激光共聚焦显微镜观察小鼠早期胚胎中蛋白激酶Cα的表达

目的 优化早期胚胎的免疫荧光染色方法并观察蛋白激酶C(PKCα)在小鼠着床前胚胎的表达和定位.方法 用优化的免疫荧光化学法结合激光共聚焦显微术,观察小鼠早期胚胎2-细胞期到囊胚期PKCα的表达情况.结果 小鼠早期胚胎自2-细胞期到囊胚期均有PKCα亚型的表达,且主要集中在早期胚胎卵裂球的核内.结论 经优化后的免疫荧光染色可清晰地检测到胚胎内PKCα集中于细胞核内表达,且分裂间期的表达高于分裂期.     

白细胞介素-8在着床前后小鼠子宫内膜及胚胎的定位研究

目的:研究着床前后小鼠子宫内膜及胚胎白细胞介素-8(Interleukin-8,IL-8)的定位变化.方法:应用免疫组织化学技术,观察IL-8在妊娠4d和妊娠8d小鼠子宫内膜及胚胎的表达部位.结果:妊娠4d(着床前),IL-8主要表达在子宫内膜的腔上皮、腺上皮和基质;胚泡的内细胞团和滋养层细胞亦有阳性表达.妊娠8d(着床后),子宫内膜的腔上皮IL-8表达呈阴性,腺上皮和蜕膜细胞均呈弱阳性;胚胎IL-8表达呈阴性.结论:IL-8可能参与胚泡着床的过程,但与胚胎分化、发育无密切关系.     

小鼠胚胎切割技术在人类辅助生殖中的应用研究

目的:探讨将胚胎切割方法尽早应用于临床。方法:应用显微切割刀和酶消化透明带显微玻璃针分割两种方法:对2、4、8细胞期和桑椹期的胚胎分割为二分胚;将2、4、8细胞期的胚胎切割成卵裂球;同时将2细胞期的胚胎连续2次分割培养;切割的二分胚和卵裂球在M16溶液中行胚胎体外培养,观察其发育情况,达囊胚期植入子宫。结果:小鼠2、4、8细胞期的切割成功率分别为98.0%、86.6%、77.2%、66.1%,发育率为61.5%、80%、84.8%、89.3%;小鼠2、4、8细胞期切成的卵裂球发育至桑椹胚的成功率随着细胞数的增多而减少。小鼠2细胞期卵裂球的全能性优于4、8细胞期卵裂球。各细胞期半胚的发育率明显好于卵裂球的发育率。连续有两次切割2细胞期的胚胎发育到桑椹胚为15%。发育到囊胚的8细胞期和桑椹胚期的半胚移入假孕母鼠体内妊娠率分别为33.3%和60%。结论:显微玻璃针在切割成功率及后期的细胞成活率上优于纤维切割刀的切割方法。     

雌激素、孕激素对小鼠胚卵体外发育及胚泡着床的影响

目的:研究雌、孕激素在小鼠胚卵体外发育及胚泡着床过程中的作用.方法:在小鼠桑椹胚与人蜕膜细胞共培养体系中分别加入雌激素(E2组)、孕激素(P组)、雌激素和孕激素(E2 P4组),观察各组胚卵发育以及胚泡粘附和铺展情况.结果:E2组桑椹胚向胚泡的发育率高于对照组,E2 P4组胚泡的粘附率和滋养层细胞的铺展率均较对照组高.结论:单独用雌激素能够促进小鼠桑椹胚发育成胚泡,雌激素和孕激素联合应用能够促进胚泡的粘附和铺展.     

