bcl-xs增加鼻咽癌细胞对喜树碱诱导凋亡敏感性的实验研究

目的 :研究 bcl- xs 基因对喜树碱 (CPT)诱导鼻咽癌 CNE- 2 Z细胞凋亡的影响。方法 :利用脂质体L ipofect Amine将含有人 bcl- xs基因的重组真核表达质粒 pc DNA3xs导入人鼻咽癌低分化上皮细胞株 CNE- 2 Z,G418筛选培养后 ,经 Western blot检测 bcl- xs的表达。以不含有 bcl- xs基因的 pc DNA3质粒转染 CNE- 2 Z作为对照细胞。喜树碱处理两种细胞一定时间后 ,通过激光流式细胞仪检测凋亡细胞百分比。结果 :Western blot检测证实获得稳定表达 bcl-xs的细胞 ,经过 0 .5μmol/L ,1.0μmol/L CPT处理 2 4小时后 ,激光流式细胞仪检测的凋亡峰值均高于对照细胞。结论 :bcl- xs能显著增加鼻咽癌 CNE- 2 Z细胞对喜树碱诱导凋亡的敏感性     

bcl—xs促进三氧化二砷诱导鼻咽癌细胞凋亡的研究

目的 利用促进凋亡基因bcl-xs降低肿瘤细胞凋亡阈值,增强三氧化二砷诱导的鼻咽癌细胞凋亡,以探索提高鼻咽癌化疗敏感性的新途径。方法 将含有人bcl-xs基因的重组真核表达质粒导入人鼻咽癌低分化上皮细胞株（CNE－2Z）,以不含有bcl-xs基因的质粒转染CNE－2Z作为对照细胞。用三氧化二砷处理两组细胞后,台盼蓝计数法求得各自的IC50,流式细胞仪检测凋亡细胞百分比。结果 导入bcl-xs的细胞与对照细胞相比,其对三氧化二砷的IC50值明显降低,流式细胞仪及荧光染色检测结果表明其凋亡细胞百分比明显高于对照细胞。结论 bcl-xs能显著提高鼻咽癌CNE－2Z细胞株对三氧化二砷诱导凋亡的敏感性。     

bcl-x_s促进三氧化二砷诱导鼻咽癌细胞凋亡的研究

目的　利用促进凋亡基因bcl-xs 降低肿瘤细胞凋亡阈值 ,增强三氧化二砷诱导的鼻咽癌细胞凋亡 ,以探索提高鼻咽癌化疗敏感性的新途径。方法　将含有人bcl -xs 基因的重组真核表达质粒导入人鼻咽癌低分化上皮细胞株 (CNE - 2Z) ,以不含有bcl-xs 基因的质粒转染CNE - 2Z作为对照细胞。用三氧化二砷处理两组细胞后 ,台盼蓝计数法求得各自的IC50 ,流式细胞仪检测凋亡细胞百分比。结果　导入bcl-xs 的细胞与对照细胞相比 ,其对三氧化二砷的IC50 值明显降低 ,流式细胞仪及荧光染色检测结果表明其凋亡细胞百分比明显高于对照细胞。结论　bcl-xs 能显著提高鼻咽癌CNE - 2Z细胞株对三氧化二砷诱导凋亡的敏感性     

喜树碱诱导鼻咽癌细胞凋亡的线粒体机制探讨

目的 :了解喜树碱 (CPT)诱导鼻咽癌细胞凋亡是否与线粒体膜电位改变有关。方法 :用 2 μmol/ L 的CPT 处理 CNE- 2 Z细胞 ,经流式细胞仪、Hoechst332 5 8/ PI双重染色鉴定凋亡细胞 ,同时用罗丹明 12 3(Rhodamine12 3)染色后 ,经流式细胞仪检测线粒体膜电位。结果 :CPT可明显降低线粒体膜电位 ,2 μm ol/ L 的CPT处理 CNE- 2 Z细胞 2 4h后 ,罗丹明 12 3摄取量低的细胞明显增加 ,达 (19.0± 3.0 ) % ,与 DMSO对照组的(7.0± 1.4) %相比 ,差异有显著性意义 (P <0 .0 5 )。结论 :降低线粒体膜电位可能是 CPT诱导鼻咽癌细胞凋亡的机制之一。     

