胆固醇结石病人肝脏胆小管侧膜ATP基因表达差异的研究

目的:本研究旨在测定比较胆石病人与对照组肝脏胆小管侧膜转运蛋白表达差异,以探讨胆石病发生的分子生物学机制。方法:研究包括20例胆囊胆固醇结石病人和11例无胆石症的对照。测定血清胆固醇和甘油三酯、胆汁胆固醇、胆汁酸和磷脂含量,采用Carey表计算胆汁胆固醇饱和指数。实时定量PCR法测定肝脏胆小管侧膜转运蛋白(ABCG5、ABCG8、ABCBll和ABCB4)mRNA的表达量。结果:胆石组血清胆固醇低于对照组(P<0.05)。胆石组胆汁胆固醇摩尔百分比和胆固醇饱和指数较对照组显著升高(P<0.01)。胆石组肝脏胆小管侧膜胆固醇转运蛋白ABCG5和ABCG8表达高于对照组,且后者差异具有统计学显著性(ABCG5:31.44±3.17Vs25.72±3.27,ABCG8:27.53±3.06vs17.81±2.23)。ABCBll和ABCB4表达在两组间差异无显著性。结论:本研究显示,胆石病主要病理生理异常为胆汁胆固醇过饱和,与肝脏胆小管侧膜胆固醇转运蛋白ABCG5和ABCG8的mRNA表达增加有关。     

胆固醇结石病人肝脏脂质代谢异常的分子生物学研究

目的:研究导致胆石病人胆汁胆固醇过饱和的肝脏胆固醇和胆汁酸代谢途径中的分子生物学改变。方法:收集22例胆石病人和13例无胆石病的对照病人肝脏活检组织、胆囊胆汁和血浆。采用实时定量PCR检测肝脏基因表达,采用Western印迹法测定蛋白含量。结果:胆石病人较对照组ABCG5/ABCG8和LXRα基因的mRNA表达水平分别增加51%、59%和102%。肝脏SRBI的mRNA和蛋白含量均增加。结论:胆石病人ABCG5/ABCG8基因表达上调,可能与LXRα表达增加促进相关,这些异常是导致胆汁胆固醇过饱和的原因。此外,胆汁中过多的胆固醇可能来源于经肝脏高密度脂蛋白受体SRBI的摄取,而不是由于肝脏合成和酯化的异常。     

胆囊黏膜ABCG5和ABCG8与胆囊胆固醇息肉关系的研究

目的:研究胆囊黏膜ABCG5和ABCG8的基因表达与胆囊胆固醇息肉发病的关系.方法:收集63例因胆囊疾患而行腹腔镜胆囊切除术患者的胆石、胆汁及部分胆囊黏膜组织,其中胆囊胆固醇息肉32例,胆囊胆固醇结石18例,对照13例(胆囊腺瘤6例,非胆固醇胆囊结石7例),分别测定胆石胆固醇含量,胆汁胆固醇、胆汁酸、磷脂的浓度,实时定量PCR检测胆囊黏膜ABCG5和ABCG8的mRNA表达.结果:胆固醇息肉组胆汁胆固醇饱和指数较对照组明显增高(P<0.01),结石组胆囊黏膜ABCG5和ABCG8的表达量较息肉组和对照组显著增高,息肉组和对照组ABCG5和ABCG8的表达量差异无统计学意义(P>0.05).结论:胆囊黏膜ABCG5/ABCG8 mRNA的相对低水平表达,可能是导致胆囊胆固醇息肉发病的重要因素之一.     

