实时定量RT-PCR检测TCRVγ亚家族基因表达水平

目的:建立SYBR Green Ⅰ实时定鼍检测TCR Vγ亚家族T细胞表达水平的比较Ct法.方法:利用倍比稀释的成人正常胸腺组织cDNA建立TCR VγⅠ-VγⅢ和B2微球蛋白基因(β2M)基因的相对标准曲线,实验证实靶基因(VγⅠ-VγⅢ)分别和看家基因(B2M)的扩增效率一致,可采用比较Ct法对TCR Vγy Ⅰ～VγⅢ的表达进行相对定量,并运用该方法检测20例健康成人外周血TCR VγⅠ～VγⅢ的表达水平.结果:成人外周血 TCR VγⅡ的表达茸最高,TCR VγⅠ次之,TCRVγⅢ的表达量最低,三者比较有统计学意义(P<0.05).结论:本研究率先建立了利用sYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测人TCR Vγ基因mRNA表达水平比较Ct法,并在国内首先提供了健康成人外周血TCR Vγ基因各亚家族mRNA表达水平的资料.     

职业苯接触后外周血中T细胞FcεRIγ基因表达下调

目的:了解职业苯接触及慢性苯中毒工人外周血中T细胞受体信号传导通路FcεRIγ基因的表达情况。方法:利用实时荧光定量PCR法分别检测22例职业苯接触工人、12例慢性苯中毒工人及9例正常人外周血单个核细胞(PBMC)中FcεRIγ基因表达情况。结果:正常人、职业苯接触及慢性苯中毒工人FcεRIγ基因表达水平的中位数分别为37.50%、12.65%、7.41%,职业苯接触及慢性苯中毒工人FcεRIγ基因表达与正常成人相比均显著下降(P<0.05);尽管慢性苯中毒工人外周血中FcεRIγ基因表达水平降低程度较职业苯接触更为明显,但二者之间无统计学意义(P>0.05)。结论:职业苯接触及慢性苯中毒工人外周血中T细胞FcεRIγ基因表达水平均下调,这种表达异常可能与接触苯后机体细胞免疫功能障碍有关。     

接触苯及苯中毒工人外周血T细胞中CD3ζ基因的表达与分析

目的了解接触苯及苯中毒工人外周血中T细胞信号传导分子CD3ζ基因表达水平。方法利用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR分别检测28例苯接触工人、45例苯中毒工人和30例正常人外周血单个核细胞的CD3ζ基因表达情况,以β2微球蛋白基因(β2m)作为内参,根据相对定量公式(2-△△Ct)计算苯接触、苯中毒工人与正常人CD3ζ基因表达差异倍数。结果根据相对定量公式(2-△△Ct)分析显示苯接触工人外周血CD3ζ基因表达存在3种情况不表达2例(7%)、表达上升18例(64%)和表达下降8例(29%),与正常人CD3ζ基因相比表达上升和下降的倍数分别是19.68±25.24和0.67±0.32。苯中毒工人外周血CD3ζ基因表达情况表达上升31(69%)和表达下降14例(31%),与正常人CD3ζ基因相比表达上升和下降的倍数分别是31.50±29.18和0.52±0.25。与苯接触相比,45例苯中毒工人中18例(40%)CD3ζ基因表达上升,27例(60%)CD3ζ基因表达下降,上升和下降的倍数分别是12.04±4.35和0.29±0.23。结论首次报道接触苯及苯中毒工人中CD3ζ基因表达水平的变化,接触苯及苯中毒工人CD3ζ基因表达低下可能与细胞免疫功能缺陷有一定关系。     

职业铅接触工人外周血T细胞Vβ基因谱系明显缺失

目的:分析职业铅接触工人外周血中T细胞受体Vβ基因(TCR Vβ)谱系分布和克隆性特点,进一步了解铅接触后对T细胞免疫的影响.方法:利用RT-PCR分别检测6例职业铅接触工人和6例健康体检者的外周血中各TCR Vβ亚家族的表达情况;阳性产物经荧光素标记和基因扫描分析其CDR3长度以了解T细胞克隆性.结果:所有健康体检者均可检测到24个Vβ亚家族并呈多克隆,而6例职业铅接触工人外周血TCR Vβ亚家族表现明显的限制性利用,仅能检测到1～7个,并且多数所检测到的Vβ亚家族T细胞呈现为寡克隆或双克隆增殖,发生克隆性改变的亚家族主要集中在Vβ1和Vβ16.结论:职业铅接触可能在不同程度上影响机体TCR Vβ谱系的利用和克隆性改变,可能与铅的免疫毒性有关.     

