大鼠肝细胞、Kupffer和Ito细胞的分离与培养

我们采用Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ体内门静脉灌注结合体外Ｔｒｙｐｓｉｎ皿内消化制备游离肝细胞，进而采用ＰｒｏｎａｓｅＥ和Ｎｙｃｏｃｌｅｎｚ离心处理获单－Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞和Ｉｔｏ细胞。三种细胞的产生率分别为１．２×１０８，１．１×１０７和２．３×１０７；其细胞纯度分别为９５％，８１％和８８％；存活率都在９０％以上。作者对三种细胞原代培养过程的形态特征和生物学活性进行了观察与讨论。     

胰岛分离、纯化制备的改进

目的 探讨大型哺乳动物胰岛机械化大量分离、纯化的方法,为人类胰岛移植物的大量制备摸索创造条件.方法 应用改进的机械化胰岛分离、纯化系统,用HCA和UW液顺序原位灌洗犬胰腺,主副胰管插管,4℃胶原酶-V(1.5 g/L)+胰酶抑制剂pefabloc(0.4 mmol/L)灌注后,Ricordi-Chamber消化罐消化,4℃COBE2991连续密度梯度离心纯化,测定胰岛当量(IEQ)、胰岛纯度及存活率、胰岛素及C-肽的释放量、培养24 h后光镜及电镜观察.结果 胰腺消化时间为(25.0±6.0)min,胰岛外分泌腺包裹率为(9.4±2.4)%,消化后胰岛收获量为(17.2±3.6)×104IEQ/每个胰腺,纯化后胰岛收获量为(8.3±2.0)×104IEQ/每个胰腺,胰岛纯度为(89.7±3.5)%.纯化胰岛体外低糖与高糖刺激下胰岛索分泌量及C-肽的释放量良好,培养24 h后形态结构及功能正常.结论 本实验室改进的胰岛机械分离方法及各设备运行可靠,获得的胰岛形态功能良好,可望用于临床人类胰岛的大量制备.     

猪胰岛细胞分离纯化研究进展

目的综述猪胰岛细胞分离纯化的常用方法及最新研究进展。方法查阅近年来国内外关于猪胰岛细胞分离纯化的相关文献,进行总结分析。结果分离纯化的效果主要取决于供体的前期筛选、高质量胰腺的获取与有效保存,以及分离纯化方法的选择与改进。结论猪胰岛分离纯化操作的优化与标准化的建立,极大促进了异种胰岛移植研究的发展,有望解决目前移植供体短缺的问题。     

大鼠胰岛分离、纯化技术改良

目的:探讨SD大鼠胰岛分离、纯化的较优方案,并评价依该法分离所得胰岛的生物学特性。方法:以浓度为0.75mg/ml的Ⅺ型胶原酶经胆管充分灌注大鼠胰腺;完整分离后以37℃水浴振荡消化17min,Dextron70不连续密度梯度(1.091、1.081及1.037)离心法分离、纯化胰岛;以DTZ染色鉴定胰岛并计算得率,AO-PI染色检测胰岛活性,糖刺激试验判定胰岛功能,胰岛"细胞免疫细胞化学鉴定"细胞,光镜观察体外培养胰岛的形态学变化。结果:纯化后,每只大鼠胰岛收获量为(743.60±43.07)个,胰岛纯度>90%,胰岛细胞活率>90%。在45min内每10个胰岛细胞在低糖和高糖刺激下分泌的胰岛素浓度分别为(25.35±7.00)μIU/ml和(86.48±12.75)μIU/ml。结论:依改良后的分离纯化方案分离大鼠胰岛可获得高纯度高活率的胰岛细胞,且细胞形态正常、功能良好。     

