乙型肝炎病毒基因的巢式聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分型及初步应用

目的 用改进的乙型肝炎病毒(HBV)巢式聚合酶链反应—限制性片段长度多态性(PCR—RFLP)的基因分型方法初探广州地区HBV基因型分布状态。方法 设计巢式PCR扩增前S基因，经限制性内切酶AvaⅡ和DpnⅡ酶切鉴别HBV A—G基因型；并对140份乙型肝炎患者血清进行基因分型，其中随机挑选3份进行克隆测序，并对20份患者血清进行巢式PCR—RFLP重复分型试验，以验证此分型技术的稳定性和特异性。同时采用PCR和巢式PCR对92份乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)阴性血清进行HBV DNA阳性率检测比较。结果 基因分型与测序结果一致；基因分型重复试验符合率100％；92份HBeAg阴性血清经PCR和巢式PCR扩增HBV DNA的阳性率分别为20．7％和68．5％。140份乙型肝炎患者血清中HBV基因型以C型(94份)和B型(42份)为主，偶见A型(4份)。结论 巢式PCR—RFLP HBV基因分型方法具有良好的敏感性、特异性、稳定性，且操作简便，适用于临床和流行病学调查研究。     

聚合酶链反应-序列特异性引物在精神疾病大样本多基因分型检测中的应用

背景聚合酶链反应限制性片段长度多态性分析不适合临床的快速检测应用,也不适合对精神疾病候选基因作大样本量、多个基因的检测分析,而聚合酶链反应-序列特异性引物可能弥补其不足之处.目的建立多个基因多态性分型的聚合酶链反应-序列特异性引物,认识其在精神疾病分子研究水平中的应用.设计观察实验.单位新乡医学院分子生物研究室和病理生理教研室.材料实验于2005-12/2006-10在新乡医学院分子生物研究室完成.精神疾病患者血样200份,0.5 mL/份,由新乡医学院第二附属医院提供.患者对本实验均知情同意.方法应用聚合酶链反应-序列特异性引物的方法分析以下基因的多态性TNFα-308A/G和-238G/A变异,IL-6-174G/C变异,CYP2D6*10B外显子第188位的C/T变异,COMT基因的第472位编码序列的G/A变异,MAOA基因位于第8外显子CDNA顺序的第941位点的G/T变异.主要观察指标聚合酶链反应-序列特异性引物分析患者血样的基因多态性.结果TNFα-308A/G位点可检测到的基因型有G/G和A/GTNFα-238G/A位点可检测到的基因型有G/A,G/G和A/A;IL-6-174G/C变异位点可检测到的基因型均为G/G纯合子;CYP2D6 *10B外显子第188位的C/T位点可检测到的基因型为C/C,C/T和T/T;COMT基因的第472位编码序列的G/A变异位点可检测到的基因型为A/G,A/A和G/G;MAOA基因位于第8外显子CDNA顺序的第941位点的G/T变异可检测到的基因型为T/G,T/T和G/G.结论聚合酶链反应-序列特异性引物适合对大样本、多个基因的单核苷酸位点变异进行多态性分析,成本低、快速、准确,可用于精神疾病分子水平的研究.     

云南昆明地区乙型肝炎病毒基因亚型与血清亚型研究

目的研究云南乙型肝炎（HB）病毒基因亚型与血清型的分布情况。方法对云南97例乙型肝炎病毒（HBV）毒株S基因进行序列测定,通过Genebank HBV基因型分析网站确定毒株的基因型。通过序列比较、基因进化树的构建和相应位点特异氨基酸和核苷酸确定云南HBV毒株基因亚型和血清亚型。结果在所测的97例标本中,云南流行的HBV毒株有B基因型（75%）和C基因型（25%）,没有发现其它基因型和基因混合型。B基因型有血清型adw2（占88%）和ayw1（12%）;C基因型中以adrq＋（96%）为主,仅1例为adw2（4%）。云南HBV B基因存在B2、B1、B4和B5亚型,其中以B2亚型为主,C基因型全为C2亚型。云南HBV C基因型毒株有其特异的核苷酸分布位点。结论云南HBV B基因型毒株与国内外参考株在S基因区没有显著的特异位点核苷酸分布,而C基因型则有显著的自身特征。     

