转染白喉毒素基因对人肺腺癌细胞的影响

目的　探讨白喉毒素A基因对人肺腺癌细胞 (A5 4 9)的影响。方法　对转染白喉毒素A基因的人肺腺癌细胞 (A5 4 9/DTA) ,转空载体的人肺腺癌细胞 (A5 4 9/DTA-)野生型A5 4 9细胞 ,采用MTT法测定四环素作用 72h后的细胞存活率。动物实验 :12只裸鼠随机分为转基因组、空载体组和对照组 ,每组 4只 ,将 1.2× 10 7A5 4 9/DTA细胞 ,A5 4 9/DTA-细胞及野生型A5 4 9细胞分别接种于相应的裸鼠皮下 ,给裸鼠饮含四环素(1μg/ml)的水 ,成瘤后 ,每周 2次测量瘤体大小 ,计算瘤体重量。 结果　A5 4 9/DTA细胞存活率较A5 4 9/DTA-细胞 ,A5 4 9细胞存活率明显下降 (P <0 .0 1) ,而A5 4 9/DTA-细胞与A5 4 9细胞存活率无差别 (P >0 .0 5 )。空载体组与对照组的裸鼠全部长出肿瘤 ,且肿瘤生长迅速 ,而转基因组有 1只裸鼠未长出肿瘤 ,肿瘤生长缓慢 ,前者瘤体的重量是后者的 3倍。结论　体外转染白喉毒素A基因可杀伤人肺腺癌细胞并降低人肺腺癌细胞的致瘤性。     

腺病毒介导野生型p53基因对人肺腺癌细胞的抑制效应

目的：p53基因突变是人类肿瘤中常见的遗传学改变。将野生型p53基因导入一些肿瘤细胞中被证明能抑制其细胞增殖，因此做为肺癌基因治疗主要目的基因而备受关注。本研究旨在观察野生型p53基因对人肺腺癌细胞和裸鼠移植瘤的抑制效应，并对其抑癌机制进行分析，为今后肺癌基因治疗的临床试验提供科学依据。方法：采用重组体腺病毒Ad-p53基因转染人肺腺癌细胞系GLC－82；以裸鼠皮下移植瘤治疗试验观察Ad-p53基因的抑瘤效应；用流式细胞计数，DNA片断化及TUNEL分析探讨Ad-p53基因的抑癌机制。结果：导入Ad-p53基因后人肺腺癌GLC－82细胞生长能力显著下降，克隆形成能力受到明显抑制；并显著抑制裸鼠皮下移植瘤的生长；肺癌细胞发生凋亡，并出现明显的G1期阻滞现象。结论：腺病毒介导野生型p53基因（Ad-p53)对人肺腺癌细胞和裸鼠皮下移植瘤均有明显抑制效应，主要通过诱导癌细胞凋亡和参与细胞周期调控实现，进而提示Ad-p53基因有可能在人肺癌基因治疗中发挥重要作用。     

介导p53基因转移的重组体腺病毒对人肺癌细胞的抑制作用

ｐ５３基因突变是肿瘤发生中的多发事件,导入野生型ｐ５３基因能抑制肿瘤细胞的生长。通过腺病毒载体介导。将野生型ｐ５３基因转导到人肺腺癌细胞系（ＧＬＣ－８２）中,证实对肺腺癌细胞生长具有明显的抑制作用,换制率达６１％。     

人IL-2重组腺病毒转染人肺腺癌细胞的体外生物学特性的研究

目的 在利用COS／TPC同源重组法高效制备hIL-2重组腺病毒基础上，对感染人IL－2重组腺病毒的人肺腺癌细胞（Anip973）的体外生物学特性进行研究。方法 将携带有人IL－2基因的重组腺病毒（rAd-hIL-2）感染人肺腺癌细胞系，通过细胞生长实验、克隆形成实验、流式细胞分析、形态学检查等观察其对Anip973肿瘤细胞的作用；利用PCR和琼脂糖电泳对肺癌中人IL－2基因进行了检测。结果 rAd-hIL-2经扩增、纯化后，滴度可达10^10PFU/ml，当病毒为30MOI时，对Anip973细胞的转染率达90％以上。转染的Anip973肿瘤细胞除表面结构和超微结构有轻微变化外，其生长能力、克隆形成率及细胞周期等无明显变化。结论 腺病毒介导的细胞因子基因hIL-2转染的Anip973肿瘤细胞未见明显变化。     

