抗弓形虫主要表膜P30抗原单克隆抗体的制备与鉴定

目的 制备抗弓形虫主要表膜Ｐ３０抗原单克隆抗体（Ｍｃ－Ａｂ）半进行鉴定,为弓形虫病的诊断、抗原的提纯及亚单位疫苗的研制等提供可靠依据。方法 用ＲＨ株弓形虫速殖子膜抗原为免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠,取其脾细胞与小鼠ＳＰ２／０骨髓瘤细胞融合,筛选出能够稳定分泌高滴度抗Ｐ３０抗原ＭｃＡｂ杂交瘤细胞株,并测定Ｍｃ－Ａｂ免疫球蛋白亚类和单抗效价,用ＩＦＡＴ进行单抗识别的抗原定们,并通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅ     

人脑肌酸激酶单克隆抗体的制备及鉴定

用事故死亡者脑组织中提纯的人脑肌酸激酶（ＣＫ－ＢＢ）对ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠进行免疫，应用杂交瘤技术将免疫小鼠脾细胞分别与２种骨髓瘤细胞（ＮＳ－１，６５３）融合，筛选得到８株能稳定分泌ＩｇＭ抗体的杂交瘤细胞。对分泌抗体经酶联免疫电泳转移试验（Ｗｅｓｔ－Ｂｌｏｔ）进行了鉴定，其中４种抗体能特异地与ＣＫ－ＢＢ的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳带结合。提示这些单克隆抗体有可能应用于肌酸激酶的结构功能研究和临床检验中。     

人脑肌酸激酶单克隆抗体的制备及鉴定

用事故死亡者脑组织中提纯的人脑肌酸激酶（ＣＫ－ＢＢ）对ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠进行免疫，应用杂交瘤技术将免疫小鼠脾细胞分别与２种骨髓瘤细胞（ＮＳ－１，６５３）融合，筛选得到８株能稳定分泌ＩｇＭ抗体的杂交瘤细胞。对分泌抗体经酶联免疫电泳转移试验（Ｗｅｓｔ－Ｂｌｏｔ）进行了鉴定，其中４种抗体能特异地与ＣＫ－ＢＢ的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳带结合。提示这些单克隆抗体有可能应用于肌酸激酶的结构功能研究和临床检查中。     

抗癌胚抗原单区抗体的质粒构建及表达

目的 对抗癌胚抗原单区抗体进行表达研究。方法 采用ＰＣＲ技术将已获得的抗癌胚抗原（ＣＥＡ）原单克隆抗体Ｅ７Ｂ１０重，轻链可变区基因（ＶＨ、ＶＫ）进行改造后分别克陲是大肠杆菌表达质粒ＰＥＴ－２４α（＋）中，并进行表达，结果 显示重、轻链可变区在大肠杆菌中获得高铲表达，基力体总蛋白的２０％与２５％，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ图谱显示表达产物分子量为１３ＫＤ、１２ＫＤ，与其基因编旧白 理     

共刺激分子CD28单克隆抗体制备的新策略

目的发展一种制备抗人ＣＤ２８单克隆抗体的新方法。方法构建编码人ＣＤ２８基因的逆转录病毒表达系统,感染 ＢＡＬＢ／ｃ小鼠骨髓瘤细胞ＮＳ－ｌ,使其细胞膜表达ＣＤ２８抗原并用于免疫小鼠,制备单克隆抗体。结果获得分泌抗人 ＣＤ２８单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为Ｅ６６－３Ｓ,ＩｇＧ亚类鉴定为ＩｇＧ１。该株单抗能够特异性识别ＣＤ２８阳性的Ｔ细 胞,并完全阻断标准ＣＤ２８抗体与细胞表面ＣＤ２８抗原结合。在亚剂量分裂原的共刺激下,具有促进Ｔ淋巴细胞活化和 增殖作用。结论Ｅ６６－３Ｓ具有高度特异性和共刺激活性,为临床免疫治疗奠定了基础,同时,也为进一步制备其它膜抗 原的单克隆抗体提供了一种新途径．     