胆固醇息肉病人胆囊黏膜ABCG1表达的研究

目的:探讨ABCG1基因在胆囊黏膜中的表达与胆固醇息肉病的关系。方法:采集15例胆囊胆固醇息肉病病人和8例无息肉无结石之对照组的胆囊黏膜和胆汁。测定胆汁胆固醇、胆汁酸和磷脂含量;real-time PCR测定胆囊黏膜中ABCG1 mRNA的表达;Western印迹法检测胆囊黏膜ABCG1之蛋白表达。结果:胆固醇息肉组胆汁胆固醇饱和指数、ABCG1mRNA表达均较对照组升高(P<0.05);息肉组中胆囊黏膜ABCG1在蛋白水平较对照组同样存在高表达。结论:胆固醇息肉病人之胆囊黏膜ABCG1基因及蛋白高表达,可能在胆固醇息肉疾病的发生、发展中起一定作用。     

胆结石病人肝脏核受体LRH-1及其调控基因表达的研究

目的 研究胆囊胆固醇结石病人肝脏的肝脏受体类似物1(Liver receptor homolog 1,LRH-1)及其调控的三磷酸腺苷结合盒(ABC)转运体家族成员abcg5/8的表达,探讨胆固醇结石病发病的机制.方法 27例胆囊胆固醇结石病人,男6例,女21例;年龄平均52岁.10例无胆石症的胆囊息肉病人为对照,男6例,女4例;平均年龄48岁.测定胆汁脂类成分和计算胆汁胆固醇饱和指数.实时定量PCR法测定肝脏LRH-1及abcg5/8 mRNA的表达量.结果 胆石组LRH-1表达高于对照组(14.18±1.80vs7.22±2.22,P<0.05),胆石组肝脏abcg基因mRNA表达量均较对照组增高(abcg5:49.34±3.68 vs 33.48±2.77,P<0.05)abcg8:38.93±5.70 vs 18.70±3.42,P<0.05).胆石组胆汁呈胆固醇过饱和(1.17±0.02).结论 该研究结果提示人类肝脏LRH-1及其调控的abcg5/8的表达增高与胆囊胆固醇结石形成有关.     

胆固醇结石病人胆囊黏蛋白基因表达差异的研究

目的研究胆固醇结石病人胆囊黏蛋白基因表达差异,以探讨胆石病发生的分子生物学机制。方法对21例胆囊收缩功能良好的胆囊胆固醇结石病人和12例无胆石的对照组,采用RT-PCR 法测定胆囊 MUC1,MUC2,MUC3,MUC4,MUC5AC,MUC5B,MUC6 mRNA 的表达,以GAPDH 作为内参照。结果胆石组胆囊 MUC1,MUC5AC,MUC5B 和 MUC6表达增高(胆石组 vs对照组:MUC1:67.17±14.06vs36.84±10.00,P>0.05;MUC5AC:90.33±10.24vs53.51±9.38,P<0.05;MUC5B:175.19±7.21vs107.54±23.19,P<0.01;MUC6:71.62±14.36vs44.29±12.35,P>0.05)。MUC3表达在两组间差异无统计学意义。本研究在两组间均未检测到 MUC2和 MUC4基因表达。结论胆囊黏蛋白特别是 MUC5表达增加是胆石病的另一个发病因素。     

胆囊黏膜ABCG5和ABCG8基因在胆固醇结石病中的作用

目的探讨ABCG5和ABCG8基因在胆囊黏膜中的表达与胆固醇结石病的关系。方法采集28例胆囊胆固醇结石病患者和10例无胆石对照的胆囊黏膜和胆汁、胆石。测定胆汁胆固醇、胆汁酸和磷脂含量;Real-time PCR测定胆囊黏膜中ABCG5和ABCG8的表达量。结果胆石组中胆固醇摩尔百分比和饱和指数均较对照组显著升高(P<0.01);ABCG5和ABCG8的表达呈显著正相关(r=0.55,P<0.01),胆石组中ABCG5和ABCG8的mRNA表达分别是对照组的2.8倍(P<0.01)和1.9倍(P<0.05)。结论胆固醇结石病患者的胆囊黏膜ABCG5和ABCG8基因表达增高,限制了胆囊上皮对胆固醇的吸收,使胆汁过饱和状态得以维持。     

