刺五加钙调蛋白基因的克隆及内生真菌对其表达的影响

目的:克隆刺五加的钙调蛋白(calmodulin,CaM)基因,并分析内生真菌对其表达的影响。方法:采用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆刺五加CaM基因的全长cDNA序列。通过RT-PCR法检测可显著提高刺五加皂苷含量的内生真菌菌株P116-1a,P116-1b,P109-4,P312-1对CaM表达的影响。结果:刺五加CaM基因的cDNA全长为856 bp,开放阅读框长450 bp,编码149个氨基酸的蛋白,与人参Panax ginseng和胡萝卜Daucus carota等物种的CaM同源性均高达100%。RT-PCR的结果显示,内生真菌可显著提高刺五加CaM基因的表达量(P<0.05),最大表达量出现在菌株P109-4回接90 d时,达对照的2.96倍。结论:首次克隆并报道了刺五加CaM的cDNA全长序列,并证实内生真菌可显著提高刺五加CaM基因的表达量,为阐明内生真菌提高刺五加三萜皂苷含量的机制奠定了基础。     

刺五加β-香树酯醇合成酶基因的克隆及其表达与皂苷量的相关性

目的克隆刺五加的β-香树酯醇合成酶(β-amyrin synthase,bAS)基因,并分析其表达对皂苷量的影响。方法利用同源克隆法克隆刺五加的bAS基因。利用Real time PCR技术,分析刺五加bAS基因的表达规律,分光光度法测定总皂苷量。结果克隆到cDNA长度分别为1223、1226 bp的刺五加bAS1、bAS2基因。bAS1和bAS2基因在各时期和器官中均有表达,但表达量差异显著(P0.05)。bAS1基因在萌芽期的表达量最高,之后迅速降低,并基本维持恒定。在整个生长期中bAS2表现出低→高→低的表达特点。bAS1基因在各器官中的表达量基本恒定,bAS2基因在叶片中的表达量最高。茉莉酸甲酯(MeJA)处理后,bAS1基因的表达未发生显著变化,bAS2的表达量显著上升。刺五加的皂苷量与bAS2呈极显著的正相关关系(P0.01),bAS1基因未达显著水平。结论 bAS2可能是催化刺五加三萜皂苷生物合成的关键酶。     

刺五加亚精胺合成酶基因的克隆及内生真菌对其表达的影响

目的 克隆刺五加亚精胺合成酶(spermidine synthase,SPDS)基因,并分析内生真菌对其表达的影响.方法 采用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆刺五加SPDS基因全长cDNA序列.运用生物信息学方法对该基因进行分析.RT-PCR法检测内生真菌菌株P116-1a、P116-1b、P109-4和P312-1对SPDS基因表达的影响.结果 刺五加SPDS基因的cDNA全长为1 541 bp,开放阅读框长1 002 bp,编码333个氨基酸的蛋白,包含SPDS家族的基本结构和标志性序列.RT-PCR结果显示,内生真菌可显著提高刺五加SPDS基因的表达量(P＜0.05),最大表达量出现在菌株P116-1b回接90 d时,是对照的2.06倍.结论 首次克隆了刺五加SPDS基因的cDNA全长序列,并证实内生真菌可显著提高刺五加SPDS基因的表达,为阐明内生真菌提高刺五加三萜皂苷量的机制及刺五加的抗逆性改良奠定了基础.     

刺五加与其愈伤组织中皂苷合成关键酶基因表达的差异分析

目的:分析刺五加叶片、叶柄及其愈伤组织中SS、SE和bAS基因表达量的差异。方法:以刺五加叶片和叶柄为外植体,诱导获得愈伤组织。实时荧光定量PCR检测SS、SE和bAS基因的表达量。结果:刺五加SS、SE和bAS基因在刺五加叶片、叶柄及其愈伤组织中都有表达,SS、SE和bAS基因在叶片愈伤组织中的表达量分别为叶片中的89.3%、73.8%和83.4%,在叶柄愈伤组织中的表达量分别为叶柄中表达量的80.2%、87.7%和70.9%。结论:刺五加愈伤组织中SS、SE和bAS基因的表达量显著低于植株中的表达量。     