人甲状腺球蛋白的提取和纯化

目的：提取高纯度的甲状腺球蛋白（Ｔｇ）,为制备Ｔｇ抗血清及Ｔｇ单克隆抗体,建立Ｔｇ的检验方法及ＴｇＡｂ的测定方法做准备。方法：将手术切除的新鲜人甲状腺组织,加入生理盐水匀浆、过滤,把滤液浓缩,经二次ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２００柱层析,再经ＤＥＡＥ纤维素离子交换层析。结果：获得较高纯度的人Ｔｇ,经ＳＤＳＰＡＧＥ鉴定,显示为１条区带,表明纯度较高,经免疫电泳鉴定,提纯的Ｔｇ有较好的免疫活性。结论：这种提     

重组汉坦病毒核壳蛋白的制备及其单克隆抗体的研制

将ＰＣＲ扩增的ＨＴＶ７６－１１８ＲＮＡ小片段的ｃＤＮＡ克隆插入到ｐＤＳ ５６／ＲＢＳⅡ－（Ｏ）－６Ｈｉｓ中,通过ＩＰＴＧ诱导表达以及镍螯合层析纯化重组ＮＰ,经过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ,免疫转印和ＥＬＩＳＡ方法分析其蛋白特征,证实该重组ＮＰ与毒粒ＮＰ相同,均为４９．６ｋｕ,能与肾综合征血热（ＨＦＲＳ）患者血清产生特异性反应,以此重组ＮＰ作为抗原制备抗ＮＰ单克隆抗体,获得两株持续稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细     

一株抗重组人促红细胞生成素单克隆抗体杂交瘤的研制

目的 研制特异性识别人促红细胞生成素的单克隆抗体,并对其生物学特性作出初步鉴定。方法 采用重组人促红细胞生存素（ｒｈＥＰＯ）为抗原,常规免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,经细胞融合、ＥＬＩＳＡ筛选、有妻稀释亚克隆获得抗人ＥＰＯ杂交瘤,以免疫印迹和快速Ｉｇ亚型分类对所获单抗作出初步鉴定。结果 经筛选获得１株稳定分泌的抗ｒｈＥＰＯ单抗的杂交瘤细胞株（１Ｄ１）。亚型鉴定为ＩｇＧ２ｂ,轻链为ｋ链,用Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析证实该单抗为ｒｈＥＰＯ特异性识别。结论 成功获得１株可分泌特异性识别ｒｈＥＰＯ的单克隆抗体的杂交瘤。     

霍乱弧菌O139菌毛的提取及鉴定

为给霍乱弧菌亚单位菌苗的研制提供基础,作者对霍乱弧菌Ｏ１３９菌毛的提取和鉴定方法进行了探讨。结果发现,菌毛的最佳表达条件为ＡＫＩ或ＣＦＡ培养基中３０℃静止培养２４～３６小时。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳证实了ＴｃｐＡ蛋白的存在,分子量为２０．５ｋｄ。用鼠抗毒素共调菌毛（ＴＣＰ）的单克隆抗体和羊抗鼠ＩｇＧ－ＨＲＰ作斑点酶免疫试验,结果为阳性。用ＴＣＰ免疫大白兔所获得的免疫血清与Ｏ１３９型和ＥｌＴｏｒ型霍乱弧菌菌株作常规凝集试验,可见ＴＣＰ与Ｅ１Ｔｏｒ型菌株发生交叉反应。由此表明ＴＣＰ可作为一种有效的保护抗原,用于霍乱菌苗的研制     

单克隆抗体和超抗原的融合蛋白对人大肠癌细胞的抑制作用

观察抗人大肠癌的单克隆抗体和超抗原ＳＥＡ的融合蛋白Ｃ２１５Ｆａｂ－ＳＥＡ与Ｃ２４２Ｆａｂ－ＳＥＡ,对表达相应抗原的人大肠癌细胞株的体外抑制作用。方法：用健康人外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）作为效应细胞,ＭＴＴ法测定融合蛋白对人大肠癌细胞系的体外抑制率,采用荧光抗体流式细胞术测定肿瘤细胞ＨＬＡ－Ｉ和ＨＬＡ－ＤＲ抗原分子的表达。结果：在ＰＢＭＣ介导下,Ｃ２１５ＦａＢ－ｓｅａ和ＨＬＡ－Ⅰ,ＨＬＡ－ＤＲ分子     

2-型猪链球菌谷氨酸脱氢酶的表达和免疫学活性研究

目的 表达2-型猪链球菌(Streptococcus suis serotype 2,SS2)的谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase,GDH),研究其免疫学活性,探讨其作为疫苗候选分子的可能性.方法 用聚合酶链反应(PCR)技术从SS2临床分离株05ZYH33的基因组DNA中扩增出gdh基因片...     

