陶瓷化骨-水凝胶与骨髓基质细胞自体皮下成骨实验

目的观察重组人骨形成蛋白(recombinant human bone morphogenetic protem 2,rhBMP-2)-转化生长因子β(transforming growth factor β,TGF-β)与陶瓷化骨-水凝胶和骨髓基质细胞复合后,植入自体皮下成骨能力的影响.方法用矿化液诱导第1代成年SD大鼠骨髓基质细胞(marrow stromal cells,MSCs)5 d后,应用改良钙钴法染色、Von Kossa染色、免疫组织化学染色观察诱导后的MSCs向成骨细胞分化情况.将收集的细胞(5×106/ml)分成3组,A组加入rhBMP-2(5μg)-TGF-β(0.05μg),B组加入rhBMP-25μg,C组不加生长因子作为空白对照;然后将细胞接种在陶瓷化骨-水凝胶上,植入自体12只SD大鼠皮下,每组6只,每只大鼠3种材料各1块.术后4、8周取材,行组织学观察骨基质形成情况,图像分析测量单位面积骨形成量,免疫组织化学染色观察Ⅰ型胶原、BMP合成情况.结果 MSCs经过5 d矿化诱导后,大部分细胞变小,胞浆突起变短,呈多边形.改良钙钴法染色见胞浆含有棕黑色颗粒的阳性细胞,Ⅰ型胶原免疫织组化学染色见大部分细胞胞核未着色,胞浆呈棕黄色;Von Kossa染色见20 d已经形成矿化结节.动物体内植入后4周,各组均有形状不规则的条索状骨基质形成,图像分析示A组的骨基质面积明显多于B组(P＜0.01);A、B组Ⅰ型胶原平均灰度值明显低于C组(P＜0.01),各组BMP的表达无明显差异(P＞0.05).8周时各组均有形状不规则的条索状、斑块状砖红色骨基质形成,A、B两组成熟骨面积明显多于C组(P＜0.01);Ⅰ型胶原、BMP均有阳性表达,但各组间平均灰度值无明显差异(P＞0.05).结论陶瓷化骨-水凝胶与MSCs复合物植入自体皮下后能形成骨组织,rhBMP 2-TGF-β复合生长因子较单纯rhBMP-2有更强的促进骨形成作用.     

微包囊优化制备及复合自体微小颗粒骨异位成骨的实验研究

目的探讨优化生长因子微包囊制作方法,观察其释放规律和复合微小颗粒骨异位成骨的效果。方法正交设计优化聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly-DL-lactide-co-glycolide,PLGA)微包囊制作工艺,于2、4、8、12、24、36、48、60、72、84、96、120、144、168、192、216、240和264h计算微包囊的累计释放量。实验取24只Wistar大鼠,随机分为4组(n=6),每只大鼠于双侧股部作1cm切口,制备臀大肌肌袋模型。A组双侧植入胶原,B组双侧植入胶原和颗粒骨,C组双侧植入胶原和重组人骨形成蛋白2(recombinant human bone morphogenetic protein2,rhBMP-2)/PLGA缓释微包囊;D组双侧植入胶原、颗粒骨与rhBMP-2/PLGA缓释微包囊。于术后3、4和5周取样(n=2)行大体和组织学观察。结果各优化变量对微包囊粒径及其包封率均有影响,包囊表面光滑,成球较好。体外能够在11d内缓慢释放。术后3周大体观察,A组未触及移植物,B、C、D组可触及,微包囊呈白色颗粒包裹于组织中。组织学观察:术后3周,A组胶原已经完全吸收,其余3组可见残余胶原;术后4周,A组胶原已不易见到,B组可见微小颗粒骨继续吸收,体积变小;C组包囊体积缩小,囊间成骨性细胞增多;D组微小颗粒骨和微包囊继续吸收,成骨性细胞和软骨性细胞团增多;术后5周,B、C、D组均可见植入物体积减小,包囊被吸收破碎,但颗粒骨和包囊周围的软骨性细胞、成骨性细胞更加密集。结论优化PLGA微包囊制备工艺,使其在体外能够长时间缓释。自体微小颗粒骨可在臀大肌肌袋内异位诱导生成大量成骨性细胞,PLGA微包囊可以与其有机复合,并在减少生长因子用量的同时协同微小颗粒骨成骨。     

