成年大鼠肌源性干细胞的培养和鉴定

目的探讨成年大鼠肌源性干细胞分离及纯化方法。方法采用消化法分离肌源性干细胞,然后用密度梯度离心法和差速贴壁法纯化干细胞;结蛋白(desmin)、CD34、CD45、Sca1免疫细胞化学染色对细胞进行鉴定。结果成功培养出高纯度的肌源性干细胞,免疫细胞化学染色结果为desmin( ),CD34( ),CD45(-),Sca1( )。结论可通过体外原代培养获得高纯度肌源性干细胞,为组织工程的临床应用提供种子细胞。     

新生小鼠肌源性干细胞的生物学特性及表型研究

目的通过体外新生小鼠肌源性干细胞(MDSCs)的培养,观察鼠肌源干细胞的生物学特性及表型。方法采用胶原酶Ⅺ和胰蛋白酶分步消化肌肉,后采用差速贴壁分离技术纯化获得MDSCs。用倒置显微镜观察细胞形态,测定生长曲线,分析MDSCs的增殖能力,采用Sca-1、CD34和Desmin免疫细胞化学染色对细胞进行鉴定,初步确定细胞表型。结果经过两步消化和差速贴壁后,成功培养出高纯度的肌源性干细胞,该细胞呈Sca-1、CD34和Desmin阳性。结论可通过体外原代培养获得高纯度的肌源性干细胞,细胞具有良好的增殖能力,是适用于组织工程和基因治疗研究的一种新型种子细胞。     

人肌源干细胞体外成骨作用的实验研究

目的探讨人肌源性干细胞(MDSCs)的分离、培养、鉴定及体外成骨作用,为临床应用提供实验依据。方法采用消化法分离MDSCs,应用差速贴壁法纯化干细胞,免疫细胞化学染色对细胞鉴定,MDSCs在骨形态发生蛋白-2(BMP-2)诱导分化后,检测其碱性磷酸酶、骨钙素。结果成功获得高纯度的MDSCs,免疫组织化学方法能够有效鉴定MDSCs,BMP-2诱导MDSCs后能够合成碱性磷酸酶、骨钙素。结论可通过体外原代培养获得高纯度MDSCs,其具有干细胞特征,并能够转化为骨系细胞,发挥成骨作用,为组织工程的临床应用提供种子细胞。     

成年大鼠骨骼肌卫星细胞原代培养及鉴定

目的：探讨骨骼肌卫星细胞体外培养，鉴定的方法。方法：采用I型胶原酶和胰蛋白酶两步消化法分离大鼠骨骼肌卫星细胞，经差速贴壁法纯化后，在培养液中进行培养，观察不同血清浓度下，卫星细胞生长融合的情况，倒置显微镜观察细胞形态，利用结蛋白免疫细胞化学染色方法鉴定肌卫星细胞。结果：细胞经过两步消化和差速贴壁后，纯度在90%以上，在生长培基中，细胞分裂增生；在融合培基中，细胞发生融合，形成肌管。结论：成年大鼠肌卫星细胞在不同的培养条件下可增生或分化，结蛋白免疫细胞化学染色可以早期鉴定骨骼肌卫星细胞。     

大鼠骨骼肌卫星细胞体外培养生长和成肌特性

目的 建立大鼠骨骼肌卫星细胞分离和纯化方法,并观察骨骼肌卫星细胞的体外增殖和成肌特性.方法 采用改良两步酶消化法结合差速贴壁技术,获得高纯度的骨骼肌卫星细胞.免疫组化染色鉴定体外培养的骨骼肌卫星细胞;MIT法检测体外培养骨骼肌卫星细胞的生长情况;倒置显微镜观察不同培养条件下骨骼肌卫星细胞的分化特性.结果 获取的骨骼肌卫星细胞纯度高,细胞中肌源性标志中间丝蛋白desmin呈强阳性表达.体外培养时,骨骼肌卫星细胞有1～2 d的潜伏期,5～6 d进入平台期.细胞汇合至60%～70%或降低培养基血清浓度时,开始相互融合形成肌管细胞.结论 酶两步消化法和差速贴壁技术是一种简便易行、获得较高纯度的骨骼肌卫星细胞的方法.骨骼肌卫星细胞体外培养时无需特殊诱导即可相互融合,形成具有骨骼肌收缩特性的肌管细胞.     

