回转模拟失重对人脐静脉内皮细胞LC3、p62、p53和磷酸化p70S6K表达的影响

目的探讨人脐静脉内皮细胞(HUVECs)在回转模拟失重条件下微管相关蛋白轻链3(LC3)、p62、自噬相关分子p53和反映mTOR活性的磷酸化p70S6K(Thr389)的表达变化。方法体外培养HUVECs,随机分为回转72 h组和静止对照组,采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞p53的mRNA水平的变化,Western blotting检测各组细胞LC3、p62、p53和磷酸化p70S6K的蛋白表达变化。结果与静止对照组相比,回转72 h可使HUVECs LC3-II/LC3-I蛋白表达显著升高(P0.05),p62蛋白表达显著降低(P0.05),p53的mRNA表达和蛋白表达则显著降低(P0.05),反映mTOR蛋白活性的磷酸化p70S6K表达显著低于对照组(P0.05)。结论回转模拟失重72 h可促进静脉内皮细胞中LC3-I向LC3-II转换,p62蛋白降解增多,自噬水平增高,p53表达降低和mTOR活性降低,可能在模拟失重后静脉内皮细胞自噬增强调节中起一定作用。     

p53凋亡刺激蛋白2在HepG2215细胞中通过抑制自噬来发挥抗乙型肝炎病毒的作用

目的 研究p53凋亡刺激蛋白2(apoptosis stimulating protein 2 of p53,ASPP2)对乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen,HBsAg）和乙型肝炎E抗原（hepatitis Be antigen,HBeAg）表达的影响。方法 HepG2.215细胞用3-甲基腺嘌呤处理来抑制自噬,或用人ASPP2重组腺病毒感染来诱导ASPP2过表达,或转染GFP-LC3质粒后观察绿色LC3-Ⅱ颗粒（自噬标志物）的变化。酶联免疫吸附测定检测培养上清和胞内HBsAg和HBeAg的水平、免疫荧光检测LC3-Ⅱ颗粒的水平、免疫印记检测自噬相关蛋白的水平、免疫沉淀检测ASPP2与自噬相关蛋白的结合。结果 ASPP2过表达明显下调了绿色LC3-Ⅱ颗粒的水平和LC3-Ⅱ/Ⅰ比例、以及明显上调p62的水平,说明ASPP2过表达可抑制HepG2.215细胞的自噬。但是ASPP2并非通过抑制Atg5、Atg14和Beclin-1等自噬相关基因的表达来抑制自噬,而是通过与Atg14结合来抑制Atg14与Beclin-1的结合,阻断自噬体膜的形成,从而抑制自噬。抑制自噬和ASPP2过表达均导致培养上清和细胞内的HBsAg和HBeAg水平明显下调,表明在Hep2.215中,ASPP2通过抑制自噬来抑制HBsAg和HBeAg的产生。结论 ASPP2通过抑制自噬的作用具有抗乙型肝炎病毒感染的潜力。     

白藜芦醇抑制膀胱癌细胞生长增殖及影响miR-34a表达的研究

目的观察白藜芦醇(resveratrol,Res)对人膀胱癌细胞T24生长增殖的影响,初步探讨miR-34a在Res影响T24细胞中的作用。方法不同浓度Res分别作用T24细胞24 h,采用甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blotting检测p53蛋白水平,实时定量PCR(Real-time PCR)检测T24细胞miR-34a的基因表达。结果 Res剂量依赖性地抑制T24细胞增殖,诱导细胞凋亡,明显增加p53的蛋白表达。此外,Res处理后T24细胞中miR-34a的基因表达亦显著升高。结论 Res能够有效抑制膀胱癌细胞生长增殖,可能与诱导细胞凋亡、上调miR-34a及p53表达有关。     