转TK基因的人肺腺癌细胞对三种原药敏感性的研究

构建了含有单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV－TK）基因的重组逆转录病毒载体LTKSN，经PA317细胞包装后，感染人肺腺癌细胞株A549。用G418筛选到稳定表达HSV－TK基因的细胞克隆A549／TK，A549／TK与野生型A549细胞相比，生长曲线无明显差异，细胞形态亦无改变。细胞毒试验证明．HSV－TK对GCV的敏感性很高，半杀伤浓度IC50为0．5μmol／L，比野生型细胞提高了1000倍。三种不同的原药GCV、ACV和BVDU对A549／TK具有效果不等的杀伤作用。旁杀伤效果十分明显，低浓度GCV就可以将含33％A549／TK的混合细胞中的大部分肿瘤细胞杀死。     

转化生长因子β_1基因转染对人肺巨细胞癌细胞体内外增殖调控机理的研究

转化生长因子β_１基因转染对人肺巨细胞癌细胞体内外增殖调控机理的研究ＡＳｔｕｄｙｏｎｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｓｏｆｈｕｍａｎｌｕｎｇｇｉａｎｔｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｓｂｙｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｏｆｓｅｎｓｅａｎｄａｎｔｉｓｅｎｓ?..     

腺病毒介导MnSOD转染对肺癌细胞生长及体内抗肿瘤作用的影响

目的研究腺病毒介导锰超氧化物歧化酶(Ad-MnSOD)对肺腺癌细胞生长影响及在体内抗肿瘤作用.方法应用细胞基因转染、四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),观察Ad-Mn-SOD转染A549细胞后对肺癌A549细胞生长的影响,并将A549细胞接种到裸鼠皮下后,注射Ad-MnSOD及Ad-LacZ到瘤体内,观察对肿瘤生长的影响.结果50MOI Ad-Laze转染率达90%以上,Ad-MnSOD转染A549细胞后MnSOD mRNA表达增加,MTT法检测显示转染Ad-MnSOD A549细胞组生长率(78.7%)低于转染Ad-LacZ的对照组(92.2%);A549细胞接种裸鼠后,用Ad-MnSOD及Ad-LacZ分别注射于瘤体内,Ad-MnSOD组瘤体生长速度低于Ad-LacZ对照组.结论Ad-MnSOD转染A549细胞后MnSOD可明显抑制A549细胞生长及肿瘤在裸鼠体内的生长,MnSOD对肺癌细胞A549有明显抗肿瘤作用.     

人呼吸道合胞病毒M2-1基因转染对人肺腺癌细胞生长特性的影响

目的:探讨人呼吸道合胞病毒(hRSV)M2-1基因转染对人肺腺癌细胞体外生长特性的影响.方法:应用脂质体转染法,将携带M2-1基因的重组载体pXJ-41/M2-1转入人肺腺癌PAa和A549细胞,并获稳定表达;以不含M2-1基因的空白载体为对照,采用流式细胞术、MTT法、胰酶消化试验、软琼脂集落形成实验和Boyden小室等方法观察转染细胞的生长特性、贴壁能力及侵袭能力变化.结果:与转染前和转染空白质粒组比较,转染M2-1基因的PAa和A549细胞的G2/M期细胞比例均显著增加(P<0.05,P<0.01);细胞增殖明显加快(P<0.01),倍增时间缩短;集落形成率显著增加(P<0.01);PAa细胞胰酶消化离壁时间缩短(P<0.01),而A549细胞在3组间无统计学差异;Boyden小室实验中,A549细胞透膜数显著增加(P<0.01),而PAa细胞因透膜数很少,均无法计数.结论:M2-1基因转染能提高体外培养的PAa和A549细胞的增殖能力和侵袭能力,感染hRSV病毒的肺癌患者应引起重视.     