职业铅接触工人外周血T细胞Vβ基因谱系明显缺失

目的:分析职业铅接触工人外周血中T细胞受体Vβ基因(TCR Vβ)谱系分布和克隆性特点,进一步了解铅接触后对T细胞免疫的影响。方法:利用RT-PCR分别检测6例职业铅接触工人和6例健康体检者的外周血中各TCR Vβ亚家族的表达情况;阳性产物经荧光素标记和基因扫描分析其CDR3长度以了解T细胞克隆性。结果:所有健康体检者均可检测到24个Vβ亚家族并呈多克隆,而6例职业铅接触工人外周血TCR Vβ亚家族表现明显的限制性利用,仅能检测到1～7个,并且多数所检测到的Vβ亚家族T细胞呈现为寡克隆或双克隆增殖,发生克隆性改变的亚家族主要集中在Vβ1和Vβ16。结论:职业铅接触可能在不同程度上影响机体TCR Vβ谱系的利用和克隆性改变,可能与铅的免疫毒性有关。     

TCRVβ7.1基因修饰T细胞对乳腺癌细胞杀伤作用的研究

目的：观察TCPVβ7．1基因转染前后正常人外周血淋巴细胞对乳腺癌细胞株杀伤活性的影响。方法：脂质体包裹PdWA3.1vβ7.1后转染健康人PBMC，流式细胞仪检测PdWA3.1Vβ7.1基因表达，改良MIT法检测TCRVβ7．1基因转染前后正常人外周血淋巴细胞对乳腺癌细胞株杀伤活性。结果：TCRVβ7．1基因转染可显著增加正常人PBMC该基因表达，转染前后正常人外周血淋巴细胞对乳腺癌细胞株杀伤活性有显著性差异。结论：用TCR基因修饰可明显提高正常人PBMC对乳腺癌细胞杀伤作用。     

慢性粒细胞白血病病人TCRζ链表达特点

目的:建立实时定量PCR方法检测TCRζ链表达水平的方法,了解慢性粒细胞白血病(CML)外周血TCRζ链表达水平.方法:采用SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR,相对定量检测30例CML患者和30例正常人外周血的单个核细胞的TCRζ链表达情况,以β2微球蛋白基因(β2M)作为内参,根据相对定量公式:2-ΔΔCt计算CML病人与正常人TCRζ链表达差异倍数.结果:成功建立SYBR Green荧光实时定量PCR检测TCRζ链表达检测技术.18例CML患者TCRζ链出现表达低于正常人,而12例CML患者TCRζ链出现表达高于正常人.结论:CML病人中TCRζ链表达水平可分为表达下调(60%)和表达上调(40%)2组,提示部分CML病人的细胞免疫缺陷可能与其TCRζ链表达下调有关.     