乙肝病毒基因变异和基因型(亚型)与肝细胞癌的关系

目的 初步探讨乙肝病毒基因变异、基因型及亚型与HCC发病的相关性。 方法 特异探针杂交法检测乙肝病毒C启动子变异，分别用特异探针杂交和特异引物PCR两种方法鉴定病毒基因型，限制性酶切片段长度多态性法鉴定部分HCC乙肝病毒的基因亚型。用SPSS10.0进行统计分析其中相关性。 结果 HCC组与NHCC组HBV-DNA载量无显著差异，两组HBV中A1762T/G1764A变异株分别占77.8%和44.4%。B和C型为HBV主要基因型，基因型B和C在HCC患者中分别为3例（11.11%）和24例（88.89%），在NHCC患者中分别为29例（42.65％）和21（50.85％），HCC组24例基因型C的HBV中21例为C2亚型。 结论 乙肝病毒C启动子A1762T/G1764A双变异、基因型C与HCC的发生密切相关，HCC患者HBV基因亚型主要为C2亚型。     

聚合酶链反应-序列特异性引物在精神疾病大样本多基因分型检测中的应用(英文)

背景:聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析不适合临床的快速检测应用,也不适合对精神疾病候选基因作大样本量、多个基因的检测分析,而聚合酶链反应-序列特异性引物可能弥补其不足之处。目的:建立多个基因多态性分型的聚合酶链反应-序列特异性引物,认识其在精神疾病分子研究水平中的应用。设计:观察实验。单位:新乡医学院分子生物研究室和病理生理教研室。材料:实验于2005-12/2006-10在新乡医学院分子生物研究室完成。精神疾病患者血样200份,0.5mL/份,由新乡医学院第二附属医院提供。患者对本实验均知情同意。方法:应用聚合酶链反应-序列特异性引物的方法分析以下基因的多态性:TNFα-308A/G和-238G/A变异,IL-6-174G/C变异,CYP2D6*10B外显子第188位的C/T变异,COMT基因的第472位编码序列的G/A变异,MAOA基因位于第8外显子CDNA顺序的第941位点的G/T变异。主要观察指标:聚合酶链反应-序列特异性引物分析患者血样的基因多态性。结果:TNFα-308A/G位点可检测到的基因型有G/G和A/G;TNFα-238G/A位点可检测到的基因型有G/A,G/G和A/A;IL-6-174G/C变异位点可检测到的基因型均为G/G纯合子;CYP2D6*10B外显子第188位的C/T位点可检测到的基因型为C/C,C/T和T/T;COMT基因的第472位编码序列的G/A变异位点可检测到的基因型为A/G,A/A和G/G;MAOA基因位于第8外显子CDNA顺序的第941位点的G/T变异可检测到的基因型为T/G,T/T和G/G。结论:聚合酶链反应-序列特异性引物适合对大样本、多个基因的单核苷酸位点变异进行多态性分析,成本低、快速、准确,可用于精神疾病分子水平的研究。     

多对型特异性引物巢式PCR检测乙型肝炎病毒基因型分析

目的采用多对型特异性引物通过巢式PCR法检测HBeAg阳性患者血清中乙肝病毒(HBV)基因型的分布情况。方法根据从前S1基因到S基因中的保守序列设计出10条内外引物,并将其中8条内引物分成A、B两组分别扩增A、B、C和D、E、F型HBV,然后将第2轮PCR的两组产物分别用3%琼脂糖进行电泳,根据PCR产物片段大小直接判定HBV基因型。用该法检测15例慢性乙肝患者血清中HBV基因型,了解HBV基因型分布情况。结果 HBV基因分型结果为B型7例(46.7%)、C型4例(26.7%)、B+C型2例(13.3%),另有2例未能分型。结论人群HBV优势基因型以B型为主,C型次之。     

