重组水蛭素的研究进展

重组水蛭素是凝血酶特异而有效的抑制剂,以其出血副作用低,不需内源辅因子等特点,成为优于肝素的理想的抗凝抗血栓制剂.本文从结构与功能的关系、毒理学研究、抗凝及抗栓作用、中和作用、药物动力学研究等方面详述了重组水蛭素的特性,并探讨其临床适应症,证实重组水蛭素与天然产物极为相似。大量动物模型实验研究表明重组水蛭素有着良好的临床应用前景.     

水蛭素及其临床应用

水蛭是我国传统中药中常用的活血化瘀药，始载于《神农本草经》，历代本草均有记载。水蛭属于环节动物．俗称蚂蟥。水蛭及其唾液中含有多种活性成份．如：水蛭素（hirudin）、纤维蛋白溶酶活化剂（bementin）、中性粒细胞蛋白抑制剂（eglins）等。水蛭素是水蛭中的重要活性成分。1884年Haycraft发现药用水蛭的提取物中含具有抗凝血活性的物质。1955年这种物质被Markwardt确定为蛋白质，并命名为水蛭素。[第一段]     

重组葡激酶-水蛭素融合蛋白在体外循环抗凝溶栓中的应用比较

目的 探讨与比较抗凝溶栓重组葡激酶-水蛭素融合蛋白在体外循环中的应用优势。方法 2013年2月～2014年7月,选择镍钛合金片分成未包被组(A组)、基础包被组(壳聚糖,B组)、壳聚糖/葡激酶(C组),壳聚糖/水蛭素(D组)、壳聚糖/重组葡激酶-水蛭素融合蛋白(E组),纳入新鲜全人血中进行溶血实验,计算溶血率与血细胞状况。同时健康新生儿脐静脉内皮细胞植入各组别的镍钛合金片,进行细胞相容性实验。结果 5组样品溶血率在1.5%左右,5组的红细胞、白细胞和血小板数量均在正常范围内,各组比较差异均无统计学意义(P<0.05)。E组的增殖程度与黏附程度都明显低于其他4组,对比差异明显(P<0.05); A组与B组的相关比较差异无统计学意义(P>0.05)。随机双盲法细胞计数结果示C,D与E组与A,B组比较差异有统计学显著性意义(P<0.05),同时E组与C,D组对比差异也有统计学意义(P<0.05)。结论 相对于葡激酶与水蛭素的单独应用,重组葡激酶-水蛭素融合蛋白在体外循环中的应用能发挥更强的抗凝、抗血栓作用,安全性好,从而确保心血管疾病介入治疗的有效性。     

水蛭素对大鼠DIC模型脑组织水通道蛋白4表达的干预作用

目的 探讨水蛭素对DIC模型的大鼠脑组织水通道蛋白4(AQP4)表达的干预作用.方法 通过鼠尾静脉滴注脂多糖制作DIC模型,将大鼠分为三组即对照组、DIC组和水蛭素组,选取4个时间点(4,6,8,12 h)测定血小板计数,PT,APTT,纤维蛋白原和D-D水平的变化;同时用免疫印迹杂交法检测大鼠脑组织水通道蛋白4的表达.结果 与对照组相比,DIC组及水蛭素组血小板计数,PT,APTT,纤维蛋白原和D-D差异具有统计学意义(P＜0.05);水蛭素组上述指标变化明显低于DIC组(P＜0.05);AQP4表达在水蛭素组明显低于DIC组(P＜0.05).结论 DIC时产生的凝血酶可能通过上调AQP4蛋白的表达,参与脑水肿形成和发展;水蛭素通过抑制凝血酶的形成,减轻脑水肿.     