脐带血和成人外周血TCR Vγ和Vδ亚家族的分布和克隆性研究

目的探讨脐带血和健康成人外周血TCR Vγ和Vδ基因谱系的分布情况及克隆性特点。方法利用RT-PCR法检测16例脐带血和10例健康成人外周血单个核细胞TCRVγ(Ⅰ～Ⅲ)和Vδ(1～8)各亚家族的表达,了解各亚家族的分布和利用情况;阳性的PCR产物进一步经荧光素标记和基因扫描分析其CDR3长度,了解T细胞的克隆性。2例成人胸腺组织作为对照。结果脐带血T细胞的Vγ基因表达主要集中在VγⅠ和VγⅡ,而Vδ基因则平均表达(4.63±1.03)个亚家族,主要集中在Vδ1、2、3、8中表达。健康成人外周血T细胞除了1例不表达VγⅢ之外,其余均表达全部Vγ基因,而在Vδ基因中则平均表达(3.6±0.52)个亚家族,并以Vδ1、2和3为多见,Vδ4和Vδ5未能在外周血中检测到,而Vδ5和Vδ8的表达则明显低于脐带血(P=0.009,P=0.001);2例成人胸腺组织表达除Vδ4和Vδ6之外的其他Vγ和Vδ亚家族。基因扫描显示16例脐带血中有1例在VγⅠ和5例分别在Vδ2、Vδ4和Vδ6中出现寡克隆性,10例成人外周血中有9例在不同亚家族中出现克隆性T细胞,其余均呈多克隆性。结论脐带血TCRVγ和Vδ亚家族T细胞和健康成人外...     

TCRζ缺陷的急性髓细胞白血病病人T细胞中Elf-1、Zap-70和FcεR Iγ基因的表达特点

目的了解TCRζ缺陷的急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia,AML)病人外周血T细胞中Elf-1、Zap-70和FcεR Iγ基因的表达特点。方法采用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR和相对定量分析法检测10例TCRζ缺陷的AML病人外周血CD3+T细胞中Zap-70、Elf-1和FcεR Iγ基因的表达情况。以β2微球蛋白基因(β2M)作为内参,10例健康成人作为对照;采用相对定量公式:2-△Ct×100%,计算Zap-70、Elf-1和FcεR Iγ基因的表达水平。结果 TCRζ缺陷的AML病人外周血T细胞中Elf-1基因的表达水平(中位数8.526%)明显低于健康对照组(中位数33.237%)(P<0.001),而FcεR Iγ基因的表达水平(中位数2.571%)则高于健康对照组(中位数0.958%)(P=0.019),Zap-70基因在两组中的表达水平没有显著性差异,但均与TCRζ基因的表达水平呈正相关。结论 TCRζ缺陷的AML病人T细胞中Elf-1基因的低表达可能是导致AML病人TCRζ基因缺陷性表达的原因之一,而FcεR Iγ基因的高表达则可能是在一定程度上缓解了TCRζ基因缺陷性表达所带来的T细胞免疫异常。     

MDS患者外周血中TCR Vβ1-24-Dβ1 sjTRECs的分析

目的检测骨髓增生异常综合征（MDS）患者外周血中TCRVβ1-24-Dβ1 sjTRECs的存在情况。方法利用半巢式PCR扩增9例MDS患者外周血单个核细胞DNA中TCRβ链基因重排时形成的T细胞受体DNA删除环（Vβ1-24-Dβ1 sjTRECs）,10例正常人外周血作为对照。结果所有TCRVβ1-24-Dβ1sjTRECs在正常人组外周血T细胞DNA中均有检出,除TCR Vβ12-Dβ1sjTRECs和TCRβ19-Dβ1sjTRECs外,其余TCRVβ-Dβ1 sjTRECs在MDS患者外周血T细胞DNA中均可检。大多数TCRVβ1-24-Dβ1sjTRECs在正常人组中的检出率较MDS患者高,但其中只有6种TCRVβ-Dβ1sjTRECs（分别是TCRVβ3、12、13、15、21、22-Dβ1sjTRECs）的检出率差异有统计学意义。结论本研究率先提供了MDS患者外周血T细胞中TCRVβ-Dβ1sjTRECs的存在情况。MDS患者TCRVβ-Dβ1sjTRECs出现频率低于正常人提示其胸腺近期输出功能存在部分缺陷情况。     