虎杖有效成分大黄素抗膀胱癌作用的分子机制研究

目的观察虎杖中有效成分大黄素对人膀胱癌T24细胞的影响,并初步探讨其可能的分子机制。方法200μmol／L大黄素干预膀胱癌T24细胞,通过流式细胞术检测细胞凋亡,Westernblot检测p53的蛋白表达,实时定量PCR（Real-timePCR）检测miR-34a的基因表达,应用化学方法合成成熟miR-34a瞬时转染T24细胞并检测细胞增殖水平。结果大黄素能够有效明显上调p53蛋白以及促进miR-34a的基因表达水平。转染miR-34a后T24细胞生长增殖明显受抑。结论大黄素具有良好的抗膀胱癌活性,其作用机制可能部分与促进膀胱癌细胞中p53表达、上调miR-34a,进而诱导膀胱癌细胞凋亡有关。     

miR-34a调控高糖环境中HK-2细胞增殖作用的初步研究

目的探讨miR-34a对高糖环境中HK-2细胞增殖作用的影响。方法以miR-34a模拟物和miR-34a抑制剂分别转染HK-2细胞,定量PCR检测miR-34a的表达变化,MTT检测细胞增殖活性;Western印迹检测周期相关蛋白CyclinD1和CyclinE的表达变化。生物信息学分析miR-34a的靶基因,对其中的增殖相关转录因子E2F3进行双荧光素酶验证。结果 miR-34a模拟物组miR-34a表达显著上调(P<0.05),miR-34a抑制剂组miR-34a显著下调(P<0.05)。与对照组相比,miR-34a模拟物显著抑制高糖环境中HK-2细胞的增殖作用(P<0.05),CyclinD1和CyclinE表达下调(P<0.05),miR-34a抑制剂组显著上调高糖环境中HK-2细胞的增殖作用,CyclinD1和CyclinE表达上调(P<0.05)。TargetScan在线分析软件显示,增殖相关转录因子E2F3可能是miR-34a潜在的靶基因,双荧光素酶分析结果显示E2F3是miR-34a的直接靶基因。结论 miR-34a可以调控高糖环境中HK-2的细胞增殖,其机制可能是通过直接抑制E2F3基因的表达而实现。     

miR-34a调控高糖环境中HK-2细胞增殖作用的初步研究

目的探讨miR-34a对高糖环境中HK-2细胞增殖作用的影响。方法以miR-34a模拟物和miR-34a抑制剂分别转染HK-2细胞,定量PCR检测miR-34a的表达变化,MTT检测细胞增殖活性;Western印迹检测周期相关蛋白CyclinD1和CyclinE的表达变化。生物信息学分析miR-34a的靶基因,对其中的增殖相关转录因子E2F3进行双荧光素酶验证。结果 miR-34a模拟物组miR-34a表达显著上调（P〈0.05）,miR-34a抑制剂组miR-34a显著下调（P〈0.05）。与对照组相比,miR-34a模拟物显著抑制高糖环境中HK-2细胞的增殖作用（P〈0.05）,CyclinD1和CyclinE表达下调（P〈0.05）,miR-34a抑制剂组显著上调高糖环境中HK-2细胞的增殖作用,CyclinD1和CyclinE表达上调（P〈0.05）。TargetScan在线分析软件显示,增殖相关转录因子E2F3可能是miR-34a潜在的靶基因,双荧光素酶分析结果显示E2F3是miR-34a的直接靶基因。结论 miR-34a可以调控高糖环境中HK-2的细胞增殖,其机制可能是通过直接抑制E2F3基因的表达而实现。     