大鼠骨骼肌卫星细胞体外培养生长和成肌特性

目的建立大鼠骨骼肌卫星细胞分离和纯化方法,并观察骨骼肌卫星细胞的体外增殖和成肌特性。方法采用改良两步酶消化法结合差速贴壁技术,获得高纯度的骨骼肌卫星细胞。免疫组化染色鉴定体外培养的骨骼肌卫星细胞;MTT法检测体外培养骨骼肌卫星细胞的生长情况;倒置显微镜观察不同培养条件下骨骼肌卫星细胞的分化特性。结果获取的骨骼肌卫星细胞纯度高,细胞中肌源性标志中间丝蛋白desm in呈强阳性表达。体外培养时,骨骼肌卫星细胞有1~2 d的潜伏期,5~6 d进入平台期。细胞汇合至60%~70%或降低培养基血清浓度时,开始相互融合形成肌管细胞。结论酶两步消化法和差速贴壁技术是一种简便易行、获得较高纯度的骨骼肌卫星细胞的方法。骨骼肌卫星细胞体外培养时无需特殊诱导即可相互融合,形成具有骨骼肌收缩特性的肌管细胞。     

CdSe量子点标记大鼠肌源性干细胞

目的:探讨量子点标记大鼠肌源性干细胞的可行性。方法:采用胶原酶、dispase和胰酶消化分离新生SD大鼠腓肠肌,差速贴壁法获取PP6细胞,倒置显微镜下观察细胞的形态并应用免疫组化法对其鉴定;应用ZnS包被的CdSe量子点对固定后细胞进行标记,荧光显微镜下观察。结果:通过差速贴壁法获取的PP6细胞经过免疫方法鉴定,证实为肌源性干细胞;量子点标记后的细胞在荧光显微镜下呈现橘红色荧光。结论:量子点标记肌源性干细胞具有可行性,为今后活体示踪研究打下了基础。     

大鼠腓肠肌肌源细胞的培养与鉴定

目的寻求大鼠肌源细胞体外大量培养及鉴定的方法,为临床直接使用自体肌源细胞注射治疗肌组织损伤疾病奠定实验基础。方法利用胶原酶和胰蛋白酶消化3周龄大鼠腓肠肌,应用选择性培养基抑制非肌源细胞生长,采取改良的差速贴壁法纯化肌源细胞,通过形态观察、免疫组化及RT-PCR进行鉴定。结果使用F-10培养基获得了大量高纯度的大鼠肌源细胞;倒置显微镜下可观察到聚集成团和散在分布的两种形态的肌源细胞;免疫组化显示肌源细胞Desm in阳性率约90%,聚集成团的为CD34＋,大部分单个存在的为CD34-;RT-PCR显示传代细胞中均有Desm in基因的表达。结论此培养方法可在体外获得大量大鼠肌源细胞,有助于基因工程及组织工程等领域的研究。     

Jagged1蛋白在肌源性干细胞分化为神经样细胞过程中的表达差异

目的Jagged1蛋白在大鼠肌源性干细胞（MDSCs）体外增殖分化为神经样细胞过程中的表达差异研究。方法大鼠乳鼠骨骼肌消化后体外培养增殖,第5代传代后细胞分为2组：对照组完全培养基培养,诱导组加入诱导剂诱导。6d后观察2组细胞的形态变化,并进行NSE免疫细胞化学鉴定。然后通过免疫荧光观察Jagged1蛋白的表达差异。结果诱导组细胞NSE染色阳性,免疫荧光结果显示对照组Jagged1蛋白表达阳性,实验组基本不表达。结论大鼠肌源性干细胞分化为神经样细胞过程中Jaggedl蛋白表述存在明显差异。     

体外扩增大鼠肌源性干细胞的安全性研究

目的:研究经体外扩增的大鼠肌源性干细胞的安全性,为将来肌源性干细胞移植治疗压力性尿失禁的临床应用提供参考。方法:分离培养出大鼠肌源性干细胞,在体外传代培养,对传至第10代(PP6-10)的细胞进行刀豆球蛋白A(ConA)凝聚实验、双层软琼脂培养实验初步分析细胞表面结构和生长特性是否发生恶变;采用免疫细胞化学的方法检测PP6-10的端粒酶活性以及c-myc,p53,c-fos肿瘤相关基因的表达情况;采用裸鼠皮下致瘤实验观察其是否具备致瘤性。结果:体外培养至第10代以内的大鼠肌源性干细胞在培养瓶底分布均匀,贴壁后多为纺锤形或梭形,与原代培养的肌源性干细胞形态相比无明显改变;在不同浓度的ConA溶液中,PP6-10均未产生凝聚反应;将PP6-10置于双层软琼脂中培养12d,未见细胞克隆形成,培养至20d,细胞数量明显减少;通过免疫细胞化学方法检测PP6-10中的c-myc,p53和c-fos等肿瘤相关基因的表达结果均为阴性,PP6-10中的端粒酶逆转录酶(hTERT)的表达结果呈弱阳性;将不同浓度的PP6-10接种于裸鼠皮下,观察4个月后接种部位没有肿块形成,病检其接种部位以及肝脏、肺脏均无异常表现。结论:大鼠肌源性干细胞体外培养至第10代后没有发生突变,不具备体内致瘤性,初步证实了体外传至第10代的大鼠肌源性干细胞的安全性。