脑缺血再灌注后少突胶质细胞转录因子Olig1、轴突生长抑制因子Nogo-A基因表达与白质损伤

目的 检测少突胶质细胞转录因子Olig1、轴突生长抑制因子Nogo-A在大鼠脑缺血再灌注后不同时间点基因表达的变化规律,观察白质损伤的病理变化,探讨两者之间的关系.方法 利用线栓法制备大鼠大脑中动脉缺血(middle cerebral artery occlusion,MCAO)再灌注模型,实时定量PCR方法(relative quantification PCR,RQ-PCR)检测各时间点Olig1、Nogo-A在大脑损伤白质区的基因表达,髓鞘快蓝-高碘酸雪夫(LFB-PAS)染色法标记大脑神经髓鞘,Bielschowsky银染法标记大脑神经轴突,并计算缺血侧与健侧髓鞘染色的积分吸光度(Ias)比值以代表白质受损程度.结果 (1)Olig1:Olig1在缺血再灌注不同时间点,在大脑白质区的基因表达量不同.缺血再灌注6 h Olig1表达量减低至假手术组的83%(与假手术组相比,q=2.074,P=0.042),7 d时表达量降至最低,14 d时恢复至基础水平,21 d时表达最升高至假手术组的1.52倍(与假手术组相比,q=6.362,P＜0.01,差异具有统计学意义).Nogo-A:Nogo-A在缺血再灌注不同时间点,在大脑白质区的基因表达量不同.Nogo-A 基因表达在缺血再灌注1 d时开始减低,表达量降至假手术组的84%(与假手术组相比,q=2.230,P=0.029),7 d时降至最低,14～21 d表达量开始上调,21 d时表达量上调至假手术组的66%(与假手术组相比,q=4.681,P＜0.01).(2)缺血再灌注不同时问点髓鞘染色Ias比值不同,再灌注6 h时开始下降(0.91±0.05),与假手术组(1.03 ±0.09)相比,q=3.829,P＜0.01;12 h时有空洞形成,再灌注14 d髓鞘损伤达到高峰,Ias比值降到最低(0.31±0.07),髓鞘脱失明显;21 d的髓鞘Ias比值(0.30±0.06)与14 d(0.31±0.07)相比较差异无统计学意义(q=0.257,P=0.798).轴突变化规律与髓鞘基本相同.结论 Olig1、Nogo-A在脑缺血再灌注损伤过程中呈现动态变化规律,并与白质损伤的变化规律基本相同,提示Olig1、Nogo-A可能参与了再灌注损伤的病理生理过程,并与缺血再灌注白质损伤及修复密切相关.     

脑缺血再灌注损伤后GAP-43蛋白的表达和意义

目的 探讨脑缺血再灌注损伤后生长相关蛋白-43（GAP-43）的表达对神经元轴突再生的可塑性变化.方法 成年健康雄性Wistar大鼠40只,随机分为正常对照组、假手术组和缺血1h再灌注2h、6h、12h、24h、48h、3d、7d、14d组,每组各4只（n=4）.应用线栓法制备大鼠脑中动脉闭塞再灌注模型（MCAO）,采用免疫组织化学方法检测GAP-43的表达并观察神经元轴突再生的变化,并进行计算机图像分析.结果 缺血再灌注2h,海马、皮质区及纹状体区GAP-43呈基础表达,6h、12h、24h、48h表达逐渐增高,7d达高峰,P＜0.05,14d达最低表达,P＜0.05.与假手术组比较有显著性差异,P＜0.05.正常对照组无表达.缺血再灌注48h～7d损伤区域神经元轴突呈出芽征,发出突触纤维.结论 脑缺血再灌注损伤后GAP-43呈非特异性表达,并促进神经元的修复和再生.     

脑缺血再灌注大鼠脑内angiogenin的动态变化

目的观察大鼠脑缺血再灌注后angiogenin（ANG）在脑内表达水平的动态变化。方法大鼠大脑中动脉栓塞法（MCAO法）制作脑缺血再灌注模型,免疫组化染色检测ANG表达水平。结果ANG在正常大鼠脑内普遍弱阳性表达,脑膜、室管膜及血管染色较强。脑缺血2h再灌注3h后缺血脑区ANG表达水平较对侧增强（P＜0．05）,缺血再灌注24h后ANG表达水平达高峰,缺血再灌注3d及7d时ANG表达维持较高水平,缺血再灌注14d时ANG表达水平有所降低,但仍高于对照组,缺血再灌注21d时ANG表达水平与对照无显著差别。结论脑缺血再灌注大鼠缺血脑区ANG表达水平增强,并且表达水平随缺血再灌注后时间而变化。     