低分子肝素和重组水蛭素对兔耳静脉淤血皮瓣成活的影响

背景:低分子肝素和水蛭素都有活血化淤作用。目的:观察局部注射低分子肝素或重组水蛭素对静脉淤血皮瓣成活的影响。方法:在24只兔左耳背制作3cm×6cm静脉淤血皮瓣模型,随机分组:对照组皮瓣下多点注射生理盐水;肝素组皮瓣下多点注射低分子肝素625U/mL,水蛭素组皮瓣下多点注射重组水蛭素1U/mL。结果与结论:①大体观察:术后水蛭素组和肝素组较对照组淤血程度轻,血肿消散快。②皮瓣成活面积百分比:水蛭素组、肝素组明显高于对照组(P<0.01),水蛭素组和肝素组比较差异无显著性意义(P>0.05)。③苏木精-伊红染色结果:对照组术后同期微血管淤血程度较水蛭素组和肝素组严重,微血管计数明显少于水蛭素组和肝素组(P<0.05,P<0.01),水蛭素组微血管计数明显高于肝素组(P<0.01)。说明局部应用低分子肝素或重组水蛭素可较快改善皮瓣的淤血,提高皮瓣成活,重组水蛭素效果优于低分子肝素。     

共价交联水蛭素/海藻酸钠涂层抗凝血修饰膨体聚四氟乙烯人工血管

背景：对于直径小于6mm的血管，血栓形成或内膜增生等原因限制了小口径膨体聚四氟乙烯人工血管的使用。目的：实验拟用共价交联的海藻酸钠和水蛭素层层自组装后对小口径膨体聚四氟乙烯人工血管进行表面修饰和改性，观察其血液相容性。设计：观察性实验。单位：实验于2006-03／2007-06在哈尔滨工业大学生物医学工程中心纳米医药与生物传感器实验室完成。材料：膨体聚四氟乙烯人工血管（W．L Gore＆Associates，Inc．，Flagstaff.AZ，直径4mm）；海藻酸钠购于美国Sigma公司；水蛭素购于Calbiochem公司。方法：首先用全氟磺酸修饰膨体聚四氟乙烯表面，通过静电吸引层层自组装吸附多层海藻酸钠／重氮树脂／水蛭素提供锚定位点，应用BCA法推算吸附在人工血管表面的水蛭素质量。主要观察指标：①材料表面吸附蛋白浓度。②接触角。③衰减全反射．傅立叶变换红外光谱。④扫描电镜表征材料表面形貌及血小板黏附情况。⑤活化部分凝血激酶时间、凝血酶原时间。⑥溶血度。结果：①修饰后的人工血管表面吸附的水蛭素浓度为16-35μg／cm^2。②衰减全反射．傅立叶变换红外光谱结果显示出特征峰位，证明水蛭素成功固定到人工血管表面。③修饰后人工血管的接触角降低，亲水性能增强。④修饰后的人工血管与未修饰的人工血管相比，活化部分凝血激酶时间和凝血酶原时间延长、血小板黏附情况减少，具有更好的血液相容性。结论：共价交联水蛭素，海藻酸钠涂层抗凝血修饰可提高膨体聚四氟乙烯人工血管的表面性能及血液相容性。     

脑出血后水蛭素干预对水通道蛋白4表达的影响

目的:在脑出血后不同时段应用凝血酶抑制剂水蛭素干预,观察其对脑水肿、水通道蛋白4(aquaporin-4,AQP4)及其mRNA表达的影响。方法:将40只健康雄性大鼠随机分为4组,每组10只,采用自体动脉血注入尾状核法制成大鼠脑出血模型,其中1组作为对照组,造模后不予水蛭素干预,另3组分别于造模后6h、12h、18h在血肿内注入水蛭素进行干预,32h后提取脑组织,应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测AQP4mRNA在脑水肿组织的表达,并采用Western blot和免疫组化检测AQP4蛋白在脑水肿组织中的表达,同时用干重、湿重法计算脑组织含水量来表示脑水肿程度。结果:与对照组相比,凝血酶抑制剂水蛭素能减轻脑出血后脑组织的水肿程度,并降低脑组织中AQP4mRNA及AQP4蛋白的表达,在6h和12h干预组中其抑制作用最为明显(P<0.05),且AQP4mRNA及AQP4蛋白的表达减少与脑水肿变化趋势一致。18h干预组的脑水肿程度、AQP4mRNA及AQP4蛋白的表达虽有低于对照组的趋势,但差异无统计学意义。结论:脑出血后,凝血酶抑制剂水蛭素能减少脑组织水肿的程度、降低AQP4mRNA和AQP4蛋白的表达,水蛭素干预组中以6h及12h干预组的作用最为明显。     