瘦素在着床前小鼠胚胎中的表达及其对胚胎发育的影响

目的 探讨瘦素(leptin)在围着床期小鼠胚胎中的表达规律和分布情况以及leptin抗体对小鼠胚胎体外发育的影响.方法 雌性NIH小鼠超排后与雄鼠交配,分别在妊~4 d上午从输卵管或子宫角冲取相应时期的胚胎,用于以下实验:①分别提取总RNA,检测胚胎中leptin mRNA表达情况.②采用免疫荧光技术,观察leptin蛋白在囊胚的表达和分布情况.③将8-细胞小鼠胚胎培养于含不同浓度leptin抗体的培养液中,观察囊胚形成及脱透明带的情况.结果 leptin mRNA仅在囊胚期特异性表达,其余各时期胚胎未见表达;leptin蛋白在囊胚的滋养层细胞和内细胞团的细胞质和细胞膜呈阳性表达,而在细胞核无表达.一定浓度的leptin抗体可明显降低囊胚的形成率(1∶400, P<0.05) 和脱带率(1∶1 600, P<0.05),且随着抗体浓度的增加,这种抑制作用更明显.结论 leptin能促进着床前胚胎发育,同时也可能参与了胚胎着床过程.     

在小鼠着床前胚胎中c-myc的表达

目的: 观察小鼠着床前胚胎细胞中c-myc基因的表达, 了解其对早期胚胎发育可能影响的作用. 方法: 采用原位杂交及免疫组织化学ABC法,分别检测小鼠着床前胚胎细胞中c-myc mRNA及c-myc蛋白. 结果: 在小鼠2细胞、4细胞、6细胞、8细胞和囊胚期胚细胞中均检测到原癌基因c-myc转录产物的表达,c-myc mRNA分布于胚细胞的胞质和胞核. 免疫组织化学方法也发现,2细胞至囊胚期胚胎细胞的 c-myc蛋白均呈免疫反应阳性, 阳性物质分布于胞质和胞核中, 胚胎透明带则呈阴性反应. 结论: 小鼠早期胚胎有c-myc基因表达,c-myc基因对小鼠着床前胚胎发育可能起重要调节作用.     

着床前小鼠子宫内膜及胚泡中IL-8RB蛋白的定位表达及意义

目的:研究着床前小鼠子宫内膜及胚泡中白细胞介素-8B型受体(Interleukin-8 receptor B,IL-8RB)的表达情况.方法:应用免疫组织化学技术,观察IL-8RB蛋白在妊娠4d小鼠子宫内膜及胚泡的表达部位;HE染色后光镜下观察子宫内膜的形态结构特点. 结果:IL-8RB表达于妊娠4d小鼠子宫内膜的腔上皮细胞、腺上皮细胞和基质中;胚泡的内细胞团和滋养层细胞亦有阳性表达.HE染色可见妊娠4d基质中有大量中性粒细胞浸润,而腔上皮中未见中性粒细胞.结论:IL-8RB可能通过与其配体IL-8结合而参与胚泡滋养层细胞与子宫内膜上皮细胞之间的相互作用.     

废弃胚胎来源的单个卵裂球的发育规律

目的 通过对单个卵裂球的体外培养发育的观察,评估其细胞增殖、囊胚形成以及细胞发育分化.方法 收集临床体外受精周期中第3天新鲜废弃胚胎,分离单个卵裂球后即移至囊胚培养液中培养.观察卵裂球的生长情况,分析体外发育单个卵裂球的增殖情况、囊胚的形成时间以及效率,并对形成的囊胚进行细胞染色计数,总结单个卵裂球体外培养的发育规律;并且通过免疫荧光检测囊胚的多能性标记物Oct3/4的表达,初步探讨单个卵裂球的发育极性.结果 收集第3天新鲜废弃胚胎,共分离并进入研究的单个卵裂球596个,卵裂球形成细胞融合在分离后的48 h,囊胚形成则在分离后的72 h,而且生成的囊胚体积较小,大部分内细胞团结构不明显,卵裂球增殖率分别34.1％;囊胚形成率为8.6％,而同期收集的废弃胚胎的囊胚形成率为28.7％,组间差异有统计学意义(P ＜0.001);对分离卵裂球培养第4天形成的囊胚进行细胞计数,中位细胞数为24.6;对所形成的囊胚分析Oct3/4的表达发现,只有25.0％囊胚可表达多能性标志物(Oct3/4),而且囊胚表达多能性标记物的细胞数很少(2～5个).结论 普通胚胎发育规律比较,单个卵裂球的囊胚形成时间延迟1d,囊胚形成率较未分离的废弃胚胎低下;而且单个卵裂球的分离培养可能对细胞的全能性或者极性发育存在负面的影响.     

