Bio—gide胶原膜体外复合培养犬骨髓间充质干细胞的软骨分化

背景：应用组织工程方法修复股骨头坏死后的软骨损伤应解决的2个关键因素是种子细胞和支架材料。目的：探讨Bio-gide胶原膜体外与犬骨髓间充质干细胞复合成软骨的可行性。方法：采用全骨髓血离心法结合贴壁筛选法体外分离培养比格犬骨髓间充质干细胞,观察细胞形态学变化,以细胞表面抗原进行鉴定。采用成软骨诱导培养基诱导第3代骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化作为实验组,设置普通培养基培养对照组,MTT比色法测试软骨细胞生长曲线,并行Ⅱ型胶原免疫组织化学和甲苯胺蓝染色等生物学鉴定。将第3代骨髓间充质干细胞与Bio-gide胶原膜体外复合培养行倒置相差显微镜、扫描电镜观察。结果与结论：采用全骨髓血离心法结合贴壁筛选法获得了高纯度高活性的骨髓间充质干细胞,生长状态良好,扩增能力强,并成功诱导分化为软骨细胞。大量骨髓间充质干细胞在Bio-gide胶原膜上贴附增殖并复层生长,细胞与Bio-gide胶原膜逐渐融为一体;在胶原膜的断面可见胞体伸出突起相互连接包绕胶原膜,其间有明显细胞基质分泌。表明犬骨髓间充质干细胞可在Bio-gide胶原膜上生长并向软骨细胞分化。     

人骨髓基质干细胞体外诱导向软骨细胞分化

目的：探讨应用壳聚糖支架三维立体培养人骨髓基质干细胞(mesenchvmal stem cells，MSCs)，体外诱导其分化成为软骨细胞的可行性。方法：实验于2004—02／11在中山大学附属第三医院中心实验室完成。相分离法制备三维多孔壳聚糖支架，检测支架的孔隙率、孔径。抽取人骨髓，密度梯度离心法分离纯化，体外培养扩增。将第3代MSCs复合于支架中培养，应用无血清诱导液诱导细胞向软骨细胞分化，通过组织学染色及扫描电镜观察细胞的形态、增殖及功能的改变。结果：通过相分离法可制备出高孔隙率的三维壳聚糖支架，孔隙率达86．5％，孔隙分布均匀且相互连通，平均孔径182μm。诱导分化的MSCs在支架中贴附良好，呈现典型的软骨细胞形态，并有细胞外基质分泌：结论：人MSCs在三维立体培养环境下可诱导分化为软骨细胞，作为种子细胞在组织工程软骨的构建及软骨损伤的修复中有良好的应用价值。     

滑膜间充质干细胞与软骨细胞三维条件下混合培养向软骨细胞的分化

背景：软骨细胞通过自分泌及旁分泌的作用可以为滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化提供所需的生长因子及微环境,三维条件下更有利于细胞的黏附增殖与分化。目的：观察滑膜间充质干细胞与软骨细胞混合培养于壳聚糖/Ⅰ型胶原复合支架材料中向成软骨细胞分化的能力。方法：取SD大鼠滑膜组织及软骨组织,用酶消化法获得滑膜间充质干细胞及软骨细胞分别进行培养。取第3代滑膜间充质干细胞及第2代软骨细胞,将二者以1∶2的比例混合培养负载于壳聚糖/Ⅰ型胶原复合支架材料21 d,进行激光共聚焦扫描及免疫组织化学检测。结果与结论：培养72 h后,扫描电镜观察细胞黏附于支架材料表面,并可见细胞分泌大量基质成分。培养21 d后,激光共聚焦扫描可见细胞在支架表面分布均匀,逐层扫描后细胞逐渐减少。免疫组织化学检测可见基质能被Ⅱ型胶原染色,细胞染色呈现棕黄色。结果表明壳聚糖/Ⅰ型胶原复合支架材料提供三维生长空间,利用软骨细胞分泌生长因子及细胞间的相互作用可以诱导滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化。     

三维支架中骨髓间充质干细胞及软骨细胞和脂肪源性成熟基质细胞的成软骨效应

背景：软骨修复的关键是种子细胞在三维支架中的定向分化,但细胞放入三维支架中很难有透明软骨表现。目的：考察3种种子骨髓间充质干细胞,软骨细胞和脂肪源性成熟基质细胞在支架中的成软骨特性。方法：抽取羊骨髓,胰酶消化后获得原代骨髓间充质干细胞细胞、软骨细胞和脂肪源性成熟基质细胞,单层培养扩增。取P1骨髓间充质干细胞,P3软骨细胞和P3脂肪源性成熟基质细胞种植入不同比例（10%,20%,50%,80%,100%）的胶原/透明质酸支架中,在无血清培养液中三维培养。2周后,用SO染色和免疫组织化学染色分析,观察硫酸软骨素和Ⅱ型胶原合成情况。结果与结论：种子细胞在三维支架中特定条件下有成软骨效应,骨髓间充质干细胞在含20%透明质酸的胶原/透明质酸支架扩增少于3代有成软骨效应,软骨细胞传代数更高仍然有成软骨效应,但脂肪源性成熟基质细胞成软骨效应能力较弱。结果提示,在同样条件下骨髓间充质干细胞、软骨细胞较脂肪源性成熟基质细胞有更好的成软骨性能。     

胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状修复体负载骨髓间充质干细胞体外培养

目的:观察胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体对经诱导骨髓间充质干细胞的吸附作用及对细胞生物学性状的影响,评价其作为关节软骨工程支架的可行性.方法:实验于2007-09/2008-03在广东省组织工程构建与检测实验室进行.①实验方法:以胶原、壳聚糖、β-磷酸三钙制备复合支架,孔隙率≥90%,孔径100 μm;体外培养新西兰大白兔骨髓间充质干细胞并成骨诱导3周,经检测诱导成功后,使之吸附于多孔胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体上三维立体培养4周.②观察指标:通过倒置相差显微镜、组织学、扫描电镜及免疫组织化学检测修复体三维立体培养对成骨细胞的表型、增殖及功能的影响.结果:①骨髓间充质干细胞经成骨诱导,检测碱性磷酸酶染色阳性,钙结节染色阳性,证实诱导成功.②胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙复合支架亲水性好,经诱导的骨髓间充质干细胞吸附于支架表面24h后,顺孔隙迁徙至支架内部,倒置显微镜和扫描电镜观察显示细胞在孔擘贴附良好.③组织学及免疫组织化学检测表明成骨细胞在复合支架上增殖和表型维持稳定,能分泌细胞外基质,Ⅰ型胶原免疫组织化学染色阳性.结论:胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体与经成骨诱导的骨髓间充质干细胞相容性良好,为修复关节软骨下层骨的进一步研究提供了实验依据.     

兔骨髓间充质干细胞与异体脱细胞耳软骨支架的体外复合

背景：耳软骨作为脱细胞基质可选择的支架,进行脱细胞处理可去除了软骨细胞的抗原性,从而与种子细胞具有良好的相容性。目的：体外提取、培养兔骨髓基质干细胞,并与异体脱细胞耳软骨支架复合,观察其生物相容性。方法：提取兔骨髓间充质干细胞行体外培养,诱导为软骨细胞,以胰蛋白酶-曲拉通联合法获得脱细胞软骨支架,将两者于体外复合,10d后复合支架固定行组织学染色及扫描电镜观察。结果与结论：兔骨髓间充质干细胞体外诱导14d可形成软骨细胞,Ⅱ型胶原免疫细胞化学示胞浆呈棕黄色;兔耳软骨脱细胞基质呈乳白色,组织学染色及扫描电镜观察示经脱细胞后支架孔隙均匀,结构完整,仍保存大量酸性黏多糖及胶原成分。其孔径长度（33.70±4.33）μm,孔隙率（65.23±7.35）%。复合支架组织学染色及扫描电镜示两者黏附良好,并伴有多量基质分泌。说明兔骨髓间充质干细胞诱导为软骨细胞与异体脱细胞耳软骨有良好的生物相容性。     

纳米羟基磷灰石／壳聚糖支架与诱导骨髓间充质干细胞体外构建软骨支架复合体

背景:国内外许多研究通过不同的构建方法构建组织工程化软骨支架复合体修复骨软骨联合缺损,且取得了一定的进展,但目前各种方法存在的问题突出表现为组织工程化的软骨和骨组织之间的界面、移植体和宿丰骨和软骨之间的界面耦合不够理想.目的:将体外提纯、扩增的骨髓间充质下细胞诱导成软骨细胞.将其接种于穿"靴"的纳米羟基磷灰石/壳聚糖支架的底部上联合培养,探索其用于组织工程软骨复合体的可行性.设计、时间及地点:细胞和材料复合的体外观察实验,于2008-03/07在暨南大学附属第一医院中心实验室和暨南大学理工学院材料系实验室完成.材聿斗:通过原位复合和冷冻干燥结合的方法制各纳米羟基磷灰石/壳聚糖支架.健康新西兰兔10只由广东省医学实验动物中心提供.方法:密度梯度离心法提取分离骨髓间充质干细胞,软骨诱导液诱导骨髓闻充质干细胞2周后甲苯胺蓝染色检测.把诱导得到的软骨细胞接种于穿"靴"的纳米羟基磷灰石/壳聚糖支架的底部,将细胞-支架复合物置入成软骨条件培养液中培养2周.主要观察指标:倒置相差显微镜下观察细胞形态特征,鉴定CD29,CD44,CD34和CD45抗原的表达,观察细胞生长特性,测定细胞活力和生长周期,扫描电镜观察纳米羟摹磷灰石/壳聚糖史架结构和细胞与支架的复合情况.结果:骨髓间充质干细胞可在体外分离扩增,表达CD29和CD44,不表达CD34和CD45,细胞活力为95.27%,G0～G1期细胞占94.68%.经软骨诱导液诱导后骨髓问充质十细胞转化成软骨细胞;制备的纳米羟基磷灰石/壳聚糖多孔支架孔隙率为90%,平均孔径为150μm,与软骨细胞有较好的黏附性.结论:初步证实纳米羟基磷灰石,壳聚糖支架与骨髓间充质干细胞诱导成的软骨细胞复合可以在体外构建组织工程软骨复合体.     