肝脏微循环和Kupffer细胞

肝脏是机体新陈代谢最活跃的器官,有关肝脏的外科手术中经常使用肝门阻断以降低术中失血,同时也使肝细胞因缺血缺氧而受损,再灌注复流后肝细胞不但没有因得到营养物质而恢复其结构和功能,反而加重了损伤的程度,这种病理生理现象称为缺血再灌注损伤(Ischemia-refusion)。随着对肝脏缺血在灌注损伤研究的不断深入,发现微循     

前列腺细胞核蛋白的分离纯化

我们曾在前列腺特异抗原 (ＰＳＡ)启动子中雄激素应答元件 (ＡＲＥ)上游鉴定了一长度为 15ｂｐ的顺式作用元件 ,命名为ＲＦＡ[1] 。实验证明ＲＦＡ可显著增强雄激素受体 (ＡＲ)对ＰＳＡ基因的反式激活作用 ,并特异地与前列腺细胞核中某些调节蛋白结合 ,这些蛋白很可能作为辅助活化子参与ＡＲ介导的反式激活作用。我们以ＲＦＡ序列为探针 ,利用ＤＮＡ亲和层析从人前列腺癌细胞ＰＣ 3核蛋白中分离纯化ＲＦＡ结合蛋白 ,并予鉴定 ,为进一步研究提供依据。材料和方法　人前列腺癌细胞株ＰＣ 3由本室保存。ＤＩＧｇｅｌｓｈｉｆｔｋｉｔ购自Ｒｏｃ…     

Kupffer细胞与肝脏肿瘤

Kupffer细胞(KCs)是定居于肝血窦内的一种巨噬细胞,约占人体定居巨噬细胞的80%~90%,肝脏非实质细胞数量的25%~40%。它与其它单核吞噬细胞共同起源于相同的骨髓前体,但不同类群的细胞之间具有明显的异质性。作为肝内防御屏障的第一道防线的重要组成部分KCs有着很广泛的功能,包括     

从小鼠脂肪组织中分离纯化雪旺细胞的实验研究

目的 探索从新生小鼠脂肪组织中分离纯化雪旺细胞的可行性.方法 取新生(出生5～7 d)绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠的腹股沟皮下脂肪,采用0.2%的复合胶原酶NB4消化法分离获取细胞,然后用含10%胎牛血清(FBS)的低糖DMEM培养基培养.用0.1%的复合胶原酶NB4差速分离纯化雪旺细胞,每48 h纯化1次,共进行2次纯化.用p75免疫荧光法鉴定雪旺细胞并分析其纯度.结果 从小鼠腹股沟皮下脂肪中分离纯化获得的细胞是雪旺细胞,经过2次纯化,其纯度可达90%.结论 从小鼠脂肪组织中可以分离纯化获得雪旺细胞,为组织工程人工神经种子细胞提供一种新的来源.     

快速纯化新生大鼠许旺细胞的新方法

目的探讨一种简单高效的许旺细胞纯化方法。方法选用3～5d的SD乳鼠双侧坐骨神经,用DispaseⅡ短时消化去除神经外膜和束膜,用复合胶原酶NB4彻底消化、离心,获得原代细胞。细胞培养达到亚融合状态后,置于4℃冰箱约5min,收集首先脱壁的许旺细胞。最后用S100免疫荧光法和流式细胞仪法鉴定许旺细胞的纯度。结果通过酶消化法剥脱神经外膜和束膜,获得纯度85%以上的原代许旺细胞;经低温差速法进一步纯化,纯度可达99%。结论先用酶消化神经外膜和束膜,再用低温差速分离许旺细胞,能够获得高纯度的许旺细胞,是一种简便高效的纯化手段。     