Peroxiredoxin Ⅱ在小鼠卵巢中卵泡、GV卵、MⅡ卵和植入前胚的表达和定位

目的:观察PeroxiredoxinⅡ在小鼠卵巢中卵泡和植入前胚的表达与定位,为探讨PeroxiredoxinⅡ在小鼠卵母细胞发育成熟和早 期胚发育的作用提供依据.方法:根据小鼠PeroxiredoxinⅡmRNA序列(AccessionNo:BC002034)设计引物,对小鼠生发泡完整 卵细胞(GV卵)中的PeroxiredoxinⅡ可能编码区进行扩增.同时,取生后3d和2mo小鼠的卵巢,免疫细胞化学染色显示Perox iredoxinⅡ蛋白在卵泡中的分布.此外,运用RT PCR和免疫细胞化学染色方法观察PeroxiredoxinⅡ在植入前胚的表达.结果:从 GV卵中扩增所得684bp的cDNA序列,与小鼠PeroxiredoxinⅡ具有99%同源性;其推导的编码氨基酸序列与小鼠Peroxiredoxin Ⅱ氨基酸序列完全相同.免疫细胞化学染色显示:生后3d小鼠卵巢内未见PeroxiredoxinⅡ阳性反应;2mo小鼠卵巢内阳性反应 见于初级卵泡、次级卵泡和近成熟卵泡中卵母细胞的胞质.卵泡细胞未见PeroxiredoxinⅡ阳性反应.RT PCR结果表明:Peroxire doxinⅡmRNA在GV卵中处高水平,从MⅡ卵开始略有下降,在4 细胞胚和早期囊胚期间未检到.免疫细胞化学染色显示:GV 卵、MⅡ卵、1 细胞胚、2 细胞胚、4 细胞胚、8 细胞胚、桑椹胚和早期囊胚均呈PeroxiedoxinⅡ阳性反应.结论:PeroxiredoxinⅡmR NA和蛋白在小鼠植入前胚的表达存在时程差别,     

小鼠胚卵石蜡切片及免疫组织化学染色方法

石蜡切片法是科研与教学工作中的一种常用实验技术,在细胞生物学、组织胚胎学及病理学中应用甚广[1].对于一般肉眼可见的较大组织标本来说,此项技术操作简便 ,标本能够长期保存.胚卵标本是研究人与动物胚胎发生发育过程中必须观察的标本,尤其是植入前的早期胚卵,对研究胚体早期发育的影响因素至关重要.本文对原有的胚卵切片技术进行了改进,为进一步研究人与动物的早期胚卵发育及其影响等诸因素提供了新的技术方法.已有研究表明层粘连蛋白(laminin,LN)在胚胎粘附、着床过程中发挥重要作用[2,3].本实验利用植入前各阶段的早期胚卵,以单个胚卵石蜡包埋切片技术为手段 ,通过免疫组化染色研究LN在小鼠早期胚卵中的分布,摸索出一套特异性强的针对单个胚卵进行免疫组化染色的方法,为进一步研究LN在小鼠早期胚卵中的免疫定位及分布奠定了基础.     