刺五加鲨烯合酶和鲨烯环氧酶基因单核苷酸多态性及其与总皂苷量的相关性研究

目的 筛选刺五加鲨烯合酶(SS)和鲨烯环氧酶(SE)基因存在的单核苷酸多态性(SNP)位点,分析各SNP位点与刺五加总皂苷量的相关性.方法 采用分光光度法测定刺五加总皂苷的量,并划分为具有显著差异(P＜0.01)的高、低量组;RT-PCR法扩增刺五加SS、SE基因,根据测序结果筛选SNP位点,利用R×C表的x2检验分析相关关系.结果 刺五加SS基因存在6处SNP,其中704 bp位点为错义突变,其他位点为同义突变,各位点均不与刺五加总皂苷量显著相关.SE基因存在9处SNP,其中导致错义突变的164、199、227、232 bp位点及同义突变的279、285 bp位点与刺五加总皂苷量显著相关(P＜0.05),其他位点为同义突变,与刺五加总皂苷量间无显著相关性.结论 刺五加SS和SE基因存在SNP,SE基因164～285 bp位点的AGAACG与刺五加总皂苷高量组显著相关,TAGTTC与低量组显著相关.     

刺五加P450基因的筛选及其表达对皂苷含量的影响

目的筛选和鉴定刺五加Eleutherococcus sentsicosu中的细胞色素P450基因(EsP450),分析其进化特征,探究其与刺五加总皂苷含量的相关性。方法根据转录组测序结果,筛选得到EsP450基因,并对其进行生物信息学分析与适应性进化分析,采用qRT-PCR法检测EsP450基因的表达量,采用分光光度计测定刺五加的总皂苷含量。结果筛选得到了 18条EsP450基因。刺五加P450蛋白不存在跨膜区域,二级结构以α-螺旋和无规则卷曲结构为主。EsP450基因不存在正选择位点。各EsP450间的表达量差异显著,部分基因表达量差值在10倍以上,7条EsP450基因的表达与皂苷含量呈正相关关系(P0.05)。结论鉴定出与刺五加总皂苷含量存在正相关关系的EsP450基因,EsP450基因在进化中受到纯净选择。     

温度调控对人参皂苷积累及其关键酶基因表达的影响

目的探究温度调控对人参皂苷积累及其合成途径关键酶基因表达量的影响。方法以培养23 d人参愈伤组织为实验材料,置于5、10、15、20、25、30℃6个培养箱中恒温培养,每天取样1次连续取样8 d,测定干、鲜质量和皂苷含量,确定响应敏感温度,以GAPDH为内参基因,real-timePCR检测皂苷合成途径中9个关键酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR2)、法尼基焦磷酸合成酶(FPS)、角鲨烯合成酶(SS1)、角鲨烯环氧酶(SE1)、达玛烷二醇合成酶(DS-Ⅱ)、β-香树素合成酶(PNY1)、β-香树素C-28位羟基化酶(CYP716A52v2)、原人参三醇合成酶(CYP716A53v2)、原人参二醇合成酶(CYP716A47)基因表达量。结果 20℃为人参愈伤组织干、鲜质量积累最佳温度,5、10、15℃皂苷含量2～3 d达到最大值,5℃为人参皂苷积累响应敏感温度,与对照组差异显著,人参皂苷Re、Rg1和总皂苷分别为对照组1.93、11.93和1.54倍。HMGR2、SS1、DS-Ⅱ、SE1和CYP716A52v2基因表达量在低温2～4d均达最大值,为对照组2.8、1.6、3....     