大鼠肝卵圆细胞的分离培养及干细胞标志分析

目的研究简单易行的成体大鼠肝卵圆细胞的分离培养及干细胞鉴定方法。方法采用2-乙酰氨基芴/部分肝切除术刺激建立成体大鼠肝卵圆细胞增殖模型,于肝切除术后第12d切取剩余肝脏,使用胶原酶Ⅳ消化分离和Percoll梯度离心纯化肝卵圆细胞,免疫荧光技术和RT-PCR分析法检测肝卵圆细胞标志物mRNA表达。结果分离得到的肝卵圆细胞存活率达到90%,经c-kit免疫荧光显色,PCR分析显示有CK19和白蛋白mRNA表达。生长因子诱导下有向胆管细胞和肝细胞分化的特性。结论简单易行的肝卵圆细胞分离纯化及鉴定方法和肝卵圆细胞成功培养,为进一步研究肝干细胞生物学特性和与肝癌的关系提供了物质基础。     

The Isolation of Epithelial Cells from the Rat Epididymis

Epithelial cells from the epididymis were released by digesting the chopped epididymis with pronase followed by collagenase plus hyaluronidase. The epithelial cells were further separated from contaminating cell types by differential centrifugation and sedimentation at unit gravity through a gradient of sucrose in Ringer. The isolated cells remained viable as judged by the exclusion of trypan blue. The cells respired in the presence of glucose and the rate of respiration was not altered by the subsequent addition of pyruvate.     

Effect of High Fat Diet on the Volume of Liver and Quantitative Feature of Kupffer Cells in the Female Rat: A Stereological and Ultrastructural Study

Background The role of Kupffer cells (KCs) in nonalcoholic steatohepatitis (NASH) which is regarded as a major cause of cryptogenic cirrhosis of the liver was investigated using stereological methods and electron microscopy in the rat model. To our knowledge, there is no stereological study on the volume of liver, total number, numerical density, and nuclear height of KCs of liver in the female rat fed with a high fat diet (HFD) in the literature. Method 16 female Sprague Dawley rats were randomized into HFD and control group, with HFD and standard diet for 12 weeks, respectively. In this study, two basic research methods were used to analyze the samples. One was histopathological observation at both light and electron microscopic level. The other was stereological methods that consist of Cavalieri principle for liver volume estimation and physical disector method for estimation of numerical density and total number of KCs in the liver. Results Liver volume, both mean numerical density and total number of KCs, were statistically increased in HFD rats. Ultrastructurally, a significant decrease in the mean nuclear height of KCs in HFD rats was also found. In the control group, no abnormal change was observed, but in the HFD group, some changes such as diffuse steatosis, mononuclear cell infiltration, necrosis, fibrosis, accumulation of fat droplets and intra-cytoplasmic vacuoles, and swollen mitochondria with irregular membranes were observed in the hepatocytes. Conclusion The number and activity of KCs are increased significantly in NASH induced by HFD, and KCs might be involved in the pathogenesis of steatohepatitis as previously attributed as a major cause of cryptogenic cirrhosis of the liver.     

BALB/c鼠枯否细胞的分离培养与鉴定

目的 :肝脏是肿瘤转移的好发部位 ,而肝脏含有丰富的免疫细胞 -枯否细胞 (Kupffer Cell,KC)。为研究枯否细胞的抗癌活性 ,旨在探讨 BAL B/ c鼠枯否细胞的分离培养方法。方法 :选用健康雄性 8～ 10周龄 BAL B/ c鼠 ,麻醉无菌取肝 ,注射冲洗去血并剪去部分结缔组织 ,小玻璃瓶中剪碎肝组织 ,加入 0 .0 4 %的 EDTA和 0 .0 5 %链霉蛋白酶 E溶液 ,交替轻轻吹打消化。不锈钢筛网滤过 ,用 0 .0 0 4 % Dnase 的 16 4 0液清洗细胞液 ,加 Tris-氯化胺溶解红细胞。 30 %～ 70 % Percoll梯度离心 ,10 % FBS贴壁培养 4～ 6 h洗去非贴壁细胞。通过对比体内、体外枯否细胞吞噬墨水和体外吞噬聚苯乙烯乳珠 (latexbeads,D1.1μm )鉴定枯否细胞。结果 :Kupffer细胞的得率为 (7.5 7± 1.92 )× 10 6 个 /鼠肝 ,即 6 .15× 10 6 个 / g,贴壁率为4 0 .18%。用 0 .4 %台盼蓝染色鉴定 ,细胞存活率在 95 %以上 ,吞噬鉴定发现 Kupffer细胞的纯度可达 90 %。贴壁 Kupffer细胞的形态多样 ,可见不规则 ,多边形 ,多角伪足 ,典型的星形及多角形。体外培养枯否细胞存活 2周后未见再有吞噬功能。结论 :酶消化法结合梯度离心和贴壁培养是分离 BAL B/ c鼠枯否细胞的可靠方法 ,为进一步实验打下了基础     