慢性粒细胞白血病病人TCRζ链表达特点

目的： 建立实时定量PCR方法检测TCRζ链表达水平的方法，了解慢性粒细胞白血病（CML）外周血TCRζ链表达水平。方法: 采用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR，相对定量检测30例CML患者和30例正常人外周血的单个核细胞的TCRζ链表达情况，以β2微球蛋白基因（β2M）作为内参，根据相对定量公式：2-△△Ct计算CML病人与正常人TCRζ链表达差异倍数。结果: 成功建立SYBR GreenⅠ荧光实时定量PCR检测TCRζ链表达检测技术。18例CML患者TCRζ链出现表达低于正常人，而12例CML患者TCRζ链出现表达高于正常人。结论: CML病人中TCRζ链表达水平可分为表达下调（60%）和表达上调(40%)2组，提示部分CML病人的细胞免疫缺陷可能与其TCRζ链表达下调有关。     

白血病异基因造血干细胞移植后TCR Vβ亚家族基因谱的研究

目的：了解白血病病人异基因外周血干细胞移植后1年以上患者TCR VβT细胞免疫功能重建的情况，方法，采用RT－PCR扩增5例CML和1例AML－M3a移植后（12－56个月）患者外周血的单个核细胞的TCR Vβ24个亚家族基因，分析其TCR Vβ亚家族的表达。结果：经24个Vβ引物所分别进行的RT－PCR检测TCRVβ各亚家族基因的表达情况，发现6例病人外周血与正常人表达24个Vβ亚家族有明显的不同，病人的部分Vβ亚家族T细胞仍款能重建，仅表达5－22个亚家族基因。结论：移植后1年以上患者尽管CD3＋T细胞已恢复，但外周血TCR Vβ亚家族基因谱的表达仍不完全，T细胞免疫功能仍未完全重建。     

原发性血小板减少性紫癜患者T细胞受体Vβ亚家族基因的表达特点

目的：了解原发性血小板减少性紫癜（ITP）患者T细胞受体 Vβ亚家族基因表达特点。 方法： 采用反转录酶－多聚酶链反应（RT-PCR）方法检测5例ITP患者外周血T细胞TCR Vβ 24个亚家族基因表达情况，10例正常人作为对照。 结果： 正常人外周血T细胞表达全部24个TCR Vβ亚家族，而5例ITP患者外周血T细胞仅表达4-11个Vβ亚家族，主要为Vβ2（100％）和Vβ3（100％），其次为Vβ19（80％）和Vβ21（80％）部分。全部样本未检测出Vβ4、Vβ6、Vβ17、Vβ20、Vβ24亚家族表达。 结论： ITP患者外周血T细胞TCR Vβ基因谱系呈限制性表达，与其存在细胞免疫功能异常有关。     

TCRVβ7.1基因转染对肝癌细胞刺激的外周血单个核细胞ERK信号通路和IFN-γ表达的影响

目的： 研究肝癌特异性识别基因TCRVβ7.1表达重组体转染外周血单个核细胞(PBMCs)后对T细胞细胞因子表达的影响和信号通路的激活作用。方法: 以肝癌特异性T细胞受体Vβ7.1转染PBMCs,流式细胞仪检测TCRVβ7.1表达量;Western blotting检测ERK1/2表达量及磷酸化水平（p-ERK）的改变;用ELISA法检测白细胞介素-4（IL-4）、γ-干扰素（IFN-γ）的表达量。结果: TCRVβ7.1基因转染健康人PBMCs并得到有效表达,转染TCRVβ7.1基因的PBMCs 与肝癌细胞共培养后ERK蛋白磷酸化水平明显高于未转染组(P<0.01)。p-ERK1/2水平与T细胞激活有关。ELISA结果表明,转染PBMCs细胞与肝癌细胞共培养后,IFN-γ水平明显高于未转染组,而IL-4无明显改变。结论: TCRVβ7.1转染PBMCs与肝癌细胞共培养后,ERK信号通路被激活,IFN-γ表达增高。     