bFGF和PDGF-B蛋白在脑缺血再灌注大鼠模型中的表达和血管形成的研究

目的 探讨脑缺血再灌注大鼠不同时间碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和血小板源性生长因子-B(PDGF-B)的表达水平及其与血管形成的关系。方法 采用线栓法制备大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血再灌注(MCAO/R)模型,分为假手术组和MCAO/R组,MCAO/R组缺血2 h后根据再灌注时间窗的不同分为0、6、24 h、3、7、14、21 d共7组,应用HE染色观察病理变化并测定脑梗死体积,用免疫组化法检测CD34蛋白的表达水平并计数微血管密度(MVD),用免疫组化法检测bFGF和PDGF-B蛋白的表达水平。结果 bFGF蛋白表达水平在MCAO/R 6 h后即开始升高,3 d到达高峰,7 d开始降低。PDGF-B蛋白表达水平在MCAO/R 24 h后明显升高,3 d到达高峰,7 d有所下降,持续到14 d左右。MVD表达在MCAO/R 3 d开始升高,7 d到达高峰。bFGF和PDGF-B蛋白表达水平与MVD变化呈正相关(P<0.01)。结论 局灶性脑缺血再灌注损伤可诱导bFGF、PDGF-B和新生血管表达增加,激活内源性脑保护机制。     

局灶性脑缺血预适应后大鼠血浆皮质醇含量变化

目的探讨脑缺血预适应后糖皮质激素与皮层神经元损伤的关系。方法利用线栓法建立大鼠大脑中动脉脑缺血再灌注模型,通过放射免疫方法测定脑缺血再灌注后各组大鼠再灌注3h、12h、24h和48h各时点的血浆皮质醇含量变化。结果缺血组和预缺血组在再灌注4个时点糖皮质激素含量均有增高,同对照组、假手术组相比有显著差异（P〈0．01）。预缺血组与缺血组相比,预缺血组在再灌注4个时点糖皮质激素含量低于缺血组（P〈0．05）。HE染色皮层神经元损伤显著,预缺血组明显轻于缺血组。结论脑缺血预适应导致缺血再灌注后血浆糖皮质激素含量降低,这可能是其减轻皮层神经元损伤的原因之一。     

活性氧在脑缺血-再灌注损伤后动态表达

目的观察活性氧(ROS)在大鼠脑缺血—再灌注损伤不同时间缺血灶周区皮质的动态表达。方法健康成年SD雄性大鼠(n=55),随机分成假手术组(n=5)和模型组(n=50),模型组按再灌注时间分为10个组,即脑缺血—再灌注1h、3h、6h、12h、1d、3d、5d、7d、14d和28d组,每组5只大鼠。通过阻塞大脑中动脉(MCAO)制作大鼠局灶性脑缺血—再灌注损伤模型,采用改良神经功能严重性评分(m NSS)对不同时间点大鼠的神经功能进行评价,采用流式细胞术检测缺血灶周区ROS和血管内皮生长因子(VEGF)动态时空表达。结果假手术组未见神经功能损伤,评分为0。脑缺血—再灌注1h大鼠出现神经损伤,3h~1d时症状加重,3~7d时症状有所改善,14~28d症状明显好转。假手术组有少量ROS和VEGF表达,脑缺血再灌注损伤后1h缺血灶周区ROS急剧上升,3~6h有所下降,但仍远高于假手术组,后逐渐下降,3d时降到最低,与假手术组相仿,随后迅速上升,5d时已超过6h数值,7d时接近1h高度,后ROS表达呈平台期,VEGF表达趋势与其相仿,ROS表达与神经功能评分呈负相关。结论 ROS可能在脑缺血损伤中起双相作用,在超早期参与脑损伤过程,后期可能参与脑修复作用。     

大鼠局灶性脑缺血再灌注后瞬时感受器电位C1、M7的表达变化

目的 研究大鼠局灶性脑缺血再灌注后瞬时感受器电位(TRP)C1和TRPM7的表达变化,进一步探讨局灶性脑缺血再灌注损伤的分子病理机制.方法 将50只Wistar大鼠按照随机数字表法分为假手术组、缺血2h再灌注3 h组、缺血2h再灌注12h组、缺血2h再灌注24h组、缺血2 h再灌注72 h组,每组10只.线栓法建立大鼠大脑中动脉阻塞再灌注模型,应用RT-PCR、Western blot和免疫组化染色方法分别检测再灌注后不同时相缺血侧皮层TRPC1和TRPM7 mRNA和蛋白水平的表达.结果 假手术组TRPC1和TRPM7均有均有少量表达.脑缺血2 h再灌注3 h TRPC1表达开始增加,随再灌注时间的延长表达逐渐增强,至再灌注12 h达高峰,然后逐渐减弱,再灌注72 h时仍高于假手术组水平,差异均有统计学意义(P<0.05).TRPM7表达也随再灌注时间的延长而增加,高峰在再灌注24h.结论 TRPC1和TRPM7参与了局灶性脑缺血再灌注损伤的病理过程.     