DF3调控下的白喉毒素A片段在体内特异性杀伤人乳腺癌细胞的研究

目的研究新构建的含人乳腺癌DF3启动子和白喉毒素A片段的重组表达载体PGL3-DF3-DTA在体内对人乳腺癌细胞的特异性杀伤作用。方法4周龄裸鼠36只，随机分为实验组、空载体组、空白对照组、阴性对照组4组，每组9只。将DF3阳性和阴性的人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231分别接种于相应的裸鼠皮下。待成瘤后，将重组表达载体PGL3-DF3-DTA和PGL3-DF3多次、多位点注射入相应裸鼠移植瘤内。连续测量瘤体大小，计算瘤体重量。在不同时间分批处死动物，用光镜进行形态学观察、用TUNEL法检测肿瘤细胞的凋亡、用免疫组化技术检测肿瘤内淋巴管和血管的生成情况。结果成功的建立了人乳腺癌裸鼠动物模型，经重组表达载体PGL3-DF3-DTA作用后的DF3阳性人乳腺癌细胞出现明显的凋亡现象，LYVE-1、F8基因表达水平降低。结论重组表达载体PGL3-DF3-DTA能在体内对DF3阳性的乳腺癌细胞产生特异性杀伤作用。     

凋亡素基因转染对人胆管癌细胞凋亡作用的研究

目的探讨凋亡素对人胆管癌细胞凋亡的影响.方法以PCR方法获得凋亡素基因,然后运用T4连接酶将凋亡素基因和含荧光蛋白基因的质粒pAdtrack-CMV连接,通过酶切和测序证实成功构建重组质粒.再以DOTAP脂质体介导凋亡素基因转染人胆管癌细胞株QBC939.通过TUNEL染色证实凋亡素能否导致人胆管癌细胞的凋亡.结果酶切和测序均证实了成功构建含凋亡素基因和荧光蛋白基因的重组质粒.TUNEL染色显示凋亡素基因的转染引发人胆管癌细胞株QBC939的凋亡率与对照组相比具有非常显著的差异(P＜0.01).结论凋亡素能诱导培养的人胆管癌细胞的凋亡,在胆管癌的基因治疗上有深入研究的价值.     

EWS-FLI 1介导DTA基因在尤文肉瘤移植瘤裸鼠模型体内特异表达研究

目的观察EWS-FLI1介导的白喉毒素A链基因(diphtheria toxin A chain gene,DTA)在尤文肉瘤裸鼠移植瘤模型体内特异表达情况.方法采用尾静脉注射给药,将含有EWS-FLI1特异结合序列ACCGGAAGT和白喉毒素A链基因的真核表达载体pS2-DTA导入尤文肉瘤裸鼠移植瘤模型体内,通过免疫组化及RT-PCR检测DTA的表达情况.结果DTA在肿瘤组织中有高表达,肝组织中有弱表达,心肌组织中表达结果为阴性.结论EWS-FLI1介导的DTA可在尤文肉瘤裸鼠移植瘤内特异表达.     

携带尤文肉瘤EWS-FLI-1结合序列的DTA表达载体构建及其对尤文肉瘤细胞杀伤作用的研究

目的研究尤文氏肉瘤EWS-FLI-1融合蛋白的特异结合序列与DTA基因融合后的表达及对尤文肉瘤细胞的杀伤作用,为肿瘤基因治疗探索新的治疗方法.方法构建含有EWS-FLI-1特异结合序列和白喉毒素A链基因的表达载体pS2-DTA.转染尤文肉瘤细胞以及对照细胞后检测DTA表达及其对细胞的杀伤作用.结果表达载体pS2-DTA在尤文肉瘤细胞系中高表达并产生强烈的杀伤作用.结论 pS2-DTA可以对尤文肉瘤细胞产生选择性杀伤作用,抑制其生长,对尤文肉瘤的治疗有潜在的应用价值.     

Cell-specific expression of the diphtheria toxin A-chain coding sequence induces cancer cell suicide

Objective To test whether the diphtheria toxin A (DT-A) chain coding sequence linked to murine immunoglobulin κ-light chain (Ig κ) promoter and enhancer have selective cytocidal effects on Ig κ producing cells.Methods The diphtheria toxin A gene or β-galactosidase (β-gal) gene were linked to a murine Ig κ promoter and enhancer to construct pcDNA3Ig κDTA or pcDNA3Ig κLacZ plasmids.These plasmids were transfected into Ig κ producing or non-producing cells by the liposome-coated DNA method.Expression of β-gal activity and effects on cell growth of transfected cells were assessed.Results The β-gal gene, under the control of cytomegalovirus (CMV) promoter, can express in all cell lines.Expression of β-gal under the control of the Ig κ promoter was detected only in the Ig κ producing cell line, CA46.Expression of β-gal was greatly suppressed when cotransfected with pcDNA3Ig κDTA in CA46 cells.Cell growth of CA46 cells transfected with pcDNA3Ig κDTA plasmid was significantly inhibited compared with CA46 cells transfected with pcDNA3Ig κLacZ.Conclusion Selective killing of Ig κ producing cells can be attained by introducing the diphtheria toxin A gene under the control of Ig κ promoter and enhancer.     