小鼠肝内源性损伤下TLRs在Kupffer细胞和肝窦内皮细胞中的表达

目的　观察在小鼠内源性损伤模型下肝脏Kupffer细胞 (Kupffercell,KC)和肝窦内皮细胞 (sinusoidalendothelialcells,SEC)表面Toll样受体 2 (TLR2 )蛋白及mRNA表达。方法　在肝部分缺血 再灌注损伤模型下 ,采用原位灌注消化法分离并纯化KC和SEC ,用大鼠抗小鼠TLR2 IgG和异硫氰酸荧光素 (FITC)的二抗进行染色 ,流式细胞仪 (FCM)测定阳性细胞数 ,并用实时定量PCR(Real TimeRT PCR)检测两种细胞中TLR2 mRNA含量。结果　损伤组KCTLR2 的表达明显高于假手术组 ,蛋白质表达为 ( 9.19± 1.0 7) %vs ( 1.5 2± 0 .2 1) % ,P<0 .0 1;mRNA表达为 0 .5 4± 0 .77vs 2 .6 2± 2 .19,P<0 .0 5。SEC差异并无显著性意义。结论　在肝缺血 再灌注损伤中 ,小鼠肝KCTLR2 在蛋白质和mRNA水平的表达明显增高     

大鼠胰腺星状细胞分离培养与鉴定

目的：分离培养大鼠胰腺星状细胞,为体外研究胰腺纤维化提供细胞模型。方法：采用酶消化结合Nycodenz密度梯度离心法分离胰腺星状细胞,通过倒置显微镜观察细胞形态,油红O染色和免疫细胞化学染色desmin,α-SMA进行细胞鉴定,并绘制传代后细胞生长曲线。结果：原代培养的大鼠胰腺星状细胞呈星形或梭形生长;原代胰腺星状细胞油红O染色胞浆均可见红色密集脂滴,直至传代后消失;原代胰腺星状细胞培养48 h后,desmin表达开始减弱,α-SMA表达开始增强;传代后desmin基本不表达,α-SMA阳性表达100%;传代后第3 d-5 d的胰腺星状细胞处于快速增殖阶段。结论：酶消化结合Nycodenz密度梯度离心法分离培养大鼠胰腺星状细胞纯度高,重复性好,可以满足体外研究的需要。     

成年鼠嗅鞘细胞的纯化培养与免疫组化观察

目的：对文献报道的嗅鞘细胞(OECs)纯化方法进行改进，为基因治疗和细胞移植修复脊髓损伤实验研究提供高纯度的种子细胞.方法：本实验综合使用了阿糖胞苷、BPE及NGFR抗体纯化了原代培养的成年wistar大鼠的OECs，并对纯化的OECs细胞免疫特性进行观察。结果：本实验得到OECs纯度可达98％，其特性与文献报道一致.结论：本实验综合使用了阿糖胞苷、BPE及NGFR抗体纯化了原代培养的成年wistar大鼠OECs，纯度可达98％。而且培养周期大大缩短，节约了时间，为进一步的实验研究奠定了基础.     