T-ALL患者外周血TCRγ/δ T细胞的分布和增殖特点

目的:了解T细胞急性淋巴白血病(T-cell acute lymphocytic leukemia,T-ALL)患者外周血TCR Vγ和Vδ亚家族T细胞的分布和克隆情况。方法:利用RT-PCR扩增9例T-ALL患者和10例正常人外周血单个核细胞中3个TCR Vγ和8个Vδ亚家族基因的互补决定区3(CDR3),了解TCR亚家族Vγ和Vδ亚家族细胞的分布;阳性产物进一步经基因扫描分析CDR3长度,从而了解其克隆性。结果:9例T-ALL患者3个Vγ亚家族的表达率都明显低于正常人Vγ亚家族的表达率(P<0.05);Vδ亚家族中只有Vδ1和Vδ3的表达率低于正常人(P<0.05)。3例T-ALL患者出现克隆性增殖的γ/δT淋巴细胞。结论:T-ALL患者外周血TCR Vγ和部分Vδ亚家族谱系出现限制性表达和克隆性增殖。同时存在克隆性增殖γδ T细胞提示可能为γδ 白血病性T细胞克隆。     

弥漫大B细胞淋巴瘤相关抗原特异TCR基因修饰T细胞TCRζ链基因的表达

目的:分析DLBCL相关抗原特异TCR基因修饰T细胞经肿瘤细胞刺激活化前后TCRζ链基因表达水平的变化.方法:利用SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR,相对定量检测TCR基因修饰T细胞活化前后TCRζ链基因的表达情况,β2微球蛋白基因(β2M)为内参照,根据相对定量公式:2-ΔCt ×100%和2-ΔΔCt,计算TCR基因修饰T细胞活化前后TCRζ链基因的相对表达水平及其差异情况.结果:与未转染T细胞的TCRζ基因mRNA表达量(1.74±0.28)%相比,TCR转基因修饰T细胞TCRζ基因mRNA的表达水平没有发生明显的变化,表达量为(1.78±0.22)%;而经效/靶细胞(TCR基因修饰T细胞/Toledo细胞)混合培养后,活化的TCR基因修饰T细胞的TCRζ基因mRNA表达水平为(11.54±1.98)%,明显高于未刺激培养之前的TCR基因修饰T细胞和未转染T细胞的TCRζ基因的表达水平(P＜0.05),分别增长了(6.59 ±0.80)倍和(6.48±0.36)倍.结论:TCR转基因修饰T细胞受到抗原的刺激而活化,TCRζ链基因的表达相应增加.     

AML-M5患者外周血naive T细胞水平和TCR Vβ谱系利用特点

目的　了解急性髓性白血病M5亚型 (AML -M5 )患者T细胞受体重排删除DNA环 (TRECs)的含量和TCRVβ基因谱系利用和克隆性 ,从而了解AML患者的胸腺近期输出功能和TCRVβ亚家族T细胞增殖特点 .方法　利用实时定量PCR(TaqMan)方法检测 5例M5患者外周血单个核细胞TRECs的水平 ,并根据外周血中CD3阳性率计算CD3细胞中TRECs水平 .利用RT -PCR和基因扫描分析患者外周血单个核细胞的TCRVβ2 4个亚家族基因表达和克隆性 .9例正常人外周血作为对照 .结果　M5患者外周血中TRECs含量为 0 .76± 1.2 1/ 10 0 0CD3 细胞 ,明显低于正常人TRECs水平 (6 .84± 4 .71/ 10 0 0CD3 细胞 ,p <0 .0 5 ) .5例患者外周血T细胞表达不同数量Vβ亚家族 (2 - 16个 ) .基因扫描分析显示 4例病人外周血中的一些Vβ亚家族出现克隆性T细胞 ,Vβ1,Vβ15和Vβ2 1克隆性T细胞均分别见于 3例病人中 .结论　率先报道了AML -M5型患者胸腺近期输出naiveT细胞功能明显降低 ,尽管整体T细胞免疫功能低下 ,患者仍存在优势利用和克隆性增殖Vβ亚家族T细胞 ,提示其具有一定地对白血病细胞相关抗原产生特异性免疫反应的能力     