蛇床子素对人鼻咽癌细胞CNE2细胞增殖和凋亡的影响

目的　探讨蛇床子素对人鼻咽癌CNE2细胞增殖及凋亡的影响，寻找鼻咽癌综合治疗的新思路。方法  以蛇床子素不同梯度浓度处理CNE2细胞，采用MTT法检测细胞增殖情况，流式细胞术检测细胞凋亡，RT-PCR和Western blot分别测定Bax、Bcl-2mRNA和蛋白的表达水平。结果　蛇床子素处理CNE2细胞24、48、72 h对细胞增殖均有不同程度抑制作用，且呈时间、剂量依赖性（P <0.05）。蛇床子素干预CNE2细胞48 h后，流式细胞术结果表明细胞凋亡率显著升高（P <0.01），RT-PCR与Western blot检测提示Bax mRNA、蛋白表达显著增加，而Bcl-2 mRNA及蛋白明显下调（P <0.01），均呈浓度依赖性。结论　蛇床子素对CNE2细胞具有抑制增殖和促进凋亡的生物学效应。     

线粒体参与荛花酚诱导人鼻咽癌CNE细胞凋亡机制

目的探讨荛花酚诱导人鼻咽癌CNE细胞(简称CNE细胞)凋亡的效应,初步探索其与线粒体相互作用的机制。方法以不同浓度的荛花酚作用于CNE细胞,MTT检测分析荛花酚对细胞增殖的影响,Annexin V/PI双标后流式细胞仪检测凋亡情况,Western blot检测凋亡相关蛋白(caspase-3、caspase-9、PARP、细胞色素C、Bax、Bcl-2)的表达。JC-1染色检测线粒体膜电位,DCFH-DA染色检测活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成。结果荛花酚以时间和剂量依赖性方式抑制CNE细胞的增殖,荛花酚处理诱导CNE细胞发生明显凋亡,Bax/Bcl-2比值增加,细胞色素C从线粒体释放到胞浆,caspase-3和caspase-9活化,PARP发生剪切。荛花酚还可诱导CNE细胞线粒体膜电位下降,线粒体膜通透转运孔(PTP)开放,ROS含量升高。结论荛花酚可显著诱导CNE细胞的凋亡,机理与影响线粒体功能密切相关。     

Maspin蛋白在鼻咽癌放射敏感CNE2细胞株中的表达分析

目的探讨放射敏感鼻咽癌CNE2细胞株在放射条件下丝氨酸蛋白酶抑制剂Maspin蛋白的反应性变化,分析鼻咽癌放射作用的分子机制。方法采用MTT比色法检测放射线对鼻咽癌CNE2细胞株生长的影响,胎盼蓝染色法检测CNE2细胞增殖,流式细胞术检测CNE2细胞放射后的凋亡及周期改变,Western blotting分析Maspin蛋白的表达。结果鼻咽癌CNE2细胞株放射后,细胞周期重新分布,出现较多的G2/M期细胞以及较少的G0/G1期细胞;增殖受到抑制、细胞凋亡明显、Maspin蛋白表达上调,且其上调与细胞凋亡率增高呈现一致性改变,也与细胞周期分布改变相关。结论鼻咽癌CNE2细胞对放射线敏感、容易被诱发凋亡;细胞周期参与了放射诱导的CNE2放射反应调节;放射提高了CNE2细胞的Maspin蛋白表达,提示该蛋白参与了CNE2细胞的放射反应;Maspin蛋白表达提高涉及CNE2细胞周期和凋亡改变,是一个值得深入研究的鼻咽癌放射敏感相关分子。     