成年大鼠嗅鞘细胞的分离培养及形态学研究

目的：探讨成年大鼠嗅鞘细胞（olfactory ensheathing cells,OECs）的分离培养和纯化方法,并观察其形态学变化及免疫组织学特性,为研究脊髓损伤后神经再生获得丰富嗅鞘细胞来源奠定理论基础。方法：采用原代培养技术,从成年SD大鼠的嗅球分离培养嗅鞘细胞,用Nash差速贴壁法和阿糖胞苷抑制相结合的方法培养纯化,倒置相差显微镜下观察嗅鞘细胞的形态变化特点及其生长情况,并行神经生长因子受体（NGFRp75）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫组织化学染色鉴定以及纯度检测。结果：体外培养的成年大鼠嗅鞘细胞主要为双极或三极细胞,其突起细长。未经纯化则成纤维细胞生长迅速而占据优势,而纯化培养后的嗅鞘细胞纯度可达90％以上。免疫细胞化学染色显示,培养的嗅鞘细胞呈现NGFRp75和GFAP染色阳性。结论：成年大鼠嗅鞘细胞的原代培养中细胞纯化是必要且必须的;而在脊髓损伤修复的研究中,Nash差速贴壁法和化学药物法不失为一种简单、经济、实用的嗅鞘细胞纯化方法。     

大鼠移植肝内Kupffer细胞分离及对T细胞增殖的抑制效应

目的:建立分离、纯化和培养大鼠肝脏Kupffer细胞(KC)的方法,并观察KC对同种反应性T细胞增殖的影响。方法:采用在体原位肝脏灌注结合密度梯度离心技术,进行肝移植受体大鼠肝脏KC分离、纯化和培养。在体外实验中进一步观察KC在MLR(混合淋巴细胞反应)体系中对同种反应性T细胞增殖程度的影响。结果:KC得率为(1.1±0.2)×107/肝,平均存活率为(93.5±1.8)%,纯度≥90%,ED-2( )。培养24h可见大量细胞伸展生长,呈现典型的星形或多边形。在MLR体系中加入未经辐照的KC后,反映T细胞增殖程度的每分钟脉冲数值明显降低,且接受联合免疫治疗并长期存活的D、E两组所获得的KC对T细胞增殖有着更为明显的抑制作用。结论:本实验成功建立了分离、纯化和培养大鼠KC的方法。KC对同种反应性T细胞增殖具有抑制作用,尤其从接受联合免疫治疗后长期存活受体大鼠所获得的KC抑制作用更为明显。     

大豆胰蛋白酶抑制剂对大鼠胰岛分离纯化的影响

目的探讨大豆胰蛋白酶抑制剂（STI）在大鼠胰岛分离纯化中对胰岛产量及功能的影响。方法按胶原酶中是否加入STI将大鼠分为实验组和对照组，实验组在胶原酶消化液中按2．0mg／ml加入STI，对照组不添加STI。2组均运用胶原酶原位灌注大鼠胰腺的方法来分离胰岛，使用Ficoll-400用非连续梯度离心法纯化胰岛，将纯化前、后获得的胰岛进行计数，并对纯化后的胰岛进行形态、功能检查。同时进行大鼠同种异体胰岛移植观察其体内功能。结果实验组和对照组在消化后纯化前所得胰岛数量无明显差别[（624&#177;38．2）IEQVS（586&#177;37．7）IEQ，P〉0．053；在纯化后实验组与对照组所得胰岛数量[（408&#177;28．3）IEQVS（189&#177;27．1）IEQ，P〈0．05]和纯度[（93&#177;2．4）％VS（75&#177;2．1）％，P〈0．05；差异有统计学意义。实验组与对照组最终所得胰岛的体外功能差异无统计学意义（P〉0．05），体内功能实验结果差异亦无统计学意义（P〉0．05）。结论使用在胶原酶中加入STI的消化液原位灌注大鼠胰腺，可以明显提高大鼠胰岛的最终产量和纯度，但对胰岛的功能无明显影响。