刺五加GPS基因克隆及表达特征与皂苷含量相关性研究

目的克隆刺五加香叶基焦磷酸合成酶(geranyl pyrophosphate synthase,GPS)基因的cDNA序列并分析基因序列特征、不同器官中基因表达水平及其与皂苷含量的相关性。方法提取刺五加的RNA,逆转录为cDNA。根据转录组测序结果中编码GPS的unigene(c37362.graph_c0),设计特异性引物,经过PCR扩增GPS基因的cDNA全长。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析GPS基因在不同器官中的表达水平,并通过分光光度法检测刺五加总皂苷含量。结果克隆得到长1260bp、编码419个氨基酸的刺五加GPS基因cDNA。GPS蛋白定位于线粒体内且不存在跨膜区域。GPS基因在各个器官中均有表达,在叶片中的表达量最高,是根中表达量的5.26倍。GPS基因的相对表达量与皂苷量呈现出同升同降的变化趋势,表现为显著正相关关系(r=0.851,P0.05)。结论首次克隆获得刺五加GPS基因的cDNA全长序列,明确了刺五加GPS基因的表达量与皂苷含量之间存在正相关关系。     

黄芪皂苷生物合成对短期水分变化的响应

以一年生盆栽膜荚黄芪为材料,探究水分变化对膜荚黄芪根中总皂苷、黄芪甲苷含量及关键酶基因表达量的影响。测定其黄芪甲苷、总皂苷含量,采用实时荧光定量PCR分析黄芪皂苷合成途径中8个关键酶乙酰辅酶A乙酰基转移酶(AATC)、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶(HMGS)、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)、异戊二烯焦磷酸异构酶(IDI)、法尼基焦磷酸合酶(FPS)、鲨烯合酶(SS)、鲨烯环氧酶(SE)、环阿尔庭烷合酶(CAS)基因表达量。结果表明,随着土壤水分的下降,黄芪甲苷及总皂苷含量呈增加趋势,在第15天达到最高,分别为1.46,6.80 mg·g~(-1);膜荚黄芪中8个关键酶基因对水分调控的响应方式各不相同,AACT,IDI,SS基因呈现先升高后降低再升高,复水后降低的变化趋势,HMGS,HMGR,FPS基因呈现持续增加复水后下降的趋势,而SE,CAS基因呈现先增加再降低,复水后继续降低的趋势。相关性分析显示,处理组HMGR基因与总皂苷含量呈极显著正相关,CAS基因与总皂苷含量呈显著负相关;FPS,SE,CAS基因与黄芪甲苷含量呈极显著负相关系。因此,HMGR,FPS,SE,CAS基因在水分调控下对黄芪皂苷含量调控作用明显,是主要调控基因。处理第15天,黄芪甲苷和总皂苷总量达到最高,可以定为最佳采收期。     

北柴胡不同部位柴胡皂苷含量与其关键酶基因表达量的相关性研究

目的筛选适宜北柴胡Bupleurum chinense表达分析的内参基因,并分析不同部位中柴胡皂苷含量与其关键酶基因表达的关系。方法以北柴胡根、茎、叶、果为实验材料,利用实时荧光定量PCR技术,选取Actin、α-tubublin、β-tubulin、Cyclophilin、EF-1α5个常用的内参基因作为候选,以筛选到的最适内参基因为参考分析北柴胡基因ACAT、FPS、HMGR、IPPI、PMD、PMK、SE、SS、β-AS、UGT1、UGT3、UGT6、UGT8、UGT10、P450-7、P450-12的组织表达模式,用HPLC法检测柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d的含量,并用SPSS软件进行相关性分析。结果以5个候选基因(EF-1α、Cyclophilin、Actin、β-tubulin、α-tubublin)中稳定性最好的EF-1α为内参基因,测定北柴胡16个关键酶基因表达量,表明ACAT、PMK、IPPI、SS、SE、UGT1、UGT3、UGT6、UGT8均在地上部分(茎、叶、果)表达量最高,HMGR、β-AS、P450-7、P450-12在根中表达量高于地上部分,PMD、FPS、UGT10则组织差异性不明显。以HPLC法检测柴胡皂苷含量在根中远高于地上部分(茎、叶、果)。相关性分析结果显示,16个关键酶基因间上游ACAT、HMGR、PMD、SE等多与下游P450-7、P450-12、UGT3、UGT6、UGT8等表现出了显著正相关(P0.05),表明关键酶基因相互间密切相关,共同调控柴胡皂苷合成。16个关键酶基因与柴胡皂苷含量的相关性分析结果显示:HMGR、P450-7、P450-12与3种皂苷总和呈极显著正相关(P0.01),β-AS与3种皂苷总和呈显著正相关(P0.05),且HMGR、β-AS、P450-7、P450-12与单体皂苷a、c、d含量均呈显著正相关(P0.05),这4个基因对于皂苷合成积累有重要影响。结论柴胡皂苷合成途径中HMGR、β-AS、P450-7、P450-12基因表达与柴胡皂苷合成积累具有一致性,在调控皂苷合成方面有重要作用。     

