正交实验设计优化白木香ISSR-PCR反应体系的研究

利用正交实验设计的方法,对白木香ISSR-PCR(简单重复序列区间-多聚酶链式反应)反应体系中的5种主要因素(dNTP、Mg2 、模板DNA、引物和Taq酶)在4个水平上进行优化筛选,建立了白木香ISSR-PCR反应的最佳体系(25μ1)为:dNTP 0.2 mmol/L、Mg2 2.5 mmol/L、引物0.5μmol/L、模板DNA 100 ng和Taq酶1.0 U.通过梯度PCR反应得到相应引物的最佳退火温度为49.2℃.这一体系的建立为今后利用ISSR标记技术研究白木香的遗传多样性提供了标准化程序.     

多伞阿魏简单重复序列区间-聚合酶链反应体系的建立和优化

目的:建立并优化多伞阿魏简单重复序列区间(ISSR)-聚合酶链反应(PCR)体系。方法:通过单因素试验确定影响多伞阿魏ISSR-PCR扩增结果的Mg2+、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶、DNA模板最佳水平范围。对Mg2+、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA进行5因素4水平的正交试验,优选最佳ISSR-PCR体系条件。ISSR-PCR扩增结果用SPSS 18.0统计软件分析。结果:不同水平的因素对PCR均有明显影响,其中Mg2+、dNTPs、引物影响最大。多伞阿魏ISSR-PCR最佳反应体系为:在50μl的反应体系中含有10×Taq Buffer 5μl、Mg2+2.0 mmol/L、dNTPs 0.4 mmol/L、引物0.4μmol/L、Taq DNA聚合酶1.75 u/50μl、DNA模板0.25 ng/μl。在此基础上,从100条引物中筛选出15条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物。结论:建立的多伞阿魏ISSR-PCR体系具有较高的稳定性和重现性,可为进一步利用ISSR技术进行多伞阿魏遗传多样性分析、不同种源鉴定及亲缘关系分析提供基础。     

红花cDNA相关序列扩增多态性的扩增体系优化

目的：建立一种适合以红花cDNA为模板进行相关序列扩增多态性（SRAP）扩增的体系,筛选最佳的SRAP-PCR反应条件。方法：提取红花RNA并反转录成cDNA,以此为模板,使用正交设计表设计PCR反应中的3个重要因素Taq酶、三磷酸脱氧核苷（dNTPs）、引物的反应浓度。随后设计Mg^2＋的反应浓度以及模板含量,分别进行单因素试验。结果：本研究建立的红花cDNA-SRAP扩增条件为：25μL反应体系中含模板cDNA 20 ng,1×PCR缓冲液2.5 mmol/L,Mg^2＋2.0 mmol/L,Taq DNA聚合酶0.04 U/μL,dNTPs 0.2 mmol/L,引物0.2μmol/L。优化后扩增结果稳定性好,条带清晰,多态性好。结论：该体系为红花功能基因的研究奠定了基础。     

当归简单重复序列区间-聚合酶链反应体系的建立及优化与品种(系)间遗传关系研究

目的:建立并优化当归简单重复序列区间(ISSR)-聚合酶链反应(PCR)体系并对6个当归品种(系)的遗传关系进行研究。方法:以ISSR-PCR扩增结果为指标,Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶活性、dNTPs浓度、引物浓度、DNA模板用量为5因素,通过正交、单因素试验优化ISSR-PCR体系。应用优化体系对6个不同品种(系)的当归样本进行遗传关系分析。结果:当归ISSR-PCR最佳反应体系为在20μl反应体系中含Mg2+(10×PCR Buffer)1.5 mmol/L、TaqDNA聚合酶0.6 U、dNTPs 0.375 mmol/L、引物0.3μmol/L、DNA模板42 ng。6个当归品种(系)的多态性位点百分率为13.04%,Nei’s基因多样性指数为0.058 0,Shannon多样性指数为0.082 7。结论:建立的当归ISSR-PCR体系可用于当归分子遗传学研究,6个当归品种(系)间遗传差异较小。     