乙型肝炎病毒基因分型的研究进展

自从1988年Okamoto等首次根据组间全基因序列差异≥8%对HBV进行基因分型以来,对HBV基因分型方法学上的改进、和其所存在的地域性、民族特异性、以及它的临床意义都展开了大量研究,这对从分子水平阐明不同基因型的流行势态,和对其病因学的研究,加强对HBV的防治有重要意义.基因型反映了HBV自然感染史发生的变异特点,是病毒变异进化的结果,对其分型标准的依据是全基因序列同源性≥92%或S基因序列同源性≥96%.大量HBV序列分析工作提示S基因序列稳定,不同基因型各开放读框中S基因异质性最大,而同一基因型中的各毒株S基因异质性最小,因而S基因适于基因型分型.目前HBV基因型分型方法学有4种,可将其分为A、B、C、D、E、F、G等7种.其分型方法包括1、全基因或S基因测序法,该方法是鉴定基因型的金标准,但工作量大.2、Lindh等创立的S基因的聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）法,可鉴定89%的基因型,国内文献[1]报道对PCR-RFLP方法进行了改进,可鉴定95%以上的标本,但PCR-PFLP分型法所需时间较长、步骤较多,且遇到混合感染或酶切不完全,就会出现复杂带型,因此目前建立的PCR-PFLP分型方法都不能鉴定100%的标本.3、多引物PCR分型方法[2],它是在对114例HBV全序列进行充分比较分析的基础上,找出每种基因型相对于其他各种基因型的独特序列,并根据这些独特序列设计出6对分别针对性A-F型的诊断引物,利用其仅需一次PCR可得出分型结果,理论上能鉴定100%的标本.4、单克隆抗体酶联免疫吸附法,该方法虽然简便,但要建立一套单克隆抗体则较为困难,且难以从基因水平上对HBV进行分型.HBV的基因型分布在不同地理区域有不同的特点.     

简便HBV基因型S基因PCR-RFLP分型方法的建立

目的 建立简便HBV基因型S基因PCR-限制性片段长度多态性(RFLP)分型方法(以下简称“简便PCR-RFLP法”),并评价其临床应用价值.方法 临床诊断研究.查阅并比较GenBank中128株HBV(基因型A～D型)S基因片段(S区nt253-687),设计限制性内切酶Hinf Ⅰ、Ear Ⅰ、Apo Ⅰ鉴别A～D基因型分型方法,并评价简便PCR-RFLP法检测HBV DNA的最低检测下限、重复性;然后,用该方法检测50例慢性乙型重型肝炎患者的HBV基因型,同时用直接测序法验证简便PCR-RFLP法检测HBV基因型的一致性.结果 建立了简便PCR-RFLP法HBV基因分型的方案,通过限制性内切酶Hinf Ⅰ一次酶切就可分出我国流行的B型、C型、D型等毒株及B/C混合型.随机抽取3份标本,不同稀释浓度下,用简便PCR-RFLP法重复检测HBV基因型,分型结果均与原血清完全一致,且最低检测下限约为7 ～9 IU/ml.经Hinf Ⅰ酶一步酶切后,用简便PCR-RFLP法从50例患者标本中,检出B型23份、C型10份;经直接测序法验证,从PCR产物中检出B型23份、C型10份,2种方法检测B、C型基因结果完全一致(Kappa=1.00,P=0.001),简便PCR-RFLP法检出B/C混合型9份,优于PCR产物直接测序法(0份,x2=18.00,P=0.001).Hinf Ⅰ酶一步酶切后分出的ABD型8份,进一步酶切及应用PCR产物直接测序法检测均为B型变异株.结论 建立的简便PCR-RFLP法对HBV基因分型有较高的灵敏度和重复性,且在检出混合基因型方面具有优势,更为简便.     

乙型肝炎病毒基因分型的研究进展

自1988年Okamoto等[1]首次根据组间全基因序列差异≥8%对HBV进行基因分型以来,对从分子水平阐明不同HBV基因型的流行势态和病因研究不断深入。 1 HBV基因型分型方法 目前HBV基因型分型方法学有4种,可将其分为A、B、C、D、E、F、G等7种。其分型法包括：（1）全基因或S基因测序法,该方法是鉴定基因型的金标准,但工作量大。（2）Lindh等[2]创立的S基因的聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）法,可鉴定89%的基因型,但需时间较长、步骤较多,且遇到混合感染或酶切不完全,就会出现复杂带型,不能鉴定100%的标本。（3）多引物PCR分型方法[3],找出每种基因型相对于其他各基因型的独特序列,并根据这些独特序列设计出6对分别针对A-F型的引物,利用其仅需一次PCR可得出分型结果,理论上能鉴定100%的标本。（4）单克隆抗体酶联免疫吸附法[4],该方法虽然简便,但要建立一套单克隆抗体则较为困难,且难以从基因水平上对HBV进行分型。     