弓形虫主要表面抗原1截短型片段的纯化与鉴定

目的:表达和纯化弓形虫SAG1,分析其免疫原性。方法:将诱导表达SAG1后菌体裂解,离心,分别收集其上清和沉淀;亲和层析分离纯化裂解上清液中的SAG1,SDS-PAGE和Western blot鉴定SAG1纯度和免疫原性。结果:诱导后重组体pGEX-SAG1/Bl21超声裂解上清液、8M脲溶解沉淀的上清中都含有融合蛋白GST-SAG1,从超声裂解上清液中纯化获得融合蛋白GST-SAG1。结论:亲和层析获得具有免疫原性的SAG1。     

河南TT病毒全基因序列测定及TTV感染检测方法的研究

目的 :为了分析河南省TTV的基因结构、特征及基因变异 ,建立适合我国人群的诊断方法。方法 :采用巢式聚合酶链式反应 (PCR)技术从河南省血液中心献血员TTV阳性血清中扩增TTV全基因 ;用PCR方法扩增ORF2片段 ,进行原核表达 ,并转化大肠杆菌 ,进行诱导表达。用SDS PAGE分析表达产物。结果 :在国内较早地克隆测定了一株TTV河南分离株的基因序列 ;建立了检测TTV感染的PCR检测方法 ;在国内较早地表达出TTV重组蛋白抗原 ,抗原具有良好的活性。结论 :用表达的抗原初步建立了检测血清抗 TTVIgG抗体的间接ELISA方法 ,可有效地应用于TTV感染的检测。     

恶性疟原虫体外短期无血清培养上清可溶性抗原的纯化和分析

本实验对恶性疟原虫(FCC—1/HN)裂殖体体外短期无血清培养上清可溶性抗原进行了纯化,并用CIE及ELISA法检测和分析上清可溶性抗原的免疫学活性.结果表明,恶性疟原虫体外短期无血清培养上清中有可溶性抗原存在,抗原特异性与恶性疟原虫虫体抗原相似:经亲和层析纯化的上清抗原中不含可测水平的红细胞膜抗原成分.     

HER-2蛋白疫苗的制备及在小鼠中诱导的抗体应答

目的：制备HER-2抗原疫苗．方法：采用RT—PCR方法从HER-2＋SKBR3细胞株中获得HER-2基因胞外段编码区cDNA,构建pQE-30-HER-2原核表达载体,在大肠杆菌中表达HER-2胞外区蛋白．Ni—NTA柱亲和层析纯化后,梯度尿素复性,Western Blot鉴定．用获得的蛋白免疫小鼠,检测重组蛋白在小鼠体内诱导的免疫应答．结果：构建的pQE-30-HER-2质粒经酶切和DNA测序分析,结果表明该基因的序列与设计的序列完全相同．构建的质粒转化DI-IS（x后经IPTG诱导表达,SDS—PAGE分析,该重组蛋白以包涵体形式表达,且与mAbHerceptin有较好的结合活性．包涵体用Ni—NTA柱亲和层析纯化后,梯度尿素复性,最大限度的获得了可溶性的HER-2胞外区蛋白．用重组蛋白免疫小鼠,得到了较高的抗体滴度．结论：成功制备了HER-2蛋白疫苗并诱导出较高抗体滴度,为下一步工作打下基础．     

人钠/二羧基转运蛋白2融合蛋白载体的构建及其原核表达

目的：观测和鉴定人钠／二羧基转运蛋白2(hSDCT2)在大肠杆菌中的表达，并分离、纯化其蛋白产物。方法：应用：DNA重组技术，构建重组表达质粒pGEX-hSDCT2；IPTG诱导其表达。采用谷胱甘肽偶联的Sepharose4B亲和层析纯化GST-hSDCT2，经Factor Xa酶切和二次亲和层析后，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western Blotting进行鉴定。结果：成功构建hSDCT2基因融合蛋白载体，SDS-PAGE及Western Blotting显示GST-hSDCT2融合蛋白表达于原核细胞，蛋白产量约占菌体总蛋白量的25％。经酶切及二次纯化后，获得纯化的hSDCT2蛋白。结论：人钠／二羧基转运蛋白2可在大肠杆菌中稳定表达。     