LMP1诱导鼻咽癌细胞发生TRAIL抵抗的体外实验

 目的探讨EBV膜潜伏蛋白1(latent membrane protein 1,LMP1)基因过表达后对肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TNF related apoptosis inducing ligand,TRAIL)凋亡诱导作用和凋亡信号传导的影响。方法利用脂质体介导的pGL6 LMP1上调LMP1低表达的TRAIL抵抗性鼻咽癌细胞CNE 1中LMP1的表达;通过MTT比色法、流式细胞术观察LMP1过表达后对CNE 1细胞TRAIL敏感性的影响;流式细胞术、Western blot、线粒体膜电位检测观察LMP1过表达后对死亡受体表达、细胞内外凋亡信号通路激活、线粒体膜电位改变的影响。结果死亡受体荧光标记后流式细胞术检测发现CNE 1和CNE 1 LMP1之间细胞膜蛋白死亡受体4（death receptor 4,DR4）,死亡受体5（death receptor,DR5）表达差异无统计学意义（P>0.05）。Western blot结果显示TRAIL(100 ng/ml)分别作用2、4、6、12 h后,CNE 1细胞中caspase 8 p43/p41,p18亚单位蛋白和caspase 3 p17,p10亚单位蛋白表达明显高于CNE 1 LMP1细胞,而Bcl 2相互作用域死亡激动蛋白的截短形式（truncated form of Bid,tBid）和caspase 9 p35亚单位蛋白表达无明显改变,且两个细胞株间也无明显区别。JC 1线粒体膜电位检测法结果显示TRAIL干预后,线粒体膜电位无明显改变,且两个细胞株间也无明显区别。结论LMP1过表达抑制TRAIL对鼻咽癌细胞的凋亡诱导作用和其细胞外凋亡信号的传导,提示LMP1是通过抑制细胞外信号通路激活诱导鼻咽癌细胞发生TRAIL抵抗。     

RNA同时干扰四个不同基因对鼻咽癌细胞CNE-2Z生长增殖的实验研究

目的 应用RNA干扰技术构建一个载体同时编码四个基因,即血管内皮生长因子(VEGF)、致癌基因蛋白(c-myc)、存活素(survivin)和端粒酶反转录酶的短发夹重组质粒,并与单基因质粒做对比,通过体内外实验,研究其对鼻咽癌细胞CNE-2Z生长增殖的影响.方法 构建同时表达VEGF、c-myc、survivin和端粒酶反转录酶并含荧光素标记的短发夹RNA质粒命名为P-1,并构建单独表达VEGF、c-myc、survivin和端粒酶反转录酶的质粒,分别命名为P-2、P-3、P-4和P-5,分别将其将转染人鼻咽癌CNE-2Z细胞株及荷瘤裸鼠瘤体内.以激光共聚焦显微镜观察质粒在CNE-2Z细胞及瘤体内的转染及表达情况.四甲基偶氮噻唑蓝法检测细胞增殖活性,实时PCR在mRNA水平上检测对目的基因表达的抑制作用,免疫印迹法在蛋白水平上检测对目的基因的封闭效果,Trans well侵袭小室模型观察导入CNE-2Z细胞对其恶性生物学行为的改变,流式细胞仪观察各组凋亡率,体内裸鼠成瘤实验观察质粒对肿瘤的抑制效果.结果 多基因干扰质粒转染鼻咽癌细胞后,CNE-2Z细胞增殖受到明显抑制,体外侵袭能力显著下降(P值均＜0.05).实时PCR证实多基因组4个不同基因mRNA表达均降低,免疫印迹技术验证目的基因蛋白同时表达下调.流式细胞仪结果证明多基因凋亡率明显高于单基因组(P值均＜0.05).体内抑瘤实验表明,与阴性组和空白组相比,P-1组移植瘤生长明显受到抑制(P＜0.05),并且多基因质粒抑制肿瘤细胞增长的作用要强于单基因干扰质粒(户值均＜0.05).结论 同时干扰多个基因能有效抑制鼻咽癌细胞增殖并诱导其凋亡,为鼻咽癌基因治疗奠定了良好的实验基础.     