肝脏X受体对小鼠胆汁脂质成分与胆固醇代谢基因表达的影响

目的 通过激活小鼠肝脏X受体,观察胆汁脂质成分变化与胆固醇代谢相关基因的表达情况,观察肝脏X受体在胆石病发生中的作用.方法 C57BL小鼠18只,分为2组,分别管饲肝脏X受体激动剂T0901317和安慰剂.分析胆汁脂质成分.实时定量PCR法测定肝脏与腹腔巨噬细胞的胆固醇代谢相关基因mRNA表达量.结果 实验组胆汁胆固醇摩尔百分比较对照组升高89%.实验组肝脏组织Abcg5、Abcg8、Abca1与Srebp1表达显著高于对照组:Abcg5为2.96±0.55比1.10±0.22(P＜0.01);Abcg8为0.86±0.16比0.29±0.07(P＜0.01);Abca1为8.45±1.06比5.51±0.84(P＜0.05);Srebp1为14.08±3.18比3.06±0.74(P＜0.01).腹腔巨噬细胞Abca1表达实验组高于对照组(27.66±7.18比8.39±3.65,P＜0.05).结论 肝脏X受体激活使胆固醇逆转运增强,肝脏摄取的过多胆固醇通过胆汁清除,导致胆汁胆固醇含量升高,提示肝脏X受体在胆石病发生中有重要作用.     

家族性胆固醇结石患者肝组织CYP7A1 mRNA的表达

目的:研究家族遗传性胆囊胆固醇结石患者、散发性胆固醇结石患者和非结石患者肝组织CYP7A1基因mRNA的表达改变及其与胆汁成石性变化的关系.方法:应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术,研究了28例具有家族遗传性胆囊胆固醇结石患者、30例散发性结石患者和32例非结石患者肝组织CYP7A1 mRNA的表达变化;并采用生物化学技术行胆汁脂质分析,计算成石指数.结果:家族遗传性和散发性胆固醇结石组CYP7A1 mRNA表达水平较非胆固醇结石组降低,差异有显著性;在家族遗传性和散发性胆固醇结石组两组间无统计学差别;各组肝组织CYP7A1 mRNA表达与胆汁成石指数(LI)呈负相关.结论:胆囊胆固醇结石患者肝组织CYP7A1 mRNA水平降低,因而CYP7A1 mRNA表达下调可能是胆囊胆固醇结石形成的重要原因之一;CYP7A1是决定胆汁成石性和胆囊胆固醇结石发生的一个重要基因.     

家族性胆固醇结石病人SCP2基因表达的研究

目的 研究具有家族性胆囊胆固醇结石病人、非家族性胆囊胆固醇结石病人和非结石病人肝组织SCP2基因的表达情况.方法 应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术,研究了28例具有家族遗传性胆囊胆固醇结石病人、30例非家族性胆囊胆固醇结石病人和32例非胆固醇结石病人肝组织SCP2 mRNA的表达水平;同时应用Western blotting法分别检测三组病人肝组织中SCP2蛋白含量变化;并采用生化技术行胆汁脂质分析,计算成石指数.结果 家族遗传性和非家族遗传性胆固醇结石组SCP2 mRNA表达水平较非胆固醇结石升高,差异有显著性;家族遗传性胆固醇结石SCp2 mRNA表达水平较非家族性胆固醇结石升高,差异有显著性;SCP2蛋白水平的变化与SCP2mRNA变化一致,差异有显著性.结论 胆囊胆固醇结石病人肝组织SCP2 mRNA表达水平升高,SCP2基因表达上调可能是胆囊胆固醇结石形成的重要原因;SCP2基因表达水平上调则可能在遗传中起一定作用.     