用序列特异性引物多聚酶链反应的方法进行大样本、多基因的多态性鉴定

目的:建立多个基因同时进行多态性分析的序列特异性引物多聚酶链反应的方法,以满足其在临床检验中进行基因多态性鉴定时的应用。方法:实验于2005-10/2006-05于河南省新乡医学院分子生物研究室完成。进行临床普通血液常规检测的患者血样200份(由新乡医学院第三附属医院提供),采用临床血样,提取DNA后采用多聚酶链反应扩增,并以扩增后的样品进行琼脂糖凝胶电泳,以是否出现相应的扩增条带作为基因分型的标准。应用优化后的序列特异性引物多聚酶链反应的方法分析以下基因的多态性:肿瘤坏死因子α-308A/G和-238G/A变异、白细胞介素6-174G/C变异、细胞色素P4502D6(CYP2D6)*10B外显子第188位的C/T变异。并由此优化序列特异性引物多聚酶链反应的方法,以达到应用同一个多聚酶链反应扩增程序,可同时对多个基因、多个临床样本的基因多态性同时进行分析,且基因型清晰,分型快速、准确。结果:①用20 g/L的琼脂糖凝胶电泳可看到每泳道内可有2条或1条扩增产物,其中阳性对照β珠蛋白基因的扩增片段长268 bp,此条带可以出现、减弱或者不出现。②其中肿瘤坏死因子α-308A/G存在G/G和A/G两种基因型;肿瘤坏死因子α-238G/A位点可检测到的基因型有G/A、G/G和A/A3型;白细胞介素6-174G/C变异位点可检测到的基因型均为G/G纯合子;细胞色素P4502D6*10B外显子第188位的C/T位点可检测到的基因型为C/C、C/T、T/T3型。结论:优化后的序列特异性引物多聚酶链反应适合对大样本,多个基因的单核苷酸位点变异进行多态性分析,快速、准确、成本低。     

昆明、洛阳两地献血者人群HBV携带者的HBV基因型分布

目的调查昆明、洛阳两地献血者人群HBV携带者HBV基因型的分布情况。方法采用多对型特异性引物,以套式PCR的方法对两地367份献血者HBsAg筛查阳性样本分型,根据HBV前s1基因和s基因区域内的保守序列设计出10条引物(2条外引物、8条内引物),并将其中8条内引物分为Ⅰ、Ⅱ组,分别扩增A、B、C和D、E、F型HBV基因片段;将第2轮PCR产物做琼脂糖电泳,根据PCR产物片断大小判定基因型;分型结果以s基因直接测序法验证。结果昆明279份样本中成功分型214例,分型成功率76.7%,其中B型69例(32.2%),C型103例(48.1%),B、C混合型41例(19.2%);D型1例(0.5%);洛阳献血者的88份样本中成功分型72例,分型成功率81.8%,其中B型10例(13.9%),C型46例(63.9%),B、C混合型16例(22.2%)。经s基因测序法验证,该分型方法准确可靠。结论昆明、洛阳两地献血者人群中HBV携带者HBV基因型均以C型为主,并有一定比例的B型和B、C混合型,仅在昆明献血者中发现1例D型,未见A、E、F型。     

INNO-LiPA乙型肝炎病毒基因分型方法的评价

目的　评价INNO LiPA乙型肝炎病毒基因分型的方法 ,并探讨了基因型与临床疾病的关系。方法　随机选取 113例慢性HBV感染者外周血采用INNO LiPA和S基因序列分析两种方法测定HBV基因型。结果　 1 INNO LiPA基因分型法与S基因序列分析法测定的基因型结果比较 ,符合率 82 3% (93/ 113) ,误判率 3 5 % (4/ 113) ,B/C型混合感染检出率 5 3% (6 / 113)。 2 LC组和HCC组C基因型比率高于AsC组 ,差异有显著性 (分别为 92 9%比 5 2 8% ,X2 =7 0 3,P <0 0 1和 88 9%比 5 2 8% ,X2 =3 91,P <0 0 5 ) ;LC组C基因型比率高于CHB组 ,差异有显著性 (92 9%比 6 1 1% ,X2 =5 12 ,P <0 0 5 )。结论　 1 INNO LiPA法是一种较灵敏的快速检测HBV基因型的实验方法 ,尤其检测混合基因型感染灵敏度高。 2 C基因型HBV感染与较重肝病有关。     

