药发生率也高~([1-2])。据文献报道,肝硬化~([3])、HIV感染~([4])、炎症性肠道病~([5])以及血糖调节~([6])等均与肠道菌群失调有关。此外,引起胃肠道感染的食源性致病菌是食品安全的严重隐患~([7]),可引起胃肠炎、败血症等疾病。因此,快速检测威胁人类健康的病原菌刻不容     

多重寡核苷酸连接-聚合酶链式反应-通用基因芯片检测食源性致病菌方法的建立

目的建立一种基于多重寡核苷酸连接-聚合酶链式反应(MOL-PCR)的食源性致病菌通用基因芯片检测方法。方法针对细菌性食物中毒8种常见致病菌,在各自特异性引物之间设计一对首尾相接的上、下游检测探针。采用多重PCR富集靶序列并作为模板,通过多重连接酶检测反应及通用不对称PCR标记,获得大量含标签互补序列(Anti-tag)的荧光标记单链产物,可与芯片上固定的标签序列(Tag)进行杂交检测。结果该方法能特异性地鉴别单一和多重目标菌感染。纯培养物的检测灵敏度为(1.1~8.5)×10~2CFU/mL。对96份食物中毒和临床腹泻样本检测,芯片结果与常规分离与生化鉴定及荧光定量PCR结果一致。结论该方法为快速、准确、灵敏、高通量地鉴定食源性疾病的病原菌提供了一种新型检测平台。     

靶序列富集多重聚合酶链式反应在儿童细菌性肺炎病原体检测中的应用

目的分析靶序列富集多重聚合酶链式反应(Tem-PCR)在儿童细菌性肺炎病原体检测中的价值,为临床诊治工作提供客观研究依据。方法选取2015年6月-2016年6月212例社区获得性肺炎(CAP)患儿作为研究对象,采集所有纳入患儿的呼吸道深部吸引物,分别对其进行细菌培养和Tem-PCR检测。结果有123例患儿的呼吸道分泌物标本细菌培养检出病原菌,检出率为58.0%,共检出病原菌127株,其中,革兰阴性菌和革兰阳性菌分别占76.4%和23.6%,主要病原菌为流感嗜血菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌,分别占20.5%、14.2%、12.6%;有85例患儿的呼吸道分泌物标本Tem-PCR检测呈阳性,阳性率为40.1%,共检出105株病原菌靶基因,其中,流感嗜血菌、肺炎链球菌、鲍氏不动杆菌的比例最高,分别占40.0%、38.1%、10.5%;Tem-PCR检测对流感嗜血菌、肺炎链球菌、鲍氏不动杆菌、金黄色葡萄球菌等的诊断特异度均较高,对肺炎链球菌、铜绿假单胞菌的诊断敏感度和Youden指数均较高。结论 Tem-PCR检测在儿童CAP特定病原菌的早期诊断中具有一定的应用价值,可作为细菌感染性CAP病原学诊断的辅助手段。     

逆转录聚合酶链式反应检测某些动物性产品中冠状病毒初探

对于引起人类严重急性呼吸综合征的冠状病毒 (SARS associatedcoronavirus) [1] 检验方法有免疫荧光法、ELISA法和分子生物学方法 ,这些方法全部针对临床标本。目前食品中检测的病毒种类仅限于甲肝病毒、轮状病毒、诺瓦克病毒、柯萨奇病毒等肠道病毒。由于环境样品不同于医学标本 ,样品中病毒数量极少 ,传统方法需要从大量样本中富集、分离病毒 ,再经过如组织培养等方法检测 ,这些方法因细胞病变不明显、重复性差、时间太长等均不适用。对环境样品中的RNA病毒的检测一般情况下先对样本中的病毒进行富集分离 ,然后用RT PCR方法检测[2 …     

重组酶聚合酶扩增技术在病原体快速检测中的应用

重组酶聚合酶扩增(RPA)技术是一种新型核酸等温扩增技术,适用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等多个领域.传染病是人类健康的主要威胁,本文综述了RPA技术在寄生虫、细菌、病毒等传染病病原体快速检测中的应用,并对RPA技术应用提出建议.     