p73基因转染抑制肺腺癌细胞系H1299和A549体外生长的研究

目的探讨p73基因转染对肺腺癌细胞体外生长的抑制作用及p73基因治疗肺腺癌的可能性. 方法利用脂质体将p73β基因转导入两株分别对p53基因治疗敏感和耐受的肺腺癌细胞系H1299(p53-null)和A549(wtp53)中,对p73蛋白过表达的细胞进行细胞生长曲线、克隆形成率分析,并用流式细胞术分析p73β基因对肺腺癌细胞周期的影响和细胞增殖的抑制作用. 结果导入p73β基因能使H1299和A549细胞发生G1期阻滞,生长速度明显减慢,克隆形成率下降.结论外源性p73β基因转染可以抑制肺腺癌细胞体外生长,且这种抑制作用与p53基因无关.因此该基因在肿瘤基因治疗上有广泛的应用前景.     

光动力疗法对人肺腺癌细胞系A549凋亡的影响

目的:探讨光动力疗法(photodynamic therapy,PDT)对体外培养的人肺腺癌细胞系A549凋亡的影响.方法:以人肺腺癌细胞系A549为研究对象,用MTT法筛选最佳PDT参数.实验分为对照组(不进行PDT)和PDT组,在PDT 24 h后,采用DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡的梯形条带、流式细胞术检测细胞周期及凋亡率、TUNEL标记法测定细胞凋亡指数(AI).结果:血卟啉衍生物(HPD)浓度10 mg/L、激光剂量10 J/cm2是PDT对A549细胞杀伤作用的最佳条件.当激光剂量均为10 J/cm2时,采取6组不同的功率时间组合测得的D492值无统计学差异.在最佳PDT条件下,琼脂糖电泳结果可见PDT组产生了特征性的DNA梯形条带;流式细胞术检测显示PDT组发生了G0/G1期生长停顿,凋亡率为(18.443±7.122)%,显著高于对照组的(0.301±0.361)%(P<0.01);TUNEL标记法也证实该组可见明显的棕黄色凋亡细胞,AI为(18.480±9.555)%,明显高于对照组的(0.880±0.944)%(P<0.01).结论:PDT通过诱导凋亡对体外培养的A549细胞产生杀伤作用.     

靶向联合化疗与常规化疗治疗表皮生长因子受体基因突变肺腺癌患者的临床效果

目的探讨靶向联合化疗治疗表皮生长因子受体(EGFR)基因突变晚期肺腺癌患者的临床疗效及靶向联合化疗对EGFR基因不同突变位点患者的疗效差别。方法选择安徽省胸科医院2016年1～12月收治确诊的64例EGFR基因检测阳性的Ⅲb/Ⅳ期肺腺癌患者,使用随机数字表方法分为靶向联合化疗组(33例)与常规化疗组(31例),同时对靶向联合化疗组患者按照其基因突变位点不同分为3个亚组(19外显子突变组、21外显子突变组、20外显子突变组)。靶向联合化疗组患者采用EGFR受体酪氨酸抑制剂靶向治疗联合培美曲塞+卡铂/顺铂治疗,常规化疗组患者采用培美曲塞+卡铂/顺铂治疗。比较两治疗组患者的近期及远期疗效,并对靶向联合化疗组不同位点远期疗效进行数据分析。结果靶向联合化疗组的中位无进展生存期高于常规化疗组,两组差异有统计学意义(P <0. 05),两组患者总体疗效和不良反应总发生率相似,差异无统计学意义(P> 0. 05)。靶向联合化疗组中,不同外显子突变的肺腺癌患者之间靶向联合化疗的生存期相似,差异无统计学意义(P> 0. 05)。结论 EGFR基因突变晚期肺腺癌患者接受靶向联合化疗能延长无进展生存时间,且不良反应未见增加。不同位点基因突变患者接受靶向联合化疗的临床效果无明显差别。     