水蛭素注射液对脑梗死患者运动功能恢复的影响

观察水蛭素注射液对脑梗死患者运动功能的影响，85例急性脑梗死患者分为治疗组(44例)和对照组(41例)，治疗组应用水蛭制剂(6mL／d，15d为1个疗程)。结果显示两组治疗前神经功能缺损评分接近，治疗后均比治疗前有显著改善，但治疗组治疗后结果显著优于对照组。提示水蛭素注射液可明显改善脑梗死患者的神经功能缺损评分，促进运动功能恢复。     

重组Fc融合蛋白类药物研究进展

自1989年抑制HIV-1感染的CD4-Fc融合蛋白被首次报道以来,Fc融合蛋白的治疗性应用在医药学领域引起广泛关注.Fc融合蛋白由功能分子和免疫球蛋白的Fc结构域组成,不仅具有蛋白的生物学功能且兼具抗体的特性,如在体内具有长半衰期、诱导抗体依赖细胞介导的细胞毒性效应(antibody-dependent cell-m...     

天然、重组水蛭素对随意皮瓣淤血模型血管内皮细胞生长因子的影响

背景:随意皮瓣移植后易发生皮瓣静脉淤血,甚至坏死,临床与动物实验证明水蛭素能够提高淤血皮瓣的成活率。目的:观察水蛭素对大鼠随意皮瓣淤血模型成活保护作用。方法:Wistar大鼠30只背部设计随意皮瓣10cm×3cm制成淤血模型,随机分为天然水蛭素组、重组水蛭素组和对照组,分别于皮下注射5U天然水蛭素、5U重组水蛭素和生理盐水。术后测定血管内皮细胞生长因子含量及血管内皮细胞生长因子mRNA表达量,计算皮瓣成活率。结果与结论:天然水蛭素组与重组水蛭素组皮瓣成活率比对照组高(P<0.05)。天然水蛭素组与重组水蛭素组比对照组新生毛细血管血管内皮细胞生长因子表达多(P<0.05),且天然水蛭素组最多。提示天然、重组水蛭素均能够促进随意皮瓣血管内皮细胞生长因子表达,有利于新生血管的生成,能够提高随意皮瓣的成活率,且天然水蛭素效果优于重组水蛭素。     

重组水蛭素的抗凝和抗栓作用

50年代后期从医用水蛭分离得到天然水蛭素,分子量7000d,系65个氮基酸组成的多肽结构,具有选择性抗凝血酶作用。从那时起水蛭素制剂已在止血诊断和科研中应用。近来随着重组水蛭素(r-hirudin)的开发,进行了深入的实验与临床研究,证实重组水蛭素的结构与天然水蛭素相同。对α凝血酶有高度的特异性和选择性,不需任何内源性辅因子(抗凝血酶Ⅲ或肝素辅因子Ⅱ),一分子水蛭素结合一分子凝血酶,形成高度稳定的复合物。该药不影响FXa 和其他相关的丝氨酸蛋白酶,不仅阻止纤维蛋白凝固,而且亦阻止其他的凝血酶催化反应,如激活因子Ⅴ、Ⅶ和ⅩⅢ。水蛭素-凝血酶复合物还阻止凝血酶诱导的血小板聚集和释放反应,并不影响其他诱导剂的血小板反应。     

天然、重组水蛭素对随意皮瓣淤血模型血管内皮细胞生长因子的影响

背景：随意皮瓣移植后易发生皮瓣静脉淤血,甚至坏死,临床与动物实验证明水蛭素能够提高淤血皮瓣的成活率。目的：观察水蛭素对大鼠随意皮瓣淤血模型成活保护作用。方法：Wistar大鼠30只背部设计随意皮瓣10cm×3cm制成淤血模型,随机分为天然水蛭素组、重组水蛭素组和对照组,分别于皮下注射5U天然水蛭素、5U重组水蛭素和生理盐水。术后测定血管内皮细胞生长因子含量及血管内皮细胞生长因子mRNA表达量,计算皮瓣成活率。结果与结论：天然水蛭素组与重组水蛭素组皮瓣成活率比对照组高（P〈0.05）。天然水蛭素组与重组水蛭素组比对照组新生毛细血管血管内皮细胞生长因子表达多（P〈0.05）,且天然水蛭素组最多。提示天然、重组水蛭素均能够促进随意皮瓣血管内皮细胞生长因子表达,有利于新生血管的生成,能够提高随意皮瓣的成活率,且天然水蛭素效果优于重组水蛭素。     