beclin1在辐射诱导的乳腺癌细胞自噬发生中表达的变化

目的 研究不同剂量X射线诱导乳腺癌细胞株MCF-7自噬发生过程中beclin 1表达的变化和作用。 方法 采用实时荧光定量PCR方法检测自噬相关基因MAP1LC3B表达,RT-PCR方法检测beclin 1基因变化,X射线Western blot方法检测beclin 1蛋白表达。结果 MAP1LC3B mRNA量效研究表明,8、16和32 h量效研究均发现表达上调,8、16 h在12 Gy,32 h在8 Gy达到表达峰值,总体表现为表达升高(F =13.831、10.996、17.019, P＜0.05);时程研究表明,2 Gy时程研究发现MAP1LC3B于16 h升高达至峰值(F =16.284, P＜0.01),8 Gy时程研究中32 h升高达至峰值(F =9.030, P＜0.05),12 Gy时程研究中16 h升高达至峰值(F =20.315, P＜0.05)。beclin 1 mRNA量效关系表明,照射后4 h beclin 1在2、4和8 Gy阶段呈剂量依赖增加趋势;8 Gy时间效应关系中发现照射后beclin 1 mRNA的变化呈时间依赖性增加。16 h蛋白量效关系表明,照射后beclin 1表达增加;2 Gy时效关系表明照射后蛋白表达增加。 结论 X射线照射能够诱导乳腺癌细胞株MCF-7发生自噬,beclin 1基因上调表达的变化提示其发挥重要作用。     

PERK参与调控砷化物诱导细胞自噬反应的信号转导机制研究

目的 探索PERK是否参与调控砷化物诱导的细胞自噬反应.方法 体外培养人肝癌细胞HepG2,以砷化物为刺激源,采用Western印迹方法检测自噬反应标志性蛋白的表达水平、PERK诱导活化状态以及敲低PERK表达水平后砷化物诱导细胞自噬反应和p53诱导活化水平变化情况;采用双荧光素酶报告基因技术检测敲低PERK表达水平后p53的转录激活活性变化.结果 砷化物刺激HepG2细胞后自噬反应相关蛋白Beclin-1诱导表达、LC3发生剪切、p62发生降解反应,同时PERK活化水平显著增强;敲低PERK表达水平后,砷化物刺激作用下Beclin-1的诱导表达、LC3的剪切以及p62的降解均被显著抑制;同样条件下p53在Ser15和Ser392位的磷酸化修饰反应水平和转录激活活性显著下降、p53下游靶基因DAPK1的诱导表达水平被显著抑制.结论 PERK能通过调节p53活化及其下游靶基因DAPK1表达从而介导砷化物诱导的细胞自噬反应.     

microRNA-22对调控软骨细胞自噬的影响及其在骨关节炎发病中的作用机制

目的 探讨microRNA-22对软骨细胞自噬的影响及其在骨关节炎(OA)发病中作用机制。方法 原代培养人健康、OA软骨细胞,荧光定量PCR检测microRNA-22在健康、OA软骨细胞中的表达水平;Western blot检测健康、OA软骨细胞中自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ、Ⅰ的表达水平;软骨细胞转染microRNA-22模拟物、抑制物,平板克隆形成实验检测microRNA-22对软骨细胞活性的影响,Western blot检测软骨细胞自噬相关蛋白LC3B-Ⅰ、LC3B-Ⅱ及Ⅱ型胶原(CollagenⅡ)的表达水平。结果 荧光定量PCR检测结果显示,OA软骨细胞(14例)中microRNA-22表达含量(2.50±0.39)显著增高(P<0.01),约为健康软骨细胞(12例)(0.98±0.25)的2.5倍。Western blot检测结果显示,与健康软骨细胞相比,OA软骨细胞自噬相关蛋白LC3B的Ⅱ类亚型含量降低;OA软骨细胞(4例)LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值为1.25±0.13,健康软骨细胞(4例)LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值为1.85±0.21,差异具有统计学意义(P&...     

DAPK1调控砷化物诱导的细胞自噬反应机制研究

目的 探究死亡相关蛋白激酶1(DAPK1)在砷化物As203诱导细胞自噬反应中的作用及分子机制.方法 应用As203刺激HepG2细胞后,蛋白质免疫印迹和逆转录PCR实验检测DAPK1、自噬标志性信号分子和DNA损伤调节自噬相关蛋白1(DRAM1)的表达水平及p53活化能力;采用双荧光素酶报告分析实验检测敲低DAPK1后p53的转录激活能力变化情况,流式细胞术检测敲低DAPK1对As203诱导细胞自噬反应的影响.结果 As203刺激能诱导HepG2细胞中DAPK1表达;敲低DAPK1表达显著抑制了细胞自噬反应水平;同时p53的诱导活化反应强度显著下调,但自噬反应特异性p53靶基因DRAM1的表达水平无明显变化.此外,敲低p53表达可显著抑制砷化物刺激作用下DAPK1的诱导表达水平.结论 DAPK1在As203诱导细胞自噬反应中可通过与p53形成正反馈通路实现对自噬信号的放大效应.     