巢式多重聚合酶链反应在腺病毒检测及分型中的应用

目的建立一种快速、敏感、特异的腺病毒检测及分型方法。方法根据编码腺病毒六邻体基因的核苷酸序列设计一对外引物（即通用引物），扩增产物为1278bp；再分别设计针对腺病毒六邻体基因3、7、11和21型特异性序列的4对内引物，扩增产物分别为502、311、880和237bp。应用多重巢式聚合酶链反应（nest—PCR）技术将这4对引物用于同一聚合酶链反应管中，根据扩增产物在琼脂糖凝胶电泳上的大小，即可鉴别所测毒株的型别。结果3、7、11和21型腺病毒标准株和分离株分别产生预期的特异性扩增片段，与其他常见的呼吸道病毒等无交叉反应。118份经病毒分离和／或间接免疫荧光法确定为腺病毒阳性的急性呼吸道感染患儿临床标本中，腺病毒3型占64．4％（76／118），7型占31．4％（37／118），11型占2．5％（3／118），未检测到21型；2份病毒分离和间接免疫荧光均为腺病毒阳性的标本中，用该方法未能鉴定出型别，可能是3、7、11、21型以外的腺病毒，占1．7％（2／118）。33份经病毒分离和／或间接免疫荧光法均未检测到腺病毒的标本中，有3份为PCR阳性（包括1份7型，2份3型）。结论该方法鉴别3、7、11、21型腺病毒具有快速、简便、特异等特点，适用于腺病毒型别鉴定，可以为急性呼吸道感染的临床或群体公共卫生事件提供病原学诊断依据。     

连续性血液净化在治疗重症脓毒血症中的应用

目的：探讨连续性血液净化（CBP）治疗重症脓毒血症患者的疗效。方法：对30例重症脓毒血症患者,在CBP治疗前、治疗期间及治疗结束后分别监测患者血流动力学参数、呼吸机参数及急性生理和慢性健康状况评分（APACHEⅡ）,测定动脉血气、肾功能、电解质,记录多巴胺用量及呼吸机参数。结果：所有治疗均进行顺利,经过CBP治疗,患者血流动力学较治疗前改善;氧合指数（PaO2／FiO2）、动脉氧分压（PaO2）均升高、吸入氧浓度（FiO2）下调,与治疗前比较差异有统计学意义（P〈0．05）;平均动脉压（MBP）升高,多巴胺的需要量明显减少（P〈0．05）;APACHEII评分、肌酐、尿素氮、血钾水平较治疗前明显降低（P〈0．05）。结论：CBP能改善重症脓毒血症患者的血流动力学状况及肺氧合功能,维持内环境稳定,是一种可行、有益的辅助治疗重症脓毒血症的方法。     

聚合酶链式反应对食物中肉毒的检测

目的用PCR方法鉴定肉毒食物中毒的病原菌。方法用1对人工合成的寡核苷酸引物护增A、B、E、F和G型肉毒神经毒素基因的一段264bp的DNA片段，并对2个食物中毒样品的增菌产毒培养液及分离的菌株进行检测。结果从食物中毒样品中检测出肉毒梭菌。结论PCR方法能快速、准确的鉴定肉毒食物中毒样品中的病原菌。     

重症监护病房脓毒症患者病原菌的流行病学特征

目的了解重症监护病房中脓毒症患者常见的病原菌种类、分布及耐药情况,为脓毒症患者抗菌药物合理应用提供参考依据。方法回顾性收集2015年1月—2016年6月入住某院重症监护病房的脓毒症患者的临床资料、送检培养标本的病原菌检出及药敏试验结果,对资料进行分析。结果共选取175例脓毒症患者,检出241株病原菌,129株多重耐药菌;其中革兰阴性菌139株(57.68%)、革兰阳性菌68株(28.22%),真菌29株(12.03%);分离率居前5位的病原菌分别为大肠埃希菌(20.75%),肺炎克雷伯菌(14.11%),鲍曼不动杆菌(13.28%),白假丝酵母菌(12.03%),铜绿假单胞菌(9.54%)。检出率居前5位的多重耐药菌分别为鲍曼不动杆菌(29/32,90.63%)、屎肠球菌(16/20,80.00%)、肺炎克雷伯菌(24/34,70.59%)、葡萄球菌属(14/21,66.67%)、铜绿假单胞菌(14/23,60.87%)。大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)菌株分离率分别为68.00%(34/50)和17.65%(6/34),大肠埃希菌对碳青霉烯类及β-内酰胺酶抑制剂耐药率低,肺炎克雷伯菌仅对替加环素敏感;鲍曼不动杆菌对抗菌药物呈普遍耐药,铜绿假单胞菌仅对多粘菌素敏感;肠球菌及葡萄球菌对糖肽类、利奈唑胺及替加环素敏感;白假丝酵母菌对抗真菌药物普遍敏感。结论该院重症监护病房脓毒症患者所分离的病原菌耐药率高,尤以鲍曼不动杆菌显著,酶抑制剂类、碳青霉烯类和糖肽类抗菌药物仍然是经验性抗感染治疗的有效药物。     