RASSF1A基因转染对人肺腺癌细胞株A549增殖的抑制作用

目的：观察外源性RASSF1A基因对人肺腺癌细胞A549增殖及NF- κB亚单位P65表达的影响。方法：利用脂质体转染技术将真核表达重组体pcDNA3.0-RASSF1A质粒和空载体pcDNA3.0质粒分别导入A549细胞，经G418筛选后获得稳定转染细胞克隆，Western blotting检测RASSF1A基因表达。采用MTT(四甲基偶氮唑盐)法、流式细胞仪分析转染细胞的生物学行为。 RT-PCR和Western blotting检测基因转染对P65表达的影响。结果：经脂质体转染和筛选，建立了稳定表达RASSF1A基因的A549细胞系。与未转染组和转染空白载体组比较，转染RASSF1A基因的细胞生长速度明显减慢（P<0.05），细胞周期中G1/G0期比例明显增加（P<0.05），而S期比例减少；转染组细胞核内P65蛋白表达明显降低（P<0.05），而全细胞P65蛋白及mRNA表达未见明显变化。结论：RASSF1A基因可能通过抑制P65活性而抑制人肺腺癌细胞A549的生长。     

ΔNp73基因对不同p53基因状态肺癌细胞系体外生长的影响

目的探讨p73基因N末端转录活化区缺失的异构体ΔNp73转染对不同p53基因状态肺癌细胞系体外生长的影响.方法利用脂质体将ΔNp73α基因分别转染P53蛋白表达阴性与表达野生型P53蛋白的肺癌细胞系H1299和A549,筛选出稳定的表达株,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞生长情况,平板克隆形成率观察细胞增殖能力的变化,流式细胞术分析细胞周期及细胞凋亡率. 结果ΔNp73α基因转染使H1299和A549细胞生长明显增快,克隆形成率明显提高,细胞凋亡率明显降低但对细胞周期没有明显的影响.结论ΔNp73基因在肺癌的发生发展过程中发挥癌基因的功能,并且其作用不受p53基因状态的影响.     

应用重组基底膜侵袭技术对人肺腺癌细胞侵袭能力的研究

目的　研究RAB5A基因转染后对肺腺癌侵袭能力的影响。方法　采用重组基底膜侵袭实验 ,观察转染前后的细胞系对基底膜侵袭能力的改变。结果　转染pcDNA3.1 RAB5A正义表达载体的AGZY83 a细胞系基底膜侵袭能力增强 ,转染pcDNA3 AntiRAB5A反义RNA重组质粒的Anip973细胞系侵袭能力明显减弱。结论　RAB5A在人非小细胞肺癌的侵袭及转移特性的形成中具有重要的作用 ,RAB5A的反义分子能够有效地阻断该基因表达的翻译过程 ,在细胞内发挥预期作用。     

重组小鼠血管抑素基因转染抗血管生成治疗胆囊癌的实验研究

目的:研究重组小鼠血管抑素基因真核表达质粒转染的胆囊癌细胞表达具有抑制血管内皮细胞生长活性的血管抑素蛋白,以及对裸鼠种植性胆囊癌生长的抑制作用. 方法:应用脂质体lipofectamine2000将重组小鼠血管抑素基因的真核表达质粒pcDNA3.1( )-angiostatin转染胆囊癌细胞株GBC-SD,G418抗性筛选;以Western blot检测血管抑素的表达,以血管内皮细胞增殖分析检测其生物学活性,接种裸鼠并比较肿瘤体积和肿瘤微血管密度(MVD). 结果:得到表达血管抑素的胆囊癌细胞克隆,其培养上清能有效抑制bFGF刺激的血管内皮细胞增殖(P＜0.01);血管抑素组裸鼠肿瘤体积小于野生细胞对照组(P＜0.01),免疫组化检测显示血管抑素组裸鼠肿瘤微血管密度(MVD)低于野生细胞对照组(P＜0.05). 结论:血管抑素基因转染对裸鼠种植性胆囊癌的生长有抑制作用,这是血管抑素组肿瘤组织内新生血管形成受到抑制而减少所致.