Lack of interferon sensitivity-determining region in the genome of hepatitis B virus genotype Ba

BACKGROUND/AIMS: In chronic hepatitis B, both host and viral factors may predict the response to interferon (IFN) treatment. Whether IFN sensitivity-determining regions exist within the hepatitis B virus (HBV) genomic background remains largely unknown. We therefore performed full-length viral genomic comparison between HBVs obtained from IFN responders and non-responders. METHODS: We enrolled 18 HBV genotype Ba patients who had received 24-week IFN 5 MU three times weekly and were followed monthly for 12 months post-treatment. There were 10 responders and eight non-responders. Pretreatment full-length viral nucleotide consensus sequence was obtained. In six non-responders and four responders, post-treatment viral nucleotide sequence was further compared with their corresponding pre-treatment specimens. In addition, the average number of nucleotide substitutions of the HBV quasispecies was compared between three responders and three non-responders. RESULTS: HBV nucleotide consensus sequence was identical between responders and non-responders. We found 0-15 (mean 7.7) nucleotide substitutions in the post-treatment HBV genome in the six non-responders and 0-14 (mean 3.8) nucleotide substitutions in the four responders, respectively. Genetic complexity of HBV quasispecies was comparable between responders and non-responders. CONCLUSIONS: Our results suggest that an IFN sensitivity-determining region might not exist within the genome of HBV genotype Ba. Host factors and virus-host interactions may be more important in determining the response to IFN treatment.     

Co-infection with hepatitis B virus genotype D and other genotypes in Western Japan

OBJECTIVE: Genotypes B and C are the prevalent hepatitis B virus (HBV) genotypes in eastern Asia. Although very rare in this region of the world, genotype D was found to be prevalent in a small area of western Japan. In this study, we confirm the frequency and clinical significance of co-infection with different genotypes among patients from that area infected with genotype D. METHODS: Twenty-three patients from the same area of western Japan infected with HBV genotype D, determined using a genotyping enzyme immunoassay, were studied. Cloning was done using DNA extracted from serum samples, and polymerase chain reaction assays with the restriction fragment length polymorphism for HBV genotyping were performed with 10 clones from each patient. RESULTS: Four (17.4%) of the 23 patients were found to be co-infected with HBV genotype C, and the HB surface antigen subtype was ayw in both mono- and co-infected patients. No clinical differences were found between mono-infected and co-infected patients carrying genotype D. CONCLUSION: A significant number of patients from the study area found to be infected with HBV genotype D were co-infected with genotype C. Additional study with a larger number of patients is needed to elucidate the possible clinical significance.     

222 base pairs in NS5B region and the determination of hepatitis C virus genotype 6

OBJECTIVE: The present study was performed to genotype hepatitis C virus (HCV) by direct sequencing of a 222-bp nucleotide in the NS5B region and comparing the results with those of direct sequencing in the core region. We investigated a new region for HCV genotyping which gave the best performance to discriminate HCV genotype 6a, the unique genotype found in Southeast Asia. METHODS: Plasma samples taken from 57 HCV-infected blood donors were used in this study. RT-PCR products were amplified using primers located in the NS5B region. The 222-bp PCR products were purified and sequenced. The genotype of HCV isolates were obtained by phylogenetic analysis and compared with HCV reference strains stored in the GenBank database. The HCV sequences clustering in the same node were considered to be of the same genotype. RESULTS: Thirty-one, 22 and 4 samples of HCV genotype 3a, 1a and 1b, respectively, were analyzed by this method. Upon comparison with genotyping in the core region, 86 and 14% of the samples yielded concordant and discordant genotype results, respectively. The majority of discordant results (63%; 5 of 8) was observed with HCV genotype 6a which yielded 6a upon core sequencing as opposed to 1a or 3a upon NS5B sequencing. CONCLUSION: HCV genotype 6a obtained by direct sequencing in the core region could not be unequivocally arrived at by sequencing 222 bp in the NS5B region. Hence, sequencing in the core region is preferable for genotyping our specimens, even though longer PCR products are required as this method enables discrimination between genotype 6a and the remaining genotypes.     