瘦素对小鼠着床前胚胎发育影响的体外研究

目的　探讨瘦素在体外对小鼠着床前胚胎发育的影响。方法　 1收集小鼠 2 -细胞胚胎 ,在不同剂量瘦素的 CZB培养液中进行体外培养 ,观察胚胎发育情况 ,并进行胚胎移植 ,观察着床率 ;2收集小鼠 2 -细胞胚胎在空白 CZB培养液中体外培养至桑葚胚期 ,再分别置入不同剂量瘦素的 CZB培养液中进行体外培养 ,观察胚胎进一步发育情况。结果　瘦素能提高 2 -细胞胚胎体外发育的质量、发育率和胚胎着床率。当瘦素剂量为 10 ng/ ml时平均胚胎形态学评分 (AES)为 16 .0 8± 0 .37,剂量为 5 0 ng/ ml时 AES为 17.5 7± 0 .4 2 ,两者间差别有统计学意义(P<0 .0 5 )。但剂量进一步增加 ,促进作用不再递增。瘦素对桑葚胚体外进一步发育无显著影响。结论　瘦素参与了小鼠着床前胚胎的发育 ,能提高胚胎发育质量、发育率 ,有利于胚胎的进一步着床。     

子宫内膜上皮细胞与小鼠胚胎共培养对小鼠胚胎早期发育的影响

目的:采用子宫内膜上皮细胞与小鼠胚胎共培养,观察其对早期胚胎体外发育的影响。方法:对小鼠子宫内膜上皮细胞进行分离、培养鉴定,然后与体外受精的小鼠胚胎进行共培养,观察共培养对小鼠胚胎卵裂率、孵化率以及囊胚期胚胎总细胞数的影响。结果:与无上皮细胞相比,共培养明显促进了小鼠桑椹胚率(71.3%和61.2%,P<0.05),囊胚率(50.0%和39.7%,P<0.05),囊胚孵化率(34.8%和24.3%,P<0.05)和胚胎总细胞数(44.1和35.6,P<0.05)。结论:子宫内膜上皮细胞能够促进小鼠胚胎的体外发育,对早期胚胎的体外发育环境具有优化作用。     

小鼠子宫角注射层粘连蛋白及其抗血清对胚泡着床的影响

目的：研究层粘连蛋白及其特异性抗血清对胚泡着床的影响。方法：在小鼠子宫角内注射层粘连蛋白及其特异性抗血清，并对胚胎着床率与子宫内膜变化进行组织学观察。结果：提示外源性层粘连蛋白在小鼠体内有促进胚泡粘附、植入子宫内膜的趋势，但作用不明显；而层粘连蛋白抗血清则有显著抑制小鼠胚泡着床的效应。结论：小鼠体内的层粘连蛋白对胚胎粘附、着床起重要作用。     

囊胚发育速度和形态学参数与整倍体状态及妊娠结局的相关性

目的:研究胚胎植入前遗传学检测周期中,囊胚发育速度、囊胚扩张程度、内细胞团等级和滋养层细胞等级对其整倍体状态及整倍体胚胎移植后妊娠结局的影响.方法:回顾性分析2017年10月至2021年1月南京医科大学附属妇产医院生殖医学中心行胚胎植入前非整倍体遗传学检测(preimplantation genetic testing...     

Co-Culture of Early Embryo with Human Decidual Stromal Cells in vitro by Improvement of Early Embryo Development

The quality of the in vitro culture conditionsfor human pre--implantation embryos is one of themost critical aspects of successful in vitro fertilization and embryo transfer (IVF--ET) and other biology techniques, such as embryo clone, geneknock--out, pre--implantation genetic diagnosis etc.The culture of pre--im:7lantation mammalian embryos can take place in a range of embryo culturemedia, ranging from simple chemically defined media to more complex media. In vitro pre--implantation embryo …     

Co-culture of early embryo with human decidual stromal cellsin vitro by improvement of early embryo development

Summary An early embryo co-culture system with human decidual stromal cells was established to study its effect on early embryonic cleavage and growth in vitro. Three hundred and eight 2-cell mouse embryos were co-cultured with human decidual stromal cell monolayer in MEM + 0.4 % bovine serum albumin (BSA) and 163 embryos cultured in MEM + 15 % FCS alone as control. Among the mouse 2-cell embryos co-cultured with human decidual stromal cells, 72.73 % developed to the morula stage and 67.21 % cavitated to blastocysts with 59.74 % hatching, as compared with 61.34 % to morula stage, 48.47 % to blastocysts and none hatching in the controls, respectively. Co-cultured embryos cleaved slightly faster than controls and showed no or less fragmentation than those in the control. These results suggested that human decidual stromal cells can support early embryonic development and yield a reasonable number of embryos with good quality up to blastocyst stage.     