vMIP-Ⅱ对SIV感染的食蟹猴TCRVβ基因表达的影响

目的检测感染SIV初期用病毒巨噬细胞炎症蛋白-Ⅱ（vMIP—Ⅱ）治疗的食蟹猴外周血T细胞TCRVβ优势表达,分析特异性Vβ亚家族表达水平的变化及T细胞克隆性质的改变。方法11只食蟹猴感染前后外周血PBMC样本共22例通过半定量RT-PCR技术分析其中14个TCRVβ亚家族T细胞的表达情况,运用基因扫描技术分析用药组与感染组差异表达的T细胞TCRVβ亚家族基因中CDR3的长度了解其克隆性。结果与感染前正常食蟹猴外周血T细胞的14个TCRVβ亚家族中表达（除去表达量极低的10个亚家族）相比较,感染后SIV组中部分样品Vβ7、8、14、16的表达量与感染前比较有上升趋势;vMIP-Ⅱ组中TCRVβ亚家族的表达量上升更加明显。基因扫描结果显示感染前、后标本中Vβ7亚家族的表达由多克隆向寡克隆变化的趋势。结论体内实验研究表明,SIV感染初期的食蟹猴体内部分TCRVβ亚家族有特异性的增生,且克隆性发生改变。vMIP—Ⅱ对此种Vβ亚家族的表达的增生有促进的作用,推测其促使特异性应答的免疫细胞的增生。     

驱铅治疗后铅中毒患者CD3γ和CD3δ及CD3ε链mRNA水平的变化

目的了解驱铅治疗后铅中毒患者外周血中T细胞受体信号转导分子CD3γ、CD3δ、CD3ε链表达情况。方法采用实时荧光定量PCR分别检测9例健康人及16例铅中毒患者临床上进行驱铅治疗前后外周血单个核细胞中CD3γ、CD3δ、CD3ε链mRNA水平,以β2微球蛋白(β2M)基因为内参基因,根据相对定量公式2-△Ct×100%计算各基因表达水平。采用Spearman秩相关分析健康人和铅中毒患者驱铅治疗前后CD3γ、CD3δ、CD3ε链mRNA水平相关性。结果铅中毒患者驱铅治疗前后CD3γ链mRNA水平与健康人相比无明显差异;驱铅治疗前后CD3δ链mRNA水平均显著低于健康人,驱铅治疗后CD3δ链mRNA水平较治疗前更低;驱铅治疗前CD3ε链mRNA水平与健康人相比显著升高,驱铅治疗后CD3ε链mRNA水平有所恢复。健康人中CD3γ链与CD3δ链、CD3γ链与CD3ε链、CD3δ链与CD3ε链均无相关性;铅中毒患者驱铅治疗前CD3γ链与CD3δ链,CD3γ链与CD3ε链,CD3δ链与CD3ε链均呈显著正相关,驱铅治疗后仅CD3δ链与CD3ε链呈显著正相关。结论铅中毒患者CD3γ、CD3δ、CD3ε链mRNA水平呈不同趋势的改变,提示铅中毒后对机体免疫系统有一定影响并且在不同基因之间存在差异;驱铅治疗后体内铅负荷降低,CD3δ链表达水平仍然与健康人不同,说明驱铅治疗后机体的免疫功能仍存在异常。     

多发性骨髓瘤患者外周血CD3ε基因的表达特点

目的:建立荧光定量PCR法检测CD3ε链表达水平的方法,了解多发性骨髓瘤(MM)T细胞信号传导分子CD3ε基因的表达特点。方法:采用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR和相对定量分析法检测22例MM患者及22例正常人外周血单个核细胞CD3ε基因的表达情况,以β2微球蛋白基因(β2M)作为内参,22例健康人作为对照,采用相对定量公式:2-△Ct×100%,计算MM患者CD3ε基因相对mRNA表达量。结果:MM患者和正常人外周血单个核细胞均表达CD3ε基因,具体表达量呈现很大的个体差异性。MM患者CD3ε基因mRNA相对表达量最高为39.78%,最低为0.48%,正常人CD3ε基因mRNA相对表达量最高为5.15%,最低为0.01%。MM患者CD3ε基因表达量明显高于正常人(P0.05)。结论:成功建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR法检测CD3ε链表达水平的方法,率先报道了多发性骨髓瘤中CD3ε基因高表达的特点,为了解多发性骨髓瘤T细胞免疫学特点提供新的资料。