玄参ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为了建立稳定的玄参ISSR-PCR反应体系,本试验采用5因素(dNTPs、Taq DNA聚合酶、MgCl2、引物及模板)5水平正交设计筛选PCR体系,并利用单因子梯度进一步优化反应体系各因素浓度和扩增程序(退火温度、延伸时间和循环次数)。结果表明:在20μl反应体系中含10×buffer,0.3 mmol/L dNTPs,0.5~1.0 UTaq DNA聚合酶,2.0 mmol/L MgCl2,0.2μmol/L引物,150 ng模板,扩增效果最好。PCR扩增程序:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,50~61℃退火(退火温度随引物不同而变化)45 s,72℃延伸1 min,35个循环;72℃延伸7 min。从而建立了适合玄参的ISSR-PCR反应体系,为采用ISSR-PCR分子标记技术研究参种质资源遗传多样性提供了技术依据。     

九眼独活基因组DNA提取、ISSR反应体系优化及引物筛选

目的探讨九眼独活基因组DNA提取方法、ISSR反应体系优化及引物筛选,为研究九眼独活居群遗传多样性及原药材DNA鉴定奠定基础。方法采用改良的CTAB法与常规CTAB法对九眼独活的基因组进行提取,通过紫外、电泳、PCR-ISSR检测方法进行比较。结果实验表明,改良的CTAB法得到的DNA浓度和纯度较高,并可很好地应用于ISSR分子标记分析;以Mg2+、dNTP、引物和聚合酶建立L9(34)正交设计,并同时考察退火温度和模板浓度,建立适宜的25μLISSR-PCR体系为:模板30ng,Mg2+3.5mmol.L-1,dNTP0.6mmol.L-1,引物0.4μmol.L-1,Taq酶1U。结论以此体系为基础进行引物筛选,在40条ISSR引物中筛选出13条扩增条带清晰、多态性较高、重复性好的引物。     

1-17 菲啰啉对氧化剂所致CHL细胞DNA链断裂的影响

目的了解金属螯合剂菲啰啉对不同氧化相关因素所致CHL细胞DNA损伤的影响,初步探讨损伤机制.方法CHL细胞用不同浓度菲啰啉处理30min后加入氧化相关因素培养一定时间(过氧化氢25min;重铬酸钾1h45min;阿霉素1h15min),然后用SCGE(单细胞凝胶电泳)测定DNA链断裂情况,分析菲啰啉对DNA氧化损伤的影响.结果0.4mmol/LH2O2、0.3mmol/LK2Cr2O2、0.5μmol/L阿霉素均可明显引起CHL细胞DNA链断裂.当菲啰啉浓度为3μmol/L时,对H2O2、K2Cr2O2所致的损伤即有明显的保护作用;当浓度升至12μmol/L时,则可完全消除这两种因素所致的DNA链断裂损伤.当菲啰啉浓度为10、30μmol/L时,对阿霉素所致的损伤有明显保护作用;但浓度直至60μmol/L,仍不能完全消除阿霉素的损伤作用.结论菲啰啉对三者所致DNA损伤有不同程度的防保作用,提示H2O2和K2Cr2O2所致DNA损伤主要与过渡金属离子参与的@OH产生有关,而阿霉素所致损伤只有部分与此有关.     

中麻黄ISSR—PCR反应体系的建立和优化

目的：建立适用于中麻黄的简单重复序列区间．聚合酶链反应（ISSR—PCR）最佳反应体系。方法：以凝胶成像系统下特异谱带特征为评价指标,以Mg2＋、dNTPs、TaqDNA聚合酶、引物和DNA模板为考察因素,采用L16（4^5）正交试验优选条件;通过单因素试验对反应体系中各种影响因素进行筛选。结果：中麻黄ISSR-PCR最佳反应体系（20p1）为30ngDNA模板、0．25mmol／LdNTPs、2．0mmol／LMg2＋（10xPCRBuffer）、0．4μmol／LISSR引物、1．5UTaqDNA聚合酶;并筛选出了12条ISSR-PCR引物的最佳退火温度。结论：所建中麻黄ISSR—PCR反应体系经过10份中麻黄材料检验证明该体系稳定可靠,可用于中麻黄遗传分析。     