Aurora-A促进鼻咽癌化疗抵抗的机制研究

目的　探讨丝/苏氨酸蛋白激酶Aurora-A促进鼻咽癌化疗抵抗的机制。方法　应用Western blot和Q-PCR检测鼻咽癌组织及癌旁正常组织中Aurora-A的表达水平。选取Aurora-A高表达的鼻咽癌细胞系CNE2，添加Aurora-A激酶抑制剂60 nm VX 680处理8小时后，加入浓度为10 μg/ml的顺铂处理24小时，收集细胞通过流式细胞术检测细胞凋亡情况，同时WB和Q-PCR检测细胞凋亡相关信号通路蛋白的表达情况。结果　Aurora-A在鼻咽癌组织中表达水平明显高于癌旁正常组织，相对于正常鼻咽细胞NP69，Aurora-A在不同鼻咽癌细胞中表达显著升高且在CNE2中表达最高；相对于未处理CNE2，添加顺铂或/和Aurora-A抑制剂VX680处理的CNE2细胞能显著促进鼻咽癌细胞凋亡及p-AKT、p21及Cleaved-Caspase-3的表达。结论　Aurora-A通过p-AKT/p21/Cleaved-Caspase-3通路促进鼻咽癌的化疗抵抗。     

microRNA抑制鼻咽癌hTERT基因表达的实验研究

目的观察microRNA对鼻咽癌CNE-2细胞hTERT基因表达的调控效应，探讨microRNA在鼻咽癌基因治疗的应用前景。方法构建靶向hTERT基因的microRNA表达质粒，脂质体法转染鼻咽癌CNE-2细胞，RT-PCR检测转染细胞中hTERT基因的mRNA水平，Western Blotting观察microRNA对hTERT蛋白表达水平的调控效应，CCK-8比色法检测microRNA对细胞生长的抑制作用，流式细胞学检测miRNA诱导细胞凋亡的作用。结果在mcroiRNA表达质粒转染CNE-2细胞后，hTERT的mRNA表达水平下调，蛋白表达水平降低，细胞周期在G0～G1期受阻，并诱导细胞凋亡。结论microRNA可在鼻咽癌中有效下调hTERT基因的表达水平，抑制鼻咽癌细胞增殖并诱导其凋亡，为鼻咽癌基因治疗研究奠定了一定的基础。     

自噬相关蛋白EPG5调节的鼻咽癌细胞经电离辐射后自噬机制的研究

目的　研究电离辐射后鼻咽癌细胞CNE1及CNE2中自噬相关蛋白EPG5的表达情况以及EPG5的表达与鼻咽癌细胞凋亡之间的关系。方法　鼻咽癌CNE1及CNE2细胞株接受不同剂量电离辐射后，用Western Blot法检测自噬相关蛋白EPG5的表达。si RNA转染法特异性敲除epg 5基因后，Annexin V-FITC/PI法检测两株细胞凋亡情况。结果　经不同剂量电离辐射后，CNE1细胞株中EPG5的表达量与放射剂量呈正相关，CNE2细胞株中呈负相关。敲除epg 5基因后，EPG 5表达减少的同时，CNE1细胞株凋亡率明显增加，而CNE2细胞株的凋亡率明显降低。结论  鼻咽癌细胞经过电离辐射后，EPG5的表达可能与肿瘤细胞的分化程度有关，分化程度较低的细胞表达下调，分化程度较高的细胞表达上调。同时分化程度低的细胞EPG5低表达可以减少细胞凋亡，这可能是低分化鼻咽癌产生放疗抵抗的分子机制。     

短发夹RNA抑制hTERT基因对鼻咽癌细胞端粒酶活性及PCNA和Caspase-3蛋白表达的影响

目的:研究靶向人端粒酶逆转录酶(hTERT)的短发夹RNA(shRNA)对鼻咽癌细胞系(CNE)端粒酶活性及PCNA、Caspase-3蛋白表达的影响.方法:构建表达靶向hTERT mRNA特异的shRNA的质粒pEGFP-shTERT.将pEGFP-shTERT转染CNE细胞,TRAP PCR-ELISA法检测端粒酶活性,MTT法测定细胞增殖活性,TUNEL法检测细胞凋亡,Western blotting检测蛋白表达.结果:pEGFP-shTERT成功转染入CNE细胞后, 端粒酶活性显著下降;细胞增殖活性明显受抑制;大量细胞凋亡;处理后24及48 h,PCNA蛋白下调至64.41%、58.67%(P<0.05),Caspase-3上调到1.55、1.60倍(P<0.05).结论:shRNA靶向抑制hTERT基因在鼻咽癌CNE细胞系中的表达,能显著地抑制细胞的端粒酶活性,调节PCNA和Caspase-3蛋白表达,从而抑制细胞增殖,并诱导细胞凋亡.端粒酶、PCNA和Caspase-3共同参与了鼻咽癌的发生、发展过程.     