软骨细胞复合胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体的体外培养

背景：关节软骨缺损的修复涉及到软骨和软骨下骨的双重修复,需要将骨与软骨组织工程结合起来,构建骨软骨双层支架,或者在同一支架上构建组织工程化骨软骨。目的：观察胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体对软骨细胞的吸附作用及对细胞生物学性状的影响,评价其作为关节软骨工程支架的可行性。时间及地点：体外细胞学实验,于2007-12/2008-06在广东省构建与检测实验室进行。材料：以胶原、壳聚糖、β-磷酸三钙制备复合支架,上层以胶原/壳聚糖为主,下层以胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙为主,孔隙率≥90%,孔径100μm。方法：体外培养新西兰大白兔软骨细胞并成骨诱导3周,使之吸附于多孔胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体上三维立体培养3周。主要观察指标：通过生长曲线、倒置相差显微镜、组织学、扫描电镜及免疫组织化学检测支架在三维立体培养对软骨细胞的表型、增殖及功能的影响。结果：修复体/细胞体外培养3周,修复体上细胞数量明显增多,并分泌细胞基质,包裹在软骨细胞周围,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性。结论：胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体的细胞相容性良好,有望成为一种比较理想的关节软骨组织工程支架材料。     

不同来源骨髓间充质干细胞的体内成软骨

背景：骨髓间充质干细胞经体外诱导后可修复软骨缺损,但目前采用的种子细胞多来源于自体或同种异体。目的：观察同种异体及异种来源的骨髓间充质干细胞诱导成软骨后修复喉软骨缺损的效果。方法：分别取人胚胎骨髓间充质干细胞和刚出生兔骨髓间充质干细胞的第3代细胞种植于聚乳酸-羟基乙酸共聚物生物支架上,并加入转化生长因子β1和软骨形态发生蛋白诱导成软骨细胞。将两种细胞体系植入新西兰白兔体内,并于植入后4,8周取材行大体、组织学观察。结果与结论：植入后4,8周人胚胎骨髓间充质干细胞和兔骨髓间充质干细胞均有新生组织填充,经组织学观察大部分为软骨细胞,分泌软骨细胞基质糖胺聚糖和Ⅱ型胶原,且两种细胞支架复合物所生成的软骨细胞数大致相同,并无明显的免疫排斥反应。提示异种来源的骨髓间充质干细胞复合聚乳酸-羟基乙酸共聚物在转化生长因子β1和软骨形态发生蛋白联合诱导下所得的组织工程化软骨,与同种来源的骨髓间充质干细胞所获得的组织工程化软骨修复喉软骨缺损具有可比性。     

大鼠骨髓间充质干细胞在特定培养液条件下向软骨细胞表型定向分化的实验

背景：组织工程化软骨的构建为软骨缺损的修复开辟了全新的途径，克服了传统治疗方法的不足、目的：探讨分离骨髓间充质干细胞，在特定培养液条件下诱导其向软骨细胞表型转化的体外培养方法。设计：完全随机实验单位：广西医科大学第一附属医院创伤骨科、手外科及广西医科大学组织学与胚胎学教研率方法：实验于2002-08／2003-04在广西医科大学完成。实验动物选择新生断奶SD大鼠20只抽取大鼠四肢骨髓，Perrcoll梯度分离液离心分离结合贴擘筛选法得到间充质下细胞，在含体积分数0．15的胎牛血清的低糖DMEM培养液中，置于37℃，体积分数为0．05的CO2培养箱内培养10～14d。传代后以体积分数0.15的胎牛血清的高糖DMEM培养液（含转化生长因子β1 10μg/L．地塞米松10^-7mol/L维生素C50mg／L）对其进行诱导培养。主要观察指标：观测在体外特定培养条件下间充质干细胞的形态、生长特点和诱导培养后软骨特异性基质的表达情况结果：所有20只SD大鼠全部进行分析观察，无一例脱失：①分离获取了较高纯度的骨髓间充质干细胞，保持了细胞的活性。②骨髓间充质干细胞原代培养晕均匀分布的集落样生长，呈长梭形；传代培养中形态特性无明显变化，细胞增殖周期缩短，细胞均质性明显提高。③诱导后的细胞由梭形向多角形转变，Ⅱ型胶原免疫组化阳性。④诱导培养后软骨特异性基质Ⅱ型胶原免疫组化阳性结论：①采用Percoll梯度分离液离心分离结合贴壁筛选法可获得较高纯度和活性的骨髓间充质十细胞②间充质于细胞在体外特定培养条件下能大量增殖，实现数量扩增、③间充质干细胞在特定培养液的诱导下能向软骨细胞表型转化，并能分泌软骨特异性基质，可成为软骨组织工程理想的种子细胞。