新疆维吾尔族ABCG8和NPC1L1基因多态性与胆囊结石病的关系

目的:研究新疆维吾尔族ATP结合盒G8(ABCG8)基因和尼曼-匹克C1样1蛋白(NPC1L1)基因单核苷酸多态性与胆囊结石病的关系。方法:采集43例新疆维吾尔族胆囊结石病人和96例无胆结石对照病人的外周静脉血,提取基因组DNA。用实时定量PCR的等位基因分型法确定ABCG8基因T400K、Y54C、D19H和NPC1L1基因-762 TC、1679 CG的基因型。结果:在所有病人中,NPC1L1基因1679 G在胆石组与对照组中的分布无统计学差异(32.6%比26.6%,P=0.306);但在女性胆石组中,1679 G频率明显高于对照组(36.7%比19.4%,P0.05)。NPC1L1基因-762 TC位点以及ABCG8基因3个位点在两组间的分布无差异。结论:携带NPC1L1基因1679 G等位基因可能与新疆维吾尔族女性胆石病发病存在相关性。     

胆结石小鼠肝脏核受体基因LRH-1及其调控基因CYP7A1的表达

目的:探讨胆固醇结石(GS)小鼠肝脏的核受体基因——肝核受体类似物1(liver receptor homolog 1,LRH-1)及其调控基因胆固醇7α-羟化酶(cholesterol 7-αhydroxylase,CYP7A1)的表达。方法:雌性C57BL/6小鼠40只,分为2组,每组20只,分别予以正常饮食、高脂饮食喂养10周后处死。病理切片检查小鼠胆囊壁细胞组织学改变,实时定量PCR法测定肝脏LRH-1及CYP7A1表达量。Western Blot方法测定肝脏上述基因蛋白的表达量。结果:胆结石小鼠胆囊壁细胞呈现炎性改变。胆石组小鼠LRH-1 m RNA及蛋白表达均高于对照组(P0.01),CYP7A1 m RNA及蛋白表达量较对照组升高(P0.01)。结论:啮齿动物肝脏LRH-1和CYP7A1的表达异常与胆囊胆固醇结石形成有关,可能共同在小鼠胆结石形成中发挥作用。     

豚鼠胆囊胆固醇结石形成过程中小肠动力的变化

目的 观察豚鼠胆囊胆固醇结石形成过程中小肠动力的变化,探讨其在胆囊结石形成中的作用.方法 将40只豚鼠随机分为实验组与对照组,每组20只,实验组给予致石饲料(胆固醇含量2％),对照组给予正常颗粒饲料,8周造模结束后,利用多通道生理记录仪分别记录实验组与对照组豚鼠离体小肠肌条慢波和张力变化,分析其与胆囊胆固醇结石形成的关系,组间比较采用t检验.结果 豚鼠小肠离体肌条慢波频率实验组为5.70±1.05次／min,对照组为17.45±1.50次／min,振幅实验组为0.23±0.31 mv,对照组为0.78 ±0.17 my,实验组数据较对照组明显降低,P值分别为:4.56×10-25,4.00×10-13,均＜0.05;组间比较t值分别为:-27.083,-13.236;豚鼠小肠离体肌条肌肉收缩频率实验组为5.94±1.25次／min,对照组为15.85±1.76次/min,张力效应值实验组为0.78±0.02g,对照组为1.20±0.11g,实验组数据较对照组明显降低,P值分别为2.41×10-20,1.55×10-13,均＜0.05;组间比较t值分别为:- 19.448,- 17.307.结论 致石组豚鼠小肠动力较对照组明显下降,提示小肠动力异常可能在胆囊胆固醇结石形成过程中发挥作用.     