miR-1抑制SDF-1表达和分泌调控HMSC-bm向肝癌细胞迁移

目的 明确肿瘤抑制性micro RNA-1（miR-1）能否通过抑制SDF-1的表达和分泌,调控骨髓间充质干细胞（HMSC-bm）向肿瘤组织的转移.方法 （1）分别利用miR-1表达质粒pSuper-miR-1和miR-1反义寡核苷酸,在肝癌细胞系HepG2中过表达或下调miR-1,Western blot和酶联免疫吸附实验分别检测肝癌细胞蛋白裂解物和培养上清液中SDF-1的表达和分泌水平;（2）构建融合SDF-1 3UTR的pGL3重组萤光素酶报告基因载体,将其与pSuper-miR-1共转染HEK293细胞,利用双萤光报告基因检测系统检测重组萤光素酶的表达情况.（3）利用pSuper-miR-1或miR-1反义寡核苷酸转染接种于Transwell下层小室的HepG2细胞过表达miR-1或下调miR-1水平,检测TransweH上层小室HMSC-bm向下层小室HepG2肝癌细胞的迁移情况.结果 （1）在肝癌细胞,HepG2过表达miR-1能够显著抑制SDF-1蛋白表达和分泌,而下调miR-1水平则能够诱导SDF-1的表达和分泌.（2） miR-1能够抑制携带SDF-1 3UTR的pGL3重组萤光素酶报告基因活性.（3）在Transwell下层小室的HepG2细胞中过表达miR-1后,上层小室中HMSC-bm向下层小室迁移细胞数量显著减少,而下调下层小室HepG2细胞中miR-1表达水平,则明显增加HMSC-bm向HepG2肝癌细胞的迁移.结论 miR-1能够直接抑制肝癌细胞SDF-1的表达和分泌,并藉此降低肝癌细胞对HMSC-bm的趋化作用.     

miR-320a调控非小细胞肺癌细胞的上皮细胞间质化过程研究

 目的 探讨miR-320a对非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)细胞上皮细胞间质化过程的调控作用及其可能的作用机制。方法 选取2017-07至2018-12于菏泽市立医院住院并进行手术治疗的NSCLC患者60例,术中取切除的癌组织和癌旁组织,RT-PCR和Western Blot检测癌组织和癌旁组织miR-320a和FoxM1表达;miR-320a mimics、miR-320a NC和miR-320a inhibitor转染A549细胞,24 h后划痕实验和Transwell小室实验检测细胞迁移、侵袭能力,双荧光素酶报告基因系统预测miR-320a与FoxM1的靶向关系,Western Blot检测FoxM1、E-Cadherin和Vimentin蛋白表达。结果 癌旁组织内miR-320a的表达高于癌组织(P<0.001),FoxM1的阳性细胞率低于癌组织(P<0.001);miR-320a NC组细胞迁移和侵袭能力低于miR-320a mimics组(P<0.001),而高于miR-320a inhibitor组(P<0.001);miR-320a可靶向下调FoxM1的表达水平;FoxM1-WT A549细胞中,miR-320a mimics组细胞E-cadherin表达显著高于miR-320a NC组(P<0.001),Vimentin表达显著低于miR-320a NC组(P<0.001);miR-320a inhibitor组细胞E-cadherin表达显著低于miR-320a NC组(P<0.001),Vimentin表达显著高于miR-320a NC组(P<0.001)。结论 miR-320a在NSCLC中可能作为抑癌基因发挥作用,这种作用可能是通过靶向抑制FoxM1的表达,从而抑制NSCLC细胞的上皮细胞间质化过程而实现的。     