莪术醇对人鼻咽癌细胞CNE2增殖、凋亡及周期的影响

目的 探讨莪术醇( curcumoI)在体外对人鼻咽癌CNE2细胞增殖、凋亡及周期的影响,为其临床治疗鼻咽癌提供理论依据.方法 不同浓度莪术醇作用于人鼻咽癌CNE2细胞后,用MTT法和流式细胞仪检测不同时间点鼻咽癌细胞CNE2的增殖、凋亡及周期分布.结果 莪术醇在体外明显抑制鼻咽癌CNE2细胞的增殖,且呈浓度和时间依赖...     

重组人内皮抑素对鼻咽癌细胞CNE2增殖及凋亡的影响

目的探讨重组人内皮抑素(rh-endostatin,rh-ES)对鼻咽癌CNE2细胞增殖、凋亡的影响。方法分别以25、50、100、200、400μg/ml的rh-ES体外处理人鼻咽癌细胞株CNE2,同时设空白对照组和细胞对照组。利用四甲基偶氮唑蓝法(MTT)检测不同浓度和时间rh-ES作用下的细胞增殖状态;流式细胞仪检测细胞周期及凋亡;透射电镜观察CNE2细胞超微结构的变化。结果①MTT检测显示rh-ES(25～400μg/ml)能抑制CNE2细胞的增殖,不同浓度的rh-ES对人鼻咽癌细胞株CNE2具有不同程度的生长抑制作用,且存在时间剂量效应,以400μg/ml rh-ES作用72 h后抑制效果最为显著,各浓度组相比差异具有统计学意义。②流式细胞仪检测结果发现与CNE2细胞对照组相比,rh-ES实验组处于细胞周期G0/G1期的细胞明显增多,细胞凋亡率增加(P<0.05)。③电镜观察,rh-ES实验组CNE2细胞出现凋亡特征,细胞和细胞器皱缩,核染色质边集碎裂,核膜消失。结论 rh-ES能显著抑制鼻咽癌细胞CNE2细胞的增殖,并具有时间-剂量依赖性,其主要机制可能为诱导细胞凋亡,调整细胞周期分布。     

顺铂增加BCL-2蛋白高表达的鼻咽癌细胞凋亡

目的:通过对3种不同鼻咽癌细胞的BCL-2蛋白表达、细胞存活率和凋亡率的观察,探讨提高顺铂治疗鼻咽癌疗效的新方法。方法:采用Western blot技术检测3种不同鼻咽癌细胞CNE1、C666-1及SUNE1的BCL-2蛋白的表达情况;采用MTT法及流式细胞技术,检测并比较顺铂对3种鼻咽癌细胞的细胞存活率和凋亡率的影响。结果:BCL-2蛋白在CNE1及C666-1细胞上高表达,在SUNE1上几乎无表达(P<0.05);经顺铂干预后,CNE1及C666-1细胞的细胞凋亡率明显升高,存活率明显低于对照组(P<0.05);SUNE1细胞的细胞凋亡作用较弱(P<0.05)。结论:BCL-2蛋白在不同类型的鼻咽癌细胞上表达量不同,提示顺铂对BCL-2蛋白高表达的鼻咽癌细胞的杀伤作用更强。     