ABCG2和OCT4在胆囊癌组织中的表达及临床意义

目的:探讨ABCG2和OCT4在胆囊癌组织中的表达及临床意义。方法:应用实时荧光定量PCR法检测新鲜的胆囊良、恶性组织中ABCG2和OCT4 mRNA中的表达。采用Western印迹法检测新鲜的胆囊良、恶性组织中ABCG2和OCT4蛋白的表达。采用免疫组化法检测40例胆囊癌组织和8例慢性胆囊炎组织石蜡切片中ABCG2和OCT4的表达水平。对ABCG2和OCT4表达情况进行统计学处理,并分析其与临床病理特征之间的关系。结果:①实时荧光定量PCR显示,胆囊癌组织中ABCG2和OCT4 mRNA中的表达分别为(117.9±10.5)和(86.2±13.2),均高于慢性胆囊炎组织[(27.1±7.9)和(2.1±1.0)]的表达,各组间有统计学差异。②Western印迹法检测显示,ABCG2蛋白在胆囊癌组织中的表达水平较强,而在慢性胆囊炎组织表达较弱;在慢性胆囊炎组织中未见OCT4蛋白表达,而在肿瘤中都有表达。③免疫组化实验结果显示,ABCG2的阳性表达率在胆囊癌和慢性胆囊炎组分别为60.0%和37.5%,两组间有统计学差异(P0.05),但与周围脏器侵犯与否、癌组织分化程度及病理TNM分期有关(P<0.05)。结论:与慢性胆囊炎组织相比,ABCG2和OCT4在胆囊癌组织中的转录和翻译水平都有过表达。ABCG2和OCT4的表达水平与胆囊癌侵袭能力、分化程度及TNM分期有关,且两者表达呈正相关;提示ABCG2和OCT4是反映胆囊癌生物学行为的重要指标。     

人胆囊癌细胞系GBC-SD中侧群细胞的耐药性研究

目的 研究人胆囊细胞系GBC-SD中侧群细胞(side population cells,SP)的耐药特性,并探讨其耐药机制.方法 利用流式细胞术分选SP、非SP细胞,采用MTT检测2种细胞亚群对5种化疗药物吉西他滨、顺铂、5-氟尿嘧啶、表阿霉素、米托蒽醌的药物敏感性;利用流式细胞术检测吉西他滨处理的人胆囊癌细胞系GBC-SD中SP细胞比例的变化,并通过RT-PCR、Western印迹检测SP、非SP细胞亚群中ABCG2 mRNA和蛋白的表达.结果 吉西他滨、顺铂、5-氟尿嘧啶、米托蒽醌以对胆囊癌细胞系GBC-SD的IC50浓度分别作用SP、非SP细胞亚群1 d后,SP细胞的增殖能力高于非SP细胞,两组之间的差异具有统计学意义(P<0.05),而表阿霉素处理水平的两组间差异无统计学意义(P>0.05);人胆囊癌细胞系GBC-SD经过吉西他滨处理3周后,SP细胞的比例显著升高(8.02%±0.13%比0.62%±0.08%,P<0.05),且SP细胞明显高表达ABCG2基因.结论 人胆囊癌细胞系GBC-SD中SP细胞具有类似干细胞的耐药特性,耐药基因ABCG2高表达是其耐药的重要机制.

Abstract：

Objective To investigate the drug resistance of side population cells in human gallbladder cancer cell line GBC-SD and explore its mechanism. Methods Drug sensitivity assays of 5chemotherapeutic agents were performed on side population cells (SP) and non-SP cells of GBC-SD.GBC-SD was cultured and then treated with the chemotherapeutic agent gemcitabine. The frequency of SP by FACS was measured. RT-PCR and Western blotting were used to detect the expression of AB-CG2 in both the SP and the corresponding non-SP subsets. Results After 1 d treatment with 4 chemotherapeutic agents (gemcitabine, cisplatin, 5-fluorouracil and mitoxantrone) in IC50 concentration to GBC-SD cell line, the reproductive ability of SP was higher than that of non-SP (P<0.05). However, statistical significance was not achieved when compared with epirubicin (P>0.05). The percentage of SP in GBC-SD treated with chemotherapeutic agent gemcitabine after 3 weeks was sharply elevated by FACS (8.02% ±0.13% vs 0.62% ±0.08%, P<0.05), and the expression of ABCG2mRNA and protein were increased in SP as compared with non-SP. Conclusion SP from human gallbladder cancer cell line GBC-SD, like stem cell, showed a heighten resistance to drugs. Increased expression of ABCG2 was largely responsible for the multi-drug resistance.