miR-29a抑制胃癌细胞内靶基因VEGF-A的表达及意义

目的 验证胃癌细胞株SGC-7901内miR-29a对靶基因VEGF-A的直接调控作用.方法 采用负载miR-29a的腺病毒载体（Ad-miR29a）感染人胃癌细胞株SGC-7901,上调SGC-7901细胞内miR-29a的表达丰度后,采用RT-qPCR及Western blot法分别检测SGC-7901细胞内VEGF-A在mRNA及蛋白水平的表达;进一步采用双荧光素酶实验及突变实验,验证miR-29a是否通过结合在VEGF-A 3＇UTR而直接抑制靶基因表达.结果 与感染阴性对照Ad-LacZ的SGC-7901细胞相比,感染Ad-miR29a的SGC-7901细胞内VEGF-A蛋白表达下降（0.42±0.02 vs.0.91±0.03,P＜0.01）,且VEGF-A mRNA水平亦下调（0.75±0.21 vs.1.15±0.25,P＜0.05）;荧光素酶实验显示,与阴性对照相比,转染miR-29a mimic后,HEK293细胞萤火虫荧光素酶活性明显下降（0.56±0.13 vs.0.93±0.06,P＜0.05）;而在VEGF-A 3＇UTR与miR-29a的结合位点被突变之后,HEK293细胞萤火虫荧光素酶活性得以恢复.结论 miR-29a通过结合于VEGF-A 3＇UTR相应位点,直接抑制VEGF-A在mRNA及蛋白水平的表达.miR-29a可能成为胃癌基因治疗的有效靶标.     

miR-195重组腺病毒表达载体构建及在细胞中的表达

目的:利用AdEasy系统构建miR-195的腺病毒表达载体,为研究miR-195的功能提供条件.方法:将miRNA-195前体序列从已构建的pcDNA-miR-195载体中克隆进穿梭载体pAdTrack-CMV,通过与骨架载体pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中高效同源重组,获得完整的重组腺病毒质粒.利用HEK293细胞包装并扩增重组腺病毒Ad-195.Ad-195感染肺癌细胞A549后,利用miRNA的定量RT-PCR技术检测Ad-195在细胞中表达miR-195情况.随后荧光素酶报告基因实验证明,Ad-195表达的miR-195能够作用于BCL2基因上预测的miR-195靶位点.结果:实时定量PCR检测显示,Ad-195感染肺癌细胞A549后,miR-195表达水平有显著的上调.结论:miR-195的腺病毒表达载体构建成功,能够用于在细胞内过表达具有生物学功能的miR-195.     

miR-214-5p通过靶向调控PTEN的表达对破骨分化和骨质疏松的影响

 目的 探讨miR-214-5p通过靶向调控PTEN的表达对破骨分化和骨质疏松的影响。方法 选取2019-03至2020-05在空军军医大学唐都医院外科进行脊柱手术的骨质疏松患者20例(骨质疏松组),同时选取非骨质疏松症患者20例为对照组,抽取两组骨髓血。将miR-214-5pmimics(miR-214-5pmimics组)、miR-214-5p空质粒(miR-214-5pvector组)、shZFAS1载体(sh PTEN组)、shZFAS1空载体(sh vector组)转染到骨质疏松患者细胞,对照组细胞不进行任何转染处理。采用RT-qPCR 检测骨髓单个核细胞中的miR-214-5p和PTEN mRNA及 Raw264.7单核巨噬细胞中NFaTc1、MMP9、TRAP、CTSK的mRNA水平;通过TRAP染色检测TRAP染色的阳性率;通过Western blot 检测PTEN、NFATc1、AKT和PI3K蛋白水平。结果 骨质疏松组miR-214-5p水平的表达明显高于对照组(P＜0.001),骨质疏松组PTEN的表达显著低于对照组(P=0.009);miR-214-5pmimics组中TRAP表达阳性率明显高于对照组和miR-214-5p vector组(P＜0.001);sh PTEN组中TRAP表达阳性率明显高于对照组和sh vector组(P＜0.001);miR-214-5p mimics组中的NFaTc1、MMP9、TRAP和CTSK水平显著高于对照组(P<0.001);sh PTEN组中的NFaTc1、MMP9、TRAP和CTSK水平显著高于对照组(P<0.001);与miR-214-5p mimics组相比,miR-214-5pmimics+PTEN组中TRAP表达阳性率显著降低(P＜0.001)。结论 骨质疏松症患者的骨髓单个核细胞中miR-214-5p表达上调,miR-214-5p可以调控PTEN表达,过表达miR-214-5p可能通过靶向PTEN促进破骨细胞分化。     