水蛭素抗凝真空采血管在生化检测中的应用

[目的]评价国产水蛭素作为抗凝剂在生化检测中的应用价值。[方法]采集30例查体职工静脉血标本,同一受试者分别用普通干燥管（对照管）、含分离胶的促凝管、肝素锂抗凝管与水蛭素抗凝管采集各2．5ml,四管同时各检测31个生化项目,比较四种真空采血管的结果;对普通干燥管与水蛭素抗凝管进行相关性分析。[结果]总蛋白、白蛋白、磷、镁、钙、钠、钾、乳酸脱氢酶等8个项目存在组间差异（P〈0．05）。普通干燥管与水蛭素抗凝管的各项指标均高度相关（P〈0．01）。[结论]水蛭素适合于生化检测,某些项目需要建立水蛭素抗凝血浆的正常参考范围。     

青春期功能性子宫出血的治疗方法

青春期无排卵型功能出血的临床症状是完全没有周期规律的子宫出血。常表现为月经周期长短不一，经期延长，经量过多或不规则，阴道流血一般采用雌激素子宫内生长止血，但需雌激素数量较大，止血时间较长，副作用也较明显，患者难以耐受。所以近年来我们采用妈富隆雌、孕激素联合药物治疗效果好，副作用小，现报告如下。     

天然与重组水蛭素对大鼠随意皮瓣淤血模型超氧化物歧化酶、丙二醛、内皮素变化的影响

背景:一般认为天然水蛭素能够提高淤血皮瓣的成活率与其抗血栓、抗凝血酶有关,但其抗炎、抗氧化作用的具体机制尚不清晰。重组水蛭素效果与天然水蛭素的差异也未有深入研究。目的:探索天然、重组水蛭素对大鼠随意皮瓣淤血模型存活保护机制。方法:Wistar大鼠30只,背部设计随意皮瓣10cm×3cm制成淤血模型。皮瓣随机分为天然水蛭素组、重组水蛭素组和对照组,均于术后即刻、第3,5天注射在距皮瓣末端1.5cm和3.0cm处分别注射5U天然水蛭素、5U重组水蛭素和相同剂量生理盐水。观察术后第7天的皮瓣成活率、皮瓣组织细胞形态学改变以及超氧化物歧化酶、丙二醛、内皮素水平。结果与结论:与对照组相比,天然、重组水蛭素组皮瓣成活率高,皮瓣超氧化物歧化酶水平明显增多,内皮素、丙二醛水平减少。且天然水蛭素效果优于重组水蛭素。说明水蛭素能够提高随意皮瓣的成活率、超氧化物歧化酶的含量;减低皮瓣的坏死率、丙二醛、内皮素的含量。     

天然与重组水蛭素对大鼠随意皮瓣淤血模型超氧化物歧化酶、丙二醛、内皮素变化的影响

背景：一般认为天然水蛭素能够提高淤血皮瓣的成活率与其抗血栓、抗凝血酶有关,但其抗炎、抗氧化作用的具体机制尚不清晰。重组水蛭素效果与天然水蛭素的差异也未有深入研究。目的：探索天然、重组水蛭素对大鼠随意皮瓣淤血模型存活保护机制。方法：Wistar大鼠30只,背部设计随意皮瓣10cm×3cm制成淤血模型。皮瓣随机分为天然水蛭素组、重组水蛭素组和对照组,均于术后即刻、第3,5天注射在距皮瓣末端1.5cm和3.0cm处分别注射5U天然水蛭素、5U重组水蛭素和相同剂量生理盐水。观察术后第7天的皮瓣成活率、皮瓣组织细胞形态学改变以及超氧化物歧化酶、丙二醛、内皮素水平。结果与结论：与对照组相比,天然、重组水蛭素组皮瓣成活率高,皮瓣超氧化物歧化酶水平明显增多,内皮素、丙二醛水平减少。且天然水蛭素效果优于重组水蛭素。说明水蛭素能够提高随意皮瓣的成活率、超氧化物歧化酶的含量;减低皮瓣的坏死率、丙二醛、内皮素的含量。     