PLGA和胶原海绵复合BMP修复兔关节软骨缺损的对比研究

目的以PLGA和胶原海绵为载体，分别复合rhBMP-2，比较两者修复兔关节软骨缺损的效果。方法将PLGA和胶原海绵制成直径4mm、厚3mm的圆柱形，分别与0．5mgrhBMP-2复合。2月龄新西兰兔24只，雌雄不拘，体重1．8～2．3kg，平均2．0kg。于24只兔双侧股骨髁部制造直径4mm的缺损，其中18只动物右侧缺损处植入PLGA／rhBMP-2复合物（实验1组），左侧缺损处植入胶原海绵／rhBMP-2复合物（实验2组）；余6只动物（12个膝关节）缺损不作任何处理，作为空白对照组。术后4、12和24周取材，行大体及组织学观察，并根据关节软骨半定量评分标准进行组织学评分。结果大体及组织学观察：4周，实验1组缺损内被半透明组织填充；实验2组缺损未被新生组织填满，两组形成的软骨组织与周围界限明显，软骨细胞分布较均一，排列无方向性；对照组中形成少量纤维组织。12周，实验1组缺损内完全充填白色半透明新生软骨组织，与正常软骨界限不清；实验2组缺损内形成白色半透明软骨组织，与周围正常软骨界限仍可辨认；两组新生软骨厚度逐渐接近正常软骨厚度，表面细胞平行排列，深层细胞排列较紊乱，基质异染，软骨下骨及潮线恢复，与正常软骨连接良好；对照组缺损边缘及底部形成少量软骨细胞，分布不均匀，底部纤维组织不连续。24周，实验1组缺损内形成半透明新生软骨组织，与正常软骨界限消失；实验2组形成的新生软骨组织颜色、质地与12周接近；两组新生软骨与正常软骨厚度相近，表面平整，细胞排列均一，但较紊乱，基质异染，软骨下骨及潮线恢复，与正常软骨连接良好；对照组缺损底部形成一层纤维组织，不连续。组织学评分：实验1组、实验2组与对照组在各时间点比较，差异均有统计学意义（P〈0．01）；两个实验组12、24周与4周比较差异有统计学意义（P〈0．01），但12周和24周比较差异无统计学意义（P〉0．05）；同一时间点两实验组间比较差异无统计学意义（P〉0．05）。结论PLGA和胶原海绵与rhBMP-2复合均可修复关节软骨缺损。     

可塑形组织工程骨修复兔颅骨缺损的组织学及力学研究

目的探讨用藻酸钙凝胶、成骨细胞和骨粉复合构建可塑形组织工程骨修复兔颅骨缺损后,体内成骨的组织学及生物力学特征。方法28只日本大耳白兔,随机分为A组(16只)、B组(8只)和C组(4只)。制备兔颅骨左右两侧直径1cm的骨膜-颅骨全层缺损,左侧用藻酸钙凝胶-成骨细胞-骨粉填补修复为A1组(n=16);右侧用藻酸钙凝胶-骨粉填补修复为A2组(n=16);B组骨缺损不作处理,为空白对照组(n=16);C组为正常组。术后6周和12周时,行大体观察及组织学观察;12周时行生物力学测试。结果术后6、12周时,A1组:颅骨缺损基本被硬组织所修复,镜下见材料已大部分被骨组织替代,成骨面积为40.92%±19.36%;A2组:材料部分被骨组织替代,成骨面积为18.51%±6.01%;B组:颅骨缺损边缘可见硬组织形成,镜下见修复组织以致密纤维组织为主,成骨面积为12.72%±9.46%。术后12周,生物力学测试修复组织能耐受的最大压力载荷,A1组37.33±2.95N;A2组30.59±4.65N;B组29.5±2.05N;C组41.55±2.52N;A1组明显大于A2组和B组(P<0.05)。最大载荷时应变位移,A1组1.05±0.20mm;A2组1.35±0.44mm;B组1.57±0.31mm;C组0.95±0.17mm;A1组小于B组(P<0.05)。载荷/应变比值,A1组35.82±6.48N/mm;A2组24.95±12.40N/mm;B组19.90±5.47N/mm;C组47.57±11.22N/mm;A1组大于B组(P<     