人源5-羟色胺转运体稳定表达细胞系的建立及其功能探究

目的建立人源5-羟色胺转运体（human serotonin transporter,hSERT）稳定表达细胞系,并对细胞系hSERT的结合活性和重摄取功能进行初步研究。方法采用脂质体转染法将hSERT转染于母细胞,即人胚胎肾（human embryo kidney,HEK）293细胞,应用抗生素G418（800μg/ml）压力筛选,并采用RT-PCR和Western印迹法在基因和蛋白水平对HEK293-hSERT细胞系进行鉴定和稳定性验证;采用放射性配体结合实验检测其与氚标西酞普兰（[3H]-citalopram）的结合活性,并检测其对[3H]5-HT的重摄取功能。结果 RT-PCR和Western印迹结果表明,所建立的HEK293-hSERT细胞系在15代内（P1,P5,P10,P15）均稳定表达hSERT;放射配体结合实验表明,HEK293-hSERT细胞系与[3H]-西酞普兰具有明显的特异性结合;并且在100 nmol/L[3H]5-HT条件下,具有明显的5-HT重摄取功能,这一作用可被10μmol/L的氟西汀所阻断,而母细胞HEK293无此功能。结论本研究所建立的HEK293-hSERT细胞系可稳定表达SERT,并且具有内源性SERT的结合和重摄取功能,是一种稳定表达功能性hSERT的细胞系。     

Synthesis and evaluation of a C-6 alkylated pyrimidine derivative for the in vivo imaging of HSV1-TK gene expression

IntroductionWe report on the synthesis, radiolabeling, in vitro and in vivo characterization of N-Me-[¹⁸F]FHBT (6-(3-[¹⁸F]fluoro-2-(hydroxymethyl)propyl)-1,5-dimethylpyrimidin-2,4(1H,3H)-dione), a C-6-substituted N-1-methylated pyrimidine derivative as a reporter probe for imaging herpes simplex virus type 1 thymidine kinase (HSV1-TK) expression.MethodsN-Me-[¹⁸F]FHBT was synthesized via a standard nucleophilic substitution reaction followed by acidic cleavage of the methoxytrityl protecting group. Cell uptake was studied in vitro with control HEK293 (human embryonic kidney cells) and HEK293 cells stably transfected with nonmutant HSV1-tk (HEK293TK+ cells). Positron emission tomography (PET) imaging and biodistribution studies of N-Me-[¹⁸F]FHBT or [¹⁸F]FHBG were performed in nude mice bearing xenografts of HEK293 control and TK+ cells.ResultsN-Me-[¹⁸F]FHBT was obtained in a two-step reaction in an overall maximal radiochemical yield (decay-corrected) of 5% and a radiochemical purity >96%. The tracer uptake in HSV1-TK containing HEK293TK+ cells was 14.5 times (at 30 min) and 55.4 times (at 240 min) higher than in control HEK293 cells. In mice, N-Me-[¹⁸F]FHBT and [¹⁸F]FHBG accumulated significantly and exhibited similar radioactivity levels in the HEK293TK+ xenografts; however, standardized uptake values ratios between HEK293TK+ and HEK293 control xenografts were higher for [¹⁸F]FHBG than for N-Me-[¹⁸F]FHBT. Both tracers showed high gall bladder and abdominal activity.ConclusionThe biological evaluations demonstrated the feasibility of using N-methylated C-6-substituted pyrimidine derivative N-Me-[¹⁸F]FHBT as a PET radiotracer for monitoring HSV1-TK expression in vivo.