正交优化乙醛脱氢酶2基因多态性PCR体系

目的建立通用的ALDH2基因PCR反应体系,筛选出各反应因素的最佳水平。方法采用正交设计L16（4^5）在4个水平5个因素（Taq酶、引物、Mg2＋,dNTP和模板DNA）对ALDH2基因PCR反应体系进行实验,两次结果分别用统计软件MINITAB进行分析,利用梯度PCR晦定引物最佳退火温度。结果ALDH2基因PCR反应的最佳反应条件为：为25止体系中包含：Mg（25mM）2．5μL、dNTPs（2．5mM）2．0μL、引物上游和引物下游各（2．5pNI）3．00L、模板DNA3．0μL、10×PCRbuffer2．5μL、Taq酶1．5U,退火温度为60℃。结论这一通用PCR反应条件的建立为实现ALDH2基因多态性检测建立了基础。     

红花随机扩增多态性DNA反应体系的建立与优化

目的：考察不同因素对红花随机扩增多态性DNA反应体系的影响，建立并优化反应体系。方法：提取红花基因组DNA，分别设计Taq酶浓度（三水平：0．02、0．04、0．06U／μL）、dNTP浓度（三水平：0．10、0．20、0．30mmol／L）和引物（primer）浓度（三水平；0．16、0．32、0．48pmol／L）的三因素实验，进行PCR扩增。根据PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图确定最优的Taq酶浓度、dNTP浓度和引物浓度。进一步没计Mg^2＋浓度（三水平：1．0、1．5、2．0mmol／L）和模板浓度（四水平：1．00、1．25、1．50、1．75mg／L）的两因素实验，进行PCR扩增，确定最佳Mg^2＋浓度和模板浓度。结果：三因素实验中，第17条组合泳道和两因素实验中第6条组合泳道扩增主带稳定、均匀、清晰，条带数日多。结论：确定红花随机扩增多态性DNA反应25μL反应体系中最佳组合为：Taq酶0．04 U／μL、dNTP0．30mmol／L、引物0．32pmol／L、Mg^2＋ 1．5mmol／L、模板浓度1．00mg／L。     

Activation of dioxin response element (DRE)-associated genes by benzo(a)pyrene 3,6-quinone and benzo(a)pyrene 1,6-quinone in MCF-10A human mammary epithelial cells

Benzo(a)pyrene (BaP) is a known human carcinogen and a suspected breast cancer complete carcinogen. BaP is metabolized by several metabolic pathways, some having bioactivation and others detoxification properties. BaP-quinones (BPQs) are formed via cytochrome P450 and peroxidase dependent pathways. Previous studies by our laboratory have shown that BPQs have significant growth promoting and anti-apoptotic activities in human MCF-10A mammary epithelial cells examined in vitro. Previous results suggest that BPQs act via redox-cycling and oxidative stress. However, because two specific BPQs (1,6-BPQ and 3,6-BPQ) differed in their ability to produce reactive oxygen species (ROS) and yet both had strong proliferative and EGF receptor activating activity, we utilized mRNA expression arrays and qRT-PCR to determine potential pathways and mechanisms of gene activation. The results of the present studies demonstrated that 1,6-BPQ and 3,6-BPQ activate dioxin response elements (DRE, also known as xenobiotic response elements, XRE) and anti-oxidant response elements (ARE, also known as electrophile response elements, EpRE). 3,6-BPQ had greater DRE activity than 1,6-BPQ, whereas the opposite was true for the activation of ARE. Both 3,6-BPQ and 1,6-BPQ induced oxidative stress-associated genes (HMOX1, GCLC, GCLM, and SLC7A11), phase 2 enzyme genes (NQO1, NQO2, ALDH3A1), PAH metabolizing genes (CYP1B1, EPHX1, AKR1C1), and certain EGF receptor-associated genes (EGFR, IER3, ING1, SQSTM1 and TRIM16). The results of these studies demonstrate that BPQs activate numerous pathways in human mammary epithelial cells associated with increased cell growth and survival that may play important roles in tumor promotion.     

急性白血病多药耐药性检测的临床应用

目的 探讨急性白血病（急白）患者多药耐药基因（ＭＤＲ１）表达的临床意义放应用。方法 对３５例初治急白患者采用Ｓ－Ｐ免疫组化染以法检测ＭＤＲ１表达产物,地部分患者进行动态观察并配合药敏测定,了解急白患者化疗前后耐药情况的变化。结果 本组３５例ＭＤＲ,表达阳性者１４例（４０％）,其中急性淋巴细胞白血病（急淋）９便,急性晨淋巴细胞白血病（急非淋）５例,两者无显著差异,１４例ＭＤＲ１表达阳性者,达完全缓解     