一株提高刺五加苷E含量内生真菌的鉴定及其作用机制初探

目的确定分离自刺五加的内生真菌P116-1a的分类地位,并初步明确其提高刺五加苷E含量的作用机制。方法应用形态学及ITS序列分析方法进行鉴定,将菌液回接刺五加浸出液进行发酵培养和将灭活后的菌液注射刺五加后,HPLC法分析刺五加苷含量的变化。结果 P116-1a与Penicillium minioluteum的形态学特征相符,且与其ITS序列同源性最高(98.6%)。在培养早期,活体P116-1a可显著提高刺五加浸出液中刺五加苷E的含量,灭活后其对刺五加苷E含量无显著作用。结论 P116-1a为Penicillium minioluteum,其作用方式为通过调节刺五加苷生物合成关键酶的表达、酶蛋白的活性而提高刺五加苷E的含量。     

刺五加环阿屯醇合酶基因的克隆及其表达分析

目的克隆刺五加的环阿屯醇合酶(cycloartenol synthase,CAS)基因,并对其进行生物信息学和表达分析。方法采用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNAends,RACE)技术克隆刺五加CAS基因的全长cDNA序列。运用生物信息学方法对该基因进行分析,预测其编码蛋白的结构与功能,并通过RT-PCR法检测CAS在不同生长发育时期和不同器官中的表达情况。结果刺五加CAS基因的cDNA全长为2 758 bp,开放阅读框长2 277 bp,编码758个氨基酸的蛋白,包含三萜合成酶的标志性序列。CAS蛋白无跨膜区域,定位于细胞质中。RT-PCR的结果显示,刺五加CAS基因在各时期和器官中均有表达,但表达量具有显著差异(P<0.05)。其中果实基本成熟期的表达量最高,是最低量萌芽期的1.56倍,各器官中,叶片的表达量最高,是最低量叶柄的1.37倍。结论首次分离并报道了刺五加的CAS cDNA克隆,并证实其在不同生长发育时期和不同器官中的表达量不同,为进一步研究CAS对刺五加皂苷量的影响和表达调控奠定基础。     

刺五加鲨烯环氧酶基因家族2成员表达特性的分析

刺五加的鲨烯环氧酶(SE)基因家族存在2个成员。 为了探明其表达特性,利用实时荧光定量PCR技术,分析刺五加SE1,SE2在不同生长发育时期、器官和茉莉酸甲酯(MeJA)处理对其表达及皂苷含量的影响。结果表明,刺五加SE2在各时期、器官中表达量均显著高于SE1。在整个生长期中SE1表现为低-高-低的特点,SE2则表现出随着生长的进行而显著降低的变化趋势,两者均在根中的表达量最低,MeJA处理对SE1的提升水平显著高于SE2。刺五加的皂苷含量与SE1表达量间的相关系数为0.858,呈显著的正相关关系(P<0.05),而SE2未达显著水平。说明SE1是催化刺五加三萜皂苷生物合成的关键酶。     

刺五加法尼基焦磷酸合酶基因的克隆、 生物信息学及表达分析

目的:克隆刺五加的法尼基焦磷酸合酶(farnesyl diphosphate synthase,FPS)基因,并对其进行生物信息学和表达分析.方法:采用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆刺五加FPS基因的全长cDNA序列.运用生物信息学方法对该基因进行分析,预测其编码蛋白的结构与功能.并通过RT-PCR法检测FPS在不同器官中的表达情况.结果:刺五加FPS基因的cDNA全长为1 499 bp,开放阅读框长1 029 bp,编码342个氨基酸的蛋白,包含2个富含天冬氨酸(DDXXD)的保守功能域.FPS蛋白无跨膜区域,定位于细胞质中.RT-PCR的结果显示,刺五加FPS基因在各器官中均有表达,但表达最具有显著差异(P＜0.05).结论:首次分离并报道了刺五加FPS的cDNA克隆,并证实其在不同器官中的表达量不同,为进一步研究FPS对刺五加皂苷合成的影响和表达调控奠定了基础.     