多重聚合酶链反应系统用于儿童常见细菌及真菌血流感染的价值研究

目的探讨多重聚合酶链反应系统用于儿童常见细菌及真菌血流感染的价值。方法选取2014年1月-2016年1月医院住院疑诊血流感染患儿135例,采集患儿的血标本,分别采用血培养法、16SrDNA-PCR和多重聚合酶链反应系统进行检测,对比3种方法检测儿童血流感染的阳性率。结果血培养法检测阳性标本12份,阳性率为8.89%,16SrDNA-PCR检测阳性标本26份,阳性率为19.26%,多重聚合酶链反应系统检测阳性标本24份,阳性率为17.78%;16SrDNA-PCR和多重聚合酶链反应系统的阳性率均显著高于血培养法(P<0.05);16SrDNA-PCR和多重聚合酶链反应系统阳性率比较,差异无统计学意义。结论多重聚合酶链反应系统具有操作简单、检测时间短等优势,可在较短时间内鉴定儿童血流感染的常见病原菌,对临床诊疗有较好的指导意义。     

单管多重PCR技术快速检测五种性传播疾病的病原体研究

目的 建立一种能同时检测淋球菌(NG)、人型支原体(MH)、生殖支原体(MG)、沙眼衣原体(CT)、解脲支原体(UU)5种病原体的单管多重PCR方法 .方法 以荧光定量PCR技术加另一种检测技术作为金标准,对单管多重PCR技术检测五种性传播疾病(STD)病原体的敏感性、特异性、准确性和重复性进行了评价.结果 该法的敏感性、特异性和符合率分别为10-9fg/μl、100%、97.8%,20份临床标本连续5 d的重复性好.结论 单管多重PCR技术为检测STD提供了一种新的方法 .     

四种食源性致病菌多重PCR检测方法的建立

目的建立一种多重PCR检测方法同时检测食品中沙门菌、志贺菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌。方法参考沙门菌侵袭蛋白A(invA)基因序列,志贺菌侵袭性质粒抗原(ipaH)基因序列,金黄色葡萄球菌引物设计参考耐热核酸酶(nuc)基因序列,单增李斯特菌引物设计参考溶血素蛋白(hly)基因序列设计引物,通过多重PCR对4种食源性致病菌的目的基因进行扩增,并对反应体系进行优化。结果对15株目标菌和17株非目标菌的检测未出现假阳性和假阴性结果,产物分子量与预期一致;4种菌的检测灵敏度分别至少达到10pg/μl;对产物的测序分析表明所得序列与目的基因序列吻合;对319份样品的检测结果显示,其中4份生鲜乳中检出金黄色葡萄球菌,1份生猪肉中检出沙门菌。结论该方法具有良好的检测特异性,可供食源性致病菌的快速检测。     

聚合酶链反应检测成人牙周病患者病原菌的诊断价值

目的 探讨聚合酶链反应(PCR)检测牙周病患者主要牙周病病原菌的诊断价值.方法 根据细菌16S rRNA设计8种主要牙周病病原菌聚合酶链反应引物,采用聚合酶链反应技术检测65例牙周病患者的主要牙周病病原菌.结果 65例牙周病患者牙周袋分泌物中检出7种牙周病病原菌,包括伴放线杆菌44株,阳性率67.7％,福赛斯拟杆菌31株,阳性率47.7％,直肠弯曲菌52株,阳性率80.0％,巨核梭杆菌61株,阳性率93.8％,啮蚀艾肯氏菌48株,阳性率73.8％,牙龈卟啉单胞菌58株,阳性率89.2％,中间普氏菌54株,阳性率83.1％,未检出齿垢密螺旋体.结论 聚合酶链反应检测牙周病患者主要牙周病病原菌具有简便、快速的特点,对牙周病病原学诊断有重要意义.     