rhBMP-2、bFGF双基因共转染兔骨髓间充质干细胞复合nHA/RHLC/PLA支架及其体内外成骨分化研究

[目的]探讨rhBMP-2、bFGF双基因共转染兔骨髓间充质干细胞(bone marrow stem cells,BMSCs)复合nHA/RHLC/PLA支架及其体内异位成骨研究.[方法]构建携带rhBMP-2及bFGF基因片段的双基因表达载体prhBMP-2-IRES-bFGF并转染兔BMSCs,免疫细胞化学检测目的基因表达,进而与nHA/RHLC/PLA支架复合构建骨组织工程复合体.rhBMP-2及bFGF单独转染组、未干预BMSCs组设为对照.实时定量RT-PCR检测成骨相关基因(Ⅰ型胶原、骨连蛋白、骨桥蛋白)表达,扫描电镜观察细胞/材料复合情况.体外培养7 d后埋于自体股部肌袋,4周后取材,放射学及组织学方法检测成骨情况.[结果]转染后BMSCs的rhBMP-2及bFGF蛋白表达均呈阳性.复合材料后,其成骨相关基因表达明显高于rhBMP-2及bFGF单独转染组、未干预BMSCs组(P＜0.05,n=3),放射学及组织学检测也证实其异位成骨明显.[结论]采用rhBMP-2及bFGF双基因转染技术能够有效促进BMSCs成骨分化,与新型材料nHA/RHLC/PLA支架复合所构建的骨组织工程复合体,体现出良好的体内外成骨活力,进一步研究将探讨其针对大段骨缺损的修复效能.     

骨相关生长因子对兔骨髓基质干细胞生长及分化的量效作用

目的研究地塞米松、重组人成纤维细胞生长因子（recombinant human fibroblast growth factor，rhFGF）及重组人骨形成蛋白2（recombinant human bone morphogenetic protein 2，rhBMP-2）对兔骨髓基质干细胞（marrow slromal stem cells，MSCs）生长及分化的量效作用，为其在骨组织上程中的应用提供实验基础。方法体外分离培养免MSCs，分为1个空白对照组及9个实验组。实验组分别与终浓度为10^-8、10^-7、10^-6mol／L地塞米松；终浓度为50、200、500ngng/ml FGF；终浓度为50、500、1000ng／ml rhBMP-2培养。于4、7d终止培养并测定细胞总蛋白及碱性磷酸酶（alkaline phosphatase。ALP）活性。结果与空白对照组比较，10mol／L地塞米松显著抑制细胞蛋白合成（P〈0．05），而10^-8、10^-7mol／L地塞米松对细胞蛋白合成无明显影响；10^-6,10^-7mol／L地塞米松刺激MSCs高度表达ALP（P〈0．05）。rhFGF各浓度组显著促进细胞蛋白合成量差异有统计学意义（P〈0．05），表现ALP活性抑制。rhBMP-2符浓度组对细胞蛋白合成九明显影响；50ng／ml rhBMP2不影响MSCs的ALP活性；当浓度增至500ng／ml与1000ng／ml时，ALP活性显苦增加（P〈0．05）。结论10^-7mol／L地塞米松及500、1000ng／ml rhBMP-2在不影响MSCs增殖的前提下，适当浓度能显著促进MSCs向成骨细胞转化，在骨组织工程的研究中有重要的应用价值。     

活性维生素D促组织工程骨血管化

目的探讨以1,25-(OH)2D3为活性因子,与人骨髓间质成骨细胞(human marrow stromal osteoblast,hMSO)、脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,hUVEC)、珊瑚羟基磷灰石人工骨(coral hydroxyapatite,CHA)联合构建组织工程骨的异位成骨能力和体内快速血管化能力。方法体外分离、培养hMSO和hUVEC。hMSO以5×105/ml,hUVEC以2.5×105/ml按2∶1比例接种至经1,25-(OH)2D3处理过的CHA上,为实验组;相同比例hMSO和hUVEC接种于单纯CHA作为对照组。体外培养3d后,18只裸鼠背部皮下其中6只双侧均植入实验组组织工程骨1块,6只双侧均植入对照组组织工程骨1块,余6只植入实验组及对照组组织工程骨每侧1块。术后4、8、12周后取材,行大体观察、常规组织学、扫描电镜观察,并行植入物成骨的定量判断和新生血管定量分析。结果组织学观察可见,4周时,各组原始类骨组织均长入支架材料内部,实验组有大量不成熟骨组织伴随众多微血管出现;8周,骨组织成熟与微血管相伴出现;12周,各组均有成熟骨组织出现,实验组有典型骨单位。对照组在各时间点微血管量均少于实验组。扫描电镜观察:4周,实验组大量细胞外基质将细胞包埋,材料表面可见大量微血管并有部分穿入材料内部;对照组虽然细胞外基质也较丰富,但微血管量少;8周,实验组部分材料表面出现了束状条索样的类骨质结构,细胞外基质丰富,可见大量微血管相伴出现;对照组微血管量少,骨组织成熟度亦差。植入物成骨的定量判断,8周实验组为3.10±0.52,对照组为2.30±0.59;12周实验组为4.63±0.55,对照组为3.53±0.62;两时间点两组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。新生血管定量分析,4周实验组为28.74%±7.81%,对照组为19.52%±4.57%;8周实验组为24.66%±7.38%,对照组为17.84%±5.22%;两时间点两组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论1,25-(OH)2D3作为活性因子通过加强hMSO与hUVEC之间的相互作用,增强了构建的组织工程骨的异位成骨能力和快速血管化能力。     