磷酸二酯酶基因和5-脂氧合酶激活蛋白基因多态性与脑梗死的关联性研究

目的：研究磷酸二酯酶基因（PDE4D）和5-脂氧合酶激活蛋白基因（ALOX5AP）多态性与脑梗死（CI）的关联性。方法采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）检测PDE4D基因SNP83/SNP87位点和基因ALOX5AP的SG13S100/SG13S114位点的基因多态性,结合问卷调查结果分析基因多态性与CI的相关性。结果CI发病流行因素包括高年龄、高血压、高胆固醇血症和心房颤动,287例CI组与300名对照组中PDE4D基因SNP83位点的C/T分布、ALOX5AP基因的SG13S100位点的A/G分布、SG13S114位点的T/A分布差异均具有统计学意义（ P＜0．05）, SNP87C/T分布差异无统计学意义。结论 CI分布的遗传危险因素包括SNP83C/T、SG13S100 A/G、SG13S114 T/A三种基因位点多态性的变化。     

Molecular mechanisms of tolerance to and withdrawal of GABA(A) receptor modulators.

Here, we summarize recent data pertaining to the effects of GABA_A receptor modulators on the receptor gene expression in order to elucidate the molecular mechanisms behind tolerance and dependence induced by these drugs. Drug selectivity and intrinsic activity seems to be important to evidence at the molecular level the GABA_A receptor tolerance. On the contrary, we suggested that all drug tested are equally potentially prone to induce dependence. Our results demonstrate that long-lasting exposure of GABA_A receptors to endogenous steroids, benzodiazepines and ethanol, as well as their withdrawal, induce marked effects on receptor structure and function. These results suggest the possible synergic action between endogenous steroids and these drugs in modulating the functional activity of specific neuronal populations. We report here that endogenous steroids may play a crucial role in the action of ethanol on dopaminergic neurons.     

抗癌活性肽对胆囊癌GBC-SD细胞作用前后的基因表达谱研究

目的研究抗癌活性肽对人胆囊癌细胞系GBC-SD细胞作用前后的基因表达谱,筛选与抗癌活性肽作用相关的基因表达改变。方法将1152条人类全长基因的PCR产物按微矩阵排列点样于特殊处理的玻片上制备成表达谱芯片;按一步法抽提抗癌活性肽作用前后体外培养的胆囊癌细胞的RNA并纯化mRNA,通过逆转录用两种荧光cy3-dUTP和cy5-dUTP标记对照和实验组胆囊癌细胞cDNA,制成cDNA探针并与表达谱芯片杂交,用ScanArray4000扫描仪扫描芯片上两种荧光信号,计算机分析判定差异表达的基因。结果在1152条基因中筛选出有差异表达的基因245条,其中上调的121条,下调的124条。结论利用本基因表达谱芯片可同时研究数以千计的基因表达水平,从而在基因水平上探讨抗癌活性肽对胆囊癌GBC-SD细胞作用的机制。     

血管紧张素原基因M235T多态性与冠心病关系的研究

目的　探讨中国苏皖地区人群血管紧张素原（AgT）基因型的分布及其与冠心病（CHD）的关系。方法　应用突变基因分离聚合酶链（MS-PCR）技术,对106例CHD患者、56例冠状动脉造影正常者以及30名健康献血员AgT基因M235T多态性进行检测。结果　病例组和对照组AgT基因型总体分布无显著差异,而病例组T等位基因频率（0.788）显著高于对照组（0.698）（P＜0.05）。结论　AgT基因M235T多态性中T等位基因是中国苏皖地区人群CHD发病的危险因素之一。     

血管紧张素转换酶抑制剂所致咳嗽与血管紧张素转换酶基因多态性的关系

为了探讨血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）所致咳嗽与血管紧张素转换酶（ACE）基因多态性的关系,应用聚合酶链反应（PCR）方法,检测52例由于服用ACEI引起的咳嗽患者及70例未发生咳嗽的患者ACE基因的插入（Ⅰ）／缺失（D）多态性,并采用紫外法检测ACE活性。结果发现在ACEI引起咳嗽组Ⅱ型占46．2％,而无咳嗽组为30．0％,两组相比其差异具有统计学意义（P＜0．05）;咳嗽组ACE活性低于无咳嗽组（P＜0．01）。提示：ACEI所致咳嗽与ACE基因多态性有关,ACE基因多态性的分析有助于ACEI的合理使用。