模式抗原破伤风毒素C蛋白的克隆、表达条件优化及免疫原性初步分析

目的 获得高纯度、高免疫原性的破伤风毒素C片段(TTC)蛋白.方法 以PCR从破伤风杆菌质粒DNA中扩增TTC基因片段,将其插入载体pET43.1a( )并导入大肠杆菌BL21(DE3)plysS中表达.用Ni2 NTA琼脂糖柱纯化融合蛋白,经凝血酶酶切,再用Ni2 -NTA琼脂糖柱分离目的 蛋白.SDS-PAGE和免疫印迹分析目的 蛋白的相对分子质量和抗原性,动物免疫实验鉴定其免疫原性.结果 获得1373 bp的TrC基因片段,构建成重组表达载体pET43.1a( )-TTC并在大肠杆菌中表达.TTC-Nus融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的22％,酶切后TTC蛋白可与载体蛋白有效分离,获得纯度为95.5％的TTC蛋白,该蛋白可被破伤风抗毒素识别;将TTC蛋白免疫小鼠后,免疫血清可与破伤风毒素特异性结合,三次免疫后其抗体效价可达1:25 600.结论 所获TTC蛋白纯度高,免疫原性好,为研究体内外抗原提呈、免疫应答提供了良好的模式抗原.     

重组α2-HS糖蛋白的原核表达、纯化及免疫学活性分析

目的:原核表达并纯化具有生物学活性的重组α2-HS糖蛋白(AHSG)。方法:提取人肝癌细胞株HepG2细胞总RNA,逆转录得cDNA,PCR扩增出目的基因,与pMD18-T载体连接后,转化至大肠杆菌DH5α中,大量扩增后提取克隆质粒,连接至原核表达载体pEP-30a(+)中,转化BL21(DE3),经IPTG诱导蛋白表达,通过镍离子亲和层析的方法纯化重组蛋白,采用SDS-PAGE电泳、免疫印迹杂交法对纯化产物进行分析鉴定。结果:成功构建了AHSG原核表达系统BL21(pET30a-AHSG),最佳诱导条件为80μmol/LIPTG诱导3h;诱导表达的蛋白相对分子质量约54600,主要以不溶性的包涵体形式存在,纯化后的重组蛋白质量浓度最高达2.3g/L,经免疫印迹杂交鉴定有抗原性。结论:成功构建了AHSG原核表达系统,该系统可高效表达重组AHSG蛋白,该蛋白具有良好的抗原性。     

重症肌无力相关基因P9 TRAF型锌指结构域的表达及抗体制备

目的 克隆重症肌无力相关基因P9 TRAF型锌指结构域(P9 TRAF-type zinc finger domain,简称P9-ZFD)的cDNA片段及表达其编码的蛋白质,制备P9-ZFD多克隆抗体。方法 应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)克隆编码P9-ZFD的cDNA序列,构建pET24a-P9-ZFD表达载体,在E.coli BL21(DE3)宿主菌中胞内诱导表达P9-ZFD蛋白,用经组氨酸亲和层析纯化的P9-ZFD融合蛋白免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,Western blot鉴定抗体的免疫特异性。结果 扩增的P9-ZFD基因片段经测序证实与基因库报道的序列完全一致。表达、纯化的P9-ZFD融合蛋白相对分子质量约30 000,其纯度达 95％以上。制备的P9-ZFD抗体仅与纯化的P9-ZFD融合蛋白产生特异性免疫反应。结论 P9基因TRAF型锌指结构域编码的蛋白质能够在原核细胞中表达,并能获得具有特异免疫反应性的P9-ZFD多克隆抗体。     

重组弓形虫致密颗粒蛋白7的表达及免疫活性分析

目的:重组表达弓形虫致密颗粒蛋白7(GRA7),分析其免疫活性。方法:采用聚合酶链反应(PCR)从刚地弓形虫基因组DNA中扩增GRA7基因,经克隆和测序分析后,亚克隆至表达载体pET-23a(+),转化大肠埃希菌BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达GRA7,用His-bindTM亲和层析柱纯化,免疫印迹和小鼠免疫分析其抗原性。结果:PCR扩增出大小约660bp的GRA7基因片段,并被亚克隆到原核表达载体pET-23a(+),构建了原核重组表达质粒pET-GRA7;表达纯化获得分子量约29,000的重组GRA7;重组GRA7能被弓形虫感染兔血清所识别,并诱导小鼠产生抗体滴度达1:12800。结论:获得了具有良好免疫学活性的重组抗原GRA7。