苦参碱对人鼻咽癌CNE2细胞的生长抑制作用及凋亡相关基因Caspase表达的研究

目的：观察苦参碱对人鼻咽癌CNE2细胞的生长抑制及对凋亡相关基因Caspase-3 mRNA及Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9蛋白表达的影响,探讨苦参碱抑制人鼻咽癌细胞增殖和诱导其凋亡的机制。方法：采用MTT法检测不同浓度（0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.50、2.00g/L）苦参碱对CNE2细胞增殖的影响;采用荧光PCR法检测不同浓度（0、0.75、1.00、1.50g/L）苦参碱处理48h后Caspase-3mRNA的变化;Western Blot检测Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9蛋白的变化情况。结果：苦参碱对CNE2细胞具有明显的抑制作用,呈浓度依赖性;能上调CNE2细胞Caspase-3mRNA和Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白的表达,且呈浓度依赖性。结论：苦参碱能抑制CNE2细胞的生长,呈浓度依赖性。其作用与上调CNE2细胞Caspase-3mRNA和Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白的表达,启动Caspase级联反应密切相关。     

RNA干涉鼻咽癌细胞Raf-1基因表达的实验研究

目的 研究应用载体介导的RNA干涉技术特异性干扰Raf-1基因在鼻咽癌细胞株HNE1中的表达以及对其生物学行为的影响。方法 构建利用U6启动子转录功能的shRNA的载体，在U6启动子下游分别插入含针对Raf-1基因不同位点的特异性RNA干扰序列-67bp寡核苷酸片段，并编号命名为：pshuttle-Raf-1-a（225），pshattle-Raf-1-b（358）和pshuttle—Raf-1-c（474）。将构建的质粒通过脂质体转染人鼻咽癌细胞株HNE1，用RT—PCR分析Raf-1基因的mRNA的表达，流式细胞仪检测转染后HNE1细胞的凋亡率。结果 3种含有针对Raf-1基因不同特异性序列的质粒转染后均能干扰该基因在HNE1细胞中的表达，其中以pSIREN shuttle-Raf-1-b（358）作用最为明显。RT-PCR检测Raf-1基因mRNA表达量下降，流式细胞仪检测细胞凋亡率增加，达到65％。结论 应用载体介导的RNAi技术可特异性干扰Raf-1基因在鼻咽癌细胞HNE1中的表达，使该细胞凋亡率增加，Raf-1基因相对应的mRNA表达下降。     

Genistein对人鼻咽癌细胞系CNE抑制增殖和促进凋亡的作用及机制探讨

目的:研究genistein对人鼻咽癌细胞系CNE抑制增殖和促进凋亡的作用,探讨其抗癌作用的机制。方法:应用MTT检测不同浓度genistein在不同时间对鼻咽癌细胞系CNE的生长抑制作用;透视电镜下观察鼻咽癌细胞演变过程、凋亡细胞及凋亡小体,应用流式细胞仪分析细胞周期及凋亡率。结果:Genistein可明显抑制CNE细胞的增殖,并且这种抑制作用呈时间及浓度依赖性,随浓度的增加时间的延长抑制作用逐渐增强,尤以200μmol/L组最明显;Genistein诱导鼻咽癌细胞的早期凋亡率随浓度的增加而增强,200μmol/L时为49.9%;FCM分析发现genistein阻断CNE细胞生长于细胞周期的G2/M期;电镜观察到用药后凋亡细胞典型的形态学特征。结论:Genistein对鼻咽癌细胞系CNE的生长有明显的呈时间及浓度依赖性的抑制作用,其阻断细胞的生长主要在细胞周期的G2/M期,并且具有明显诱导CNE细胞凋亡的作用。     

DNA拓扑异构酶I抑制剂诱导鼻咽癌上皮细胞凋亡的实验研究

拟从细胞凋亡角度出发，探讨能够诱导鼻咽癌上皮细胞凋亡的因素，为有效地防治该恶性肿瘤提供新的思路。方法：光镜下观察细胞的形态变化；流式细胞仪检测细胞周期变化及亚二倍体比例；ＤＮＡ凝胶电泳及二苯胺法测定ＤＮＡ片段化程度。结果：一定浓度的拓扑异构酶Ｉ抑制剂喜树碱（ＣＰＴ）体外作用于人低分化鼻咽癌上皮细胞系ＣＮＥ－２Ｚ细胞一定时间后，镜下可见细胞体积缩小，染色质凝聚，胞膜突起及凋亡小体形成等形态变化。２￣