恶性肿瘤化疗患者败血症病原菌分布与药敏分析

目的调查恶性肿瘤化疗患者败血症的病原菌谱及其耐药性,为临床治疗提供参考依据。方法回顾性分析医院2009年1月-2012年12月203例恶性肿瘤患者化疗后发生败血症的临床资料,将其中96例发生粒细胞缺乏患者为A组,107例未发生粒细胞缺乏患者为B组,比较两组病原菌分布及耐药性。结果 203例化疗并发败血症患者共培养出病原菌210株,革兰阴性杆菌146株占69.5%,以大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌及铜绿假单胞菌为主,分别占29.0%、17.1%及7.1%;革兰阳性球菌63株占30.0%,主要为凝固酶阴性葡萄球菌、肠球菌属和金黄色葡萄球菌,分别占10.0%、7.6%和5.2%;革兰阴性杆菌对亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、阿米卡星及左氧氟沙星较敏感,对其他抗菌药物耐药率较高;革兰阳性球菌对万古霉素、替考拉宁及利奈唑胺均敏感,对其余抗菌药物均有不同程度耐药;A组检出的病原菌对抗菌药物耐药率普遍高于B组。结论恶性肿瘤化疗患者败血症病原菌感染以革兰阴性杆菌为主,感染患者的病原菌耐药严重,临床应根据药敏结果选择合适的抗菌药物。     

社区获得性肺炎病原体检测方法研究进展

社区获得性肺炎（CAP）是常见的呼吸道感染性疾病,目前对CAP病原体的检测仍是难点。早期确诊CAP病原体,明确病因,进而早期进行有效治疗,对预后至关重要。采取灵敏有效的检测方法是病原学诊断的关键。本文对CAP病原体检测方法的研究进展进行综述     

多重荧光定量PCR检测鼠感染3种病原体的方法

目的 建立多重荧光定量PCR快速检测以鼠为宿主伯氏疏螺旋体、弓形虫和恶性疟原虫的方法,对预防3种病原体引发的疫情具有重要意义.方法 通过设计特异性引物和探针,扩增伯氏疏螺旋体23S rRNA基因,弓形虫的B1基因和恶性疟原虫的SSU基因,采用倍比梯度稀释法检测该体系的灵敏度,以另外8种以鼠为宿主的致病菌评价检测体系的特异性;建立了同时感染3种病原体的鼠全血模拟样本检测试验,以验证方法的适用性.结果 建立自鼠血液模拟样本中同时检测伯氏疏螺旋体、弓形虫和恶性疟原虫的多重荧光定量PCR方法,检测3种病原体的灵敏度分别为5.5、12.8、17.2拷贝/μl,特异性强.结论 建立了多重荧光定量PCR检测伯氏疏螺旋体、弓形虫和恶性疟原虫方法,缩短了检测时间,在疾病防控等方面有很好的应用前景.     

多重聚合酶链反应方法检测艰难梭菌毒素基因研究

目的探讨同时检测艰难梭菌毒素A、B基因和二元毒素基因的多重聚合酶链反应(PCR)方法。方法收集2014年1-9月医院120例住院腹泻患者的粪便标本,用艰难梭菌选择性培养基CCFA分离培养艰难梭菌;采用法国生物梅里埃公司厌氧菌鉴定试剂盒鉴定;采用酶免夹心与终点荧光检测相结合技术(ELFA),检测艰难梭菌毒素A、B基因,并分析其毒素特征;将艰难梭菌纯培养出的菌落用多重PCR方法测定艰难梭菌的毒素A、B基因和二元毒素基因。结果 120例腹泻患者送检粪便标本中,分离培养出19株艰难梭菌,艰难梭菌分离率达15.8%;应用免疫学方法检测毒素检出率为52.63%;用多重PCR方法艰难梭菌A、B毒素基因检出率为94.7%;15例患者送检粪便标本检测艰难梭菌A、B毒素阳性中,10株分离培养并鉴定出艰难梭菌;105例患者送检粪便标本检测艰难梭菌A、B毒素阴性中,有9例分离培养并鉴定出艰难梭菌。结论利用多重PCR检测艰难梭菌毒素A、B基因和二元毒素基因,较传统的免疫学方法敏感性高,能够准确地区分艰难梭菌毒素基因的类型,多重PCR是一种快速、特异的一步筛选艰难梭菌毒素基因的方法。