白细胞介素-18基因多态性与肺结核病易感性的关系

目的：通过病例-对照研究,探讨白细胞介素-18（IL-18）基因启动子区-607C/A、-137G/C位点单核苷酸多态性（SNP）与肺结核病的关系。方法：采用序列特异性引物PCR（PCR-SSP）及测序技术检测深圳地区汉族人群肺结核患者200例及健康对照者197例IL-18启动子区-607 C/A 、-137G/C位点多态性基因型。采用直接计数法计算各组基因型频率及等位基因频率,进行χ2 检验。以P值＜0.05为具有统计学意义。结果：肺结核患者IL-18启动子区-607位点A/A纯合子、A/C杂合子、C/C纯合子基因型频率分别为19.5%、55.0%、25.5% ;A、C等位基因频率分别为47.0%、53.0%。健康对照者A/A纯合子、A/C杂合子、C/C纯合子基因型频率分别为22.8%、46.7%、30.5%;A、C等位基因频率分别为46.2%、53.8%。两组人群-607位点基因型及等位基因分布无明显差异(P>0.05)。肺结核患者IL-18启动子区-137G/C位点C/C纯合子、C/G杂合子、G/G纯合子基因型频率分别为4.5%、18.5%、77.0%;C、G等位基因频率分别为13.8%、86.2%。健康对照者C/C纯合子、C/G杂合子、G/G纯合子基因型频率分别为5.6%、25.9%、68.5%;C、G等位基因频率分别为18.5%、81.5%。两组人群-137位点基因型分布无明显差异(P>0.05)。结论：IL-18启动子区-607、-137位点基因多态性与中国汉族人群肺结核病易感性无关。     

A score method for comparison of partial genomic regions in their representatives of full-length genome of hepatitis E virus for genotyping

In this article, a statistical score method for comparison of partial genomic regions in their representatives of full-length genome of hepatitis E virus (HEV) for genotyping was developed. The critical values of the statistics for hypothesis testing were generated through Monte Carlo simulations. It was found that fragment III might be a statistically representative region for the whole genome of HEV for genotyping. Based on both the full-length sequence and fragment III, the same four genotypes were identified by the subsequent phylogenetic analysis, and similar ranges of mean nucleotide difference were also observed to differentiate HEV sequences at the three levels genotype, subtype and isolate, which further verified the statistical results. It may be concluded from this study that the score method is effective for comparing partial genomic regions with full-length genome of HEV strains for genotyping.     

HBV基因型和阿德福韦酯疗效之间关系的初步研究

目的:探讨HBV基因型和阿德福韦酯疗效之间的关系。方法:选取应用阿德福韦酯10mg/d进行抗病毒治疗48周的37例慢性乙型肝炎患者作为研究对象。从患者血清中提取HBV DNA,然后扩增S基因片段,对S基因测序后与已知各HBV基因型S基因序列用生物软件进行同源性比较后构建系统发生树,分析基因型。在对阿德福韦酯疗效进行评价的基础上,分析HBV基因型和阿德福韦酯疗效间的关系。结果:37份样本中有23份属于HBV基因型B,有14份属于HBV基因型C。阿德福韦酯治疗48周时,HBV DNA有效抑制(较基线下降2log10以上)率和转阴(低于检测下限)率在基因型B分别为60·9%(14/23)和43·5%(10/23),在基因型C分别为71·4%(10/14)和42·9%(6/14),差异均无显著性(P分别为0·724、1·000);基因型B、C的ALT复常率分别为60·9%(14/23)和71·4%(10/14),差异无显著性(P=0·724);基因型B、C的HBeAg转阴率分别为31·8%(7/22)、38·5%(5/13),差异无显著性(P=0·726);基因型B、C的HBeAg血清转换率分别为9·1%(2/22)、23·1%(3/13),差异无显著性(P=0·337)。结论:本研究所观察的样本中,HBV基因B型和C型与阿德福韦酯的抗病毒疗效可能无关。由于本研究纳入的样本量相对较少,尚需扩大样本进行进一步的研究。