重组水蛭素十二指肠给药后的抗凝血和抗血栓作用实验研究

近十几年来,不少学者使用经过纯化的天然水蛭素或重组水蛭素进行了一系列的动物实验和临床研究［１,２］,结果发现,作为凝血酶特异性抑制剂的水蛭素,有强的抗凝血和抗血栓形成作用。我们通过十二指肠给药方式研究重组水蛭素的抗凝血和抗血栓形成作用,为口服水蛭素给药提供一些依据。材料和方法１　材料　重组水蛭素冻干粉（比活４０００～５０００Ｕ／ｍｇ）,由中国科学院生物物理研究所制备。凝血酶试剂盒（２５Ｕ／支）为上海医科大学华山医院产品。昆明种小白鼠,体重１８～２０ｇ,雌雄各半。Ｗｉｓｔａｒ大白鼠,体重１５０～２…     

单链抗体分子与链亲和素融合蛋白的制备

研究了抗人纤维蛋白单链抗体分子scFV-8E5与链亲和素融合蛋白的制备。链亲和素拼接在scFV-8E5 cDNA的3’端,制备的融合蛋白单体分子量约45kD。表达产物少数为周质间可溶型蛋白,多数为包涵体。无论是可溶型的蛋白产物或从包涵体中回收并复性的蛋白产物均有结合人纤维蛋白和生物素的功能。这个双特异性融合蛋白的成功制备证明了在scFV-8E5的3’端拼接其它效应分子的可行性。     

水蛭素联合小剂量阿司匹林预防血栓栓塞的疗效观察

目的 探讨水蛭素与阿司匹林联合应用在预防房颤患者血栓栓塞中的作用.方法 40例房颤患者随随机分为水蛭素联合小剂量阿司匹治疗组与单用小剂量阿司匹林治疗组连续用药2 a,治疗前后分别测凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血酶原时间(APTT)、纤维蛋白原浓度(Fib)、最大血小板集聚率(MAR)及观察血栓栓塞、出血等不良事件.结果 2 a后与治疗前相比,联合治疗组PT、APTT明显延长,MAR明显降低,Fib无显著变化,治疗期间无血栓栓塞、出血等不良事件发生.结论 水蛭素联合小剂量阿司匹林能安全有效预防房颤患者血栓栓塞.     

兔心脏缺血再灌注损伤后重组水蛭素的保护作用及其机制

背景：重组水蛭素能否通过抑制白细胞浸润来拮抗心肌缺血／再灌注(ischemia／reperfusion，IR)损伤，从而起到对心肌的保护作用?目的：观察重组水蛭素对缺血心肌内白细胞浸润的影响，进一步探讨重组水蛭素对心肌保护的作用机制。设计：随机对照的实验研究。地点、材料和干预：本实验在第四军医大学唐都医院心血管病实验室完成。选取24只日本大耳白兔随机分为2组，每组12只。IR组：心脏左冠状动脉前降支IR动物模型，缺血45min、再灌注120min，再灌注前后静脉应用生理盐水；重组水蛭素组：缺血45min、再灌注120min，再灌注前15min静注重组水蛭素(1mg／kg)，再灌注时继以持续静滴重组水蛭素[1mg／(kg&;#183;h]120min。主要观察指标：心肌梗死范围及缺血心肌内白细胞浸润的变化。结果重组水蛭素组的心肌梗死范围为(11．7&;#177;2．4)％，与缺血再灌注组的(21．2&;#177;5．3)％比较，梗死范围明显缩小(t=7．436，P&;lt;0．01)。缺血再灌注组的髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性为(56．01&;#177;3．83)nkat／g，重组水蛭素组(35．51&;#177;1．67)nkat／g。重组水蛭素组缺血心肌内白细胞聚集较缺血再灌注组显著减少(t=3．935，P&;lt;0．05)。结论：重组水蛭素能够抑制再灌注期缺血心肌内白细胞浸润，拮抗心肌IR损伤。