三七总皂苷生物合成的关键酶及其调控研究进展

三七总皂苷(Panax notoginseng saponins,PNS)属于达玛烷型三萜皂苷,是中国传统珍贵药材三七的主要活性成分。三七总皂苷对中枢神经系统、心脑血管系统和免疫系统具有较好的保护作用,并被广泛地用于衰老、肿瘤等疾病的治疗。对三七总皂苷生物合成中的关键酶如法呢基焦磷酸合酶(FPS)、鲨烯合成酶(SS)、鲨烯氧化酶(SE)、达玛烯二醇合成酶(DS)、环阿屯醇合成酶(CAS)、P450单加氧酶(CYP450)和糖基转移酶(GT)等在催化机制、基因克隆、转录水平的表达调控及其表达模式和表达组织和器官的特异性方面的研究进展进行综述,并首次总结了多态性和环境胁迫等在三七皂苷生物合成的基因表达调控中的作用,为应用代谢工程人工合成PNS提供依据。     

Biologically active triterpenoid saponins from Acanthopanax senticosus

Three new triterpenoid saponins, acanthopanaxosides A (1), B (7), and C (13), were isolated from the leaves of Acanthopanax senticosus, together with 12 known saponins. The structures of these new saponins were established as 3-O-beta-D-glucopyranosyl-(1-->2)-alpha-L-arabinopyranosyl-30-nor-olean-12,20(29)-dien-28-oic acid 28-O-alpha-L-rhamnopyranosyl-(1-->4)-6-O-acetyl-beta-D-glucopyranosyl-(1-->6)-beta-D-glucopyranosyl ester (1), 3-O-beta-D-glucopyranosyl-(1-->2)-alpha-L-arabinopyranosyl oleanolic acid 28-O-alpha-L-rhamnopyranosyl-(1-->4)-6-O-acetyl-beta-D-glucopyranosyl-(1-->6)-beta-D-glucopyranosyl ester (7), and 3-O-alpha-L-rhamnopyranosyl-(1-->2)-alpha-L-arabinopyranosyl-3beta-hydroxyolean-12-ene-28,29-dioic acid (13), on the basis of spectroscopic analysis and chemical degradation. Among the known compounds, sessiloside and tauroside H1 are reported for the first time from A. senticosus. The biological activity of compounds 1-15 was examined against pancreatic lipase. Ciwujianoside C1 (6), tauroside H1 (11), 3-O-alpha-rhamnopyranosyl-(1-->2)-alpha-arabinopyranosyl mesembryanthemoidigenic acid (12), acanthopanaxoside C (13), sessiloside (14), and chiisanoside (15) inhibited pancreatic lipase activity in vitro. In turn, ciwujianosides C2 (3), D2 (5), C4 (8), and C3 (10) and hederasaponin B (9) enhanced this enzyme.     

刺五加鲨烯环氧酶基因cDNA的克隆及序列分析

目的:对刺五加鲨烯环氧酶基因的cDNA进行克隆及序列分析。方法:采用改良的异硫氰酸胍法提取刺五加总RNA,逆转录为cDNA,根据已报道的人参SE基因cDNA序列设计引物,利用RT-PCR法克隆刺五加SE基因的cDNA序列。结果:克隆了2个序列不同的cDNA(SE1和SE2),开放阅读框分别长1 665,1 629 bp,分别编码554,542个氨基酸。SE1,SE2间的核苷酸和氨基酸一致性分别为91.49%,92.55%,两者与三七SE1的氨基酸序列相似性最高,分别为93.45%,94.87%。SE1,SE2均含有1个FAD结合区域,SE1,SE2推测的氨基酸分别存在2个和4个跨膜螺旋。结论:首次分离并报道了刺五加的2个SE基因cDNA序列,为刺五加的次生代谢工程研究奠定了基础。