序贯培养对小白鼠胚胎体外发育的影响

目的:探索序贯培养技术对小白鼠胚胎体外发育的影响。方法:将 2 -细胞期的小鼠胚胎随机分为序贯培养组与传统培养组进行培养 ,观察分析两组的 8-细胞期胚胎形成率、桑椹期胚胎形成率及囊胚形成率。结果:序贯培养组 8-细胞期胚胎形成率、桑椹期胚胎形成率及囊胚形成率分别为 70 .5 %、6 8.2 %、6 5 .9% ,传统培养组分别为 4 5 .7%、4 5 .7%、34.3%。两组比较 ,序贯培养组高于传统培养组 ,差异有统计学意义 (P <0 .0 5 )。结论 :采用适当的培养液进行序贯培养 ,更适合小白鼠胚胎的体外发育     

p38丝裂原活化蛋白激酶特异性抑制剂对小鼠早胚发育及植入的影响

目的观察p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）特异性抑制剂SB203580对小鼠早胚发育及植入的影响。方法①采用体外胚胎培养技术,将孕2?d小鼠早胚随机分组,接种到添加不同浓度抑制剂的培养液内进行培养,以观察p38MAPK特异性抑制剂对早胚发育的影响;②体内宫腔注射：取孕4?d小鼠,由子宫角注射不同浓度的SB203580,于孕8?d检查胚胎植入数,同时取子宫,观察内膜的组织学变化。结果①添加抑制剂组的早胚不能发育为胚泡,停滞在8～16细胞阶段。但去除抑制剂后继续培养,幼胚仍能发育到胚泡阶段;②注射SB203580组的小鼠,胚胎植入数明显少于对照组（P＜0.01）。镜下可见,其胚胎组织呈退化坏死状态,胚胎周围蜕膜细胞呈明显的空泡样变性,蜕膜及胚胎中均见大量血细胞浸润。结论①p38MAPK在小鼠植入前胚胎发育过程中起作用;②p38MAPK特异性抑制剂SB203580可抑制在体小鼠胚泡植入及植入后胚胎和蜕膜细胞的发育。     

卵母细胞线粒体移植对年老小鼠植入前胚胎线粒体膜电位的影响

目的探讨卵母细胞线粒体移植（MIT）对年老小鼠植入前胚胎线粒体膜电位(△Ψm)的影响。方法6～8周龄雌性昆明种小鼠经超排卵、卵胞浆内单精子显微注射(ICSI)及培养液空注后形成的胚胎为A组,12月龄雌性昆明种小鼠经同样处理后形成的胚胎为B组,12月龄雌性昆明种小鼠经超排卵、ICSI及MIT后形成的胚胎为C组。比较植入前各阶段3组胚胎的△Ψm以及各组胚胎植入前各阶段△Ψm的变化趋势。结果在二细胞期和桑椹胚期,A、C两组胚胎△Ψm均高于B组（P＜0.01）,而在四细胞期、八细胞期和囊胚期,A、C两组胚胎△Ψm亦均高于B组（P＜0.05）。3组中,桑椹胚和囊胚△Ψm均高于二细胞期、四细胞期和八细胞期胚胎（P＜0.05）,而前两者间以及后3者间差异均无统计学意义（P＞0.05）。结论卵母细胞MIT可明显提高年老小鼠植入前胚胎各阶段△Ψm,且不改变其变化趋势。