压缩冲击对骨形成蛋白2基因修饰的组织工程骨的影响

目的观察直接压缩冲击对骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)基因修饰的组织工程骨细胞存活和成骨的影响,以探讨组织工程骨压缩植骨的可行性.方法体外培养扩增犬骨髓基质干细胞(marrow stromal stem cells,MSCs)转染腺病毒介导的人BMP-2(adenovirus mediated human BMP-2,Adv-hBMP-2)基因,与颗粒状的犬异体冻干松质骨复合.复合后4 d进行模拟压缩实验,分别于复合后24 h、4 d,压缩后即刻、1、4 d以扫描电镜观察细胞形态及数量.将单纯冻干骨、未经压缩的Adv-hBMP-2基因修饰的组织工程骨和压缩后4 d的Adv-hBMP 2基因修饰的组织工程骨植入裸鼠背部皮下,于术后6周行组织学观察新骨形成及冻干骨吸收情况.结果复合24 h冻干骨表面细胞展开,部分孔隙可见单层细胞生长;4 d后冻干骨表面细胞复层生长,胶原量多;压缩后即刻,冻干骨与冲击器接触的外表面基本无细胞存在,剖开面可见细胞片状掀起,碎片多;压缩后1 d,冻干骨表面细胞大部分脱落掀起,形成较多的细胞碎片;4 d后细胞数量明显减少,胶原分泌量增多.植入裸鼠背部皮下后,单纯冻干骨新骨形成极少,孔隙内主要为纤维组织,未经压缩的Adv-hBMP-2基因的组织工程骨组可见大量新骨形成,材料中心与周围新骨分布均匀,压缩后的Adv-hBMP-2基因的组织工程骨组新骨量明显减少,且主要在外周.结论体外模拟压缩植骨可明显减少基因修饰的组织工程骨中的细胞存活及体内成骨,但存活细胞的功能仍存在,可适用于压缩植骨重建假体周围骨缺损.     

猕猴组织工程骨异体植入后白细胞介素2及其受体的表达

目的　检测猕猴组织工程骨异体植入桥接节段骨缺损后体内白细胞介素 2 (interleukin 2 ,IL - 2 )及白细胞介素 2受体 (interleukin 2 receptor,IL - 2 R)的表达 ,从免疫学方面探讨同种异体细胞作为种子细胞构建组织工程骨的可行性。　方法　用猕猴骨髓基质干细胞 (marrow stromal stem cells,MSCs)体外诱导分化为成骨细胞 ,与人源生物衍生骨材料复合培养 ,构建组织工程骨 ,植入 15只免疫功能健全的异体猕猴体内桥接桡骨节段骨缺损作为实验组 ;用单纯生物衍生骨材料桥接对侧同样大小骨缺损作为对照组 ;分别于术后 1、2、3、6和 12周抽取静脉血 ,并行双侧局部组织取材 ,组织块作低温匀浆 ,用双抗体夹心 IL ISA法检测 IL - 2及 IL - 2 R的表达。　结果　实验组和对照组术后各时间点IL - 2及 IL - 2 R水平无统计学差异 (P>0 .0 5 ) ,IL - 2及 IL - 2 R水平在术后第 2周开始增高 ,第 2～ 6周维持高水平 ,6周后随时间的延长而下降。　结论　猕猴 MSCs和生物衍生骨材料复合构建组织工程骨 ,植入异体猕猴体内引发微弱的免疫反应 ,同种异体 MSCs可选择作为构建骨组织工程的种子细胞。