促红细胞生成素对大鼠脑缺血再灌注损伤后缺血侧皮层神经元凋亡和Bcl-2表达的影响

目的探讨促红细胞生成素(Erythropoietin，EPO)对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后的保护作用。方法采用线栓法阻断大鼠一侧大脑中动脉(MCA)血流2h，再灌注24h制成局灶性脑缺血再灌注损伤模型。将32只雄性SD大鼠随机分成EPO组、缺血再灌注组、假手术组和正常组。于缺血开始时EPO组给EPO 3000U／kg腹腔注射；缺血再灌注组和假手术组给予等剂量生理盐水。再灌注24h后断头取脑、切片，进行HE染色、Bcl-2免疫组化染色和细胞凋亡检测。结果缺血2h再灌注24h后，EPO组和缺血再灌注组大鼠缺血侧皮层可检测到凋亡细胞，且EPO组凋亡细胞数明显少于缺血再灌注组，假手术组和正常组未见凋亡细胞；EPO组和缺血再灌注组缺血侧皮层Bcl-2阳性细胞数均高于假手术组和正常组，与缺血再灌注组相比，EPO组Bcl-2蛋白表达显著增高。结论EPO可抑制缺血再灌注损伤后缺血侧皮层的细胞凋亡，其机制可能是通过上调bcl-2基因表达而实现。     

DWI动态评价大鼠脑缺血—再灌注损伤区的组织学特征

目的本研究运用磁共振弥散加权成像(DWI)技术动态评价大鼠脑缺血—再灌注损伤后不同时间脑损伤区DWI信号强度(SI)及表观扩散系数(ADC)的变化,结合组织学检测,分析损伤区组织学特征。方法健康成年SD雄性大鼠(n=80)随机分成8组,分别为脑缺血—再灌注1h、3h、6h、12h、1d、3d、7d组和假手术组,采用线栓法制作大鼠右侧大脑中动脉缺血—再灌注(MCAO/R)模型,Zea Longa评分评价神经功能损伤程度,Philips Achieva 3.0T MR扫描仪对假手术组和缺血—再灌注后不同时间点大鼠脑部行冠状位DWI扫描,在工作站上重建ADC图,测量基底核层面梗死灶DWI-SI和ADC值,计算相对ADC值(r ADC)和相对DWI-SI(r DWI-SI)值。2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色评价梗死体积的变化。苏木精—伊红染色观察组织形态学变化。结果假手术组动物麻醉苏醒后未见神经功能缺损,脑缺血—再灌注1h大鼠出现神经损伤,3h~1d时症状逐渐加重,3~7d时症状改善。假手术组DWI及ADC图均未见异常信号;MCAO/R后1h DWI上右侧纹状体及周围部分皮质区域出现高信号,相应部位ADC值降低,1h~1d DWI高信号范围随时间推移逐渐增大,信号强度逐渐增高,3~7d时开始降低;r ADC值随时间先降低后升高,6h达到最低,12h开始回升,1d时r ADC值较12h稍降低(P0.05),3d时r ADC升高,7d时与假手术组无明显差异(P0.05);1h~1d r DWI-SI持续升高,1d达最高峰,3~7d开始下降,7d时仍明显高于假手术组。苏木精—伊红染色显示假手术组右侧海马及皮质区结构未见明显异常;缺血—再灌注12h缺血侧海马区及皮质区出现可见部分浓染细胞和胞浆空泡形成,核固缩,但细胞排列尚好;1d时缺血侧神经元缺血损伤加重,细胞排列紊乱,细胞间隙增宽,出现大量胞浆空泡化,核固缩显著;3d时缺血侧海马区空泡化有所减轻。假手术组TTC染色未见梗死区域;脑缺血—再灌注1h可见右侧纹状体及周围少许皮质梗死;1h~1d梗死体积逐渐增大,1~3d时达到峰值,7d时梗死体积减小。1h~1d缺血侧脑水肿体积随时间持续增加,1d达到高峰,3d时开始下降,7d明显减轻。模型组各时间点神经功能评分与相应时间点基底核区梗死灶r DWI-SI呈显著性正相关(r=0.503,P=0.000);相应时间点脑梗死体积、水肿体积与r DWI-SI均呈显著性正相关(r=0.542,P=0.001;r=0.740,P=0.000)。结论磁共振弥散加权成像获得的DWI-SI及ADC值,对评价脑缺血再灌注损伤组织学特征具有高度的敏感性和特异性,对脑缺血—再灌注损伤后缺血区的动态改变具有直观的价值。     

促红细胞生成素对大鼠脑缺血再灌注损伤后缺血侧皮层神经元凋亡和Bcl-2表达的影响

目的　探讨促红细胞生成素 (Erythropoietin ,EPO)对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后的保护作用。方法　采用线栓法阻断大鼠一侧大脑中动脉 (MCA)血流 2h ,再灌注 2 4h制成局灶性脑缺血再灌注损伤模型。将 3 2只雄性SD大鼠随机分成EPO组、缺血再灌注组、假手术组和正常组。于缺血开始时EPO组给EPO 3 0 0 0U/kg腹腔注射 ;缺血再灌注组和假手术组给予等剂量生理盐水。再灌注 2 4h后断头取脑、切片 ,进行HE染色、Bcl -2免疫组化染色和细胞凋亡检测。结果　缺血 2h再灌注 2 4h后 ,EPO组和缺血再灌注组大鼠缺血侧皮层可检测到凋亡细胞 ,且EPO组凋亡细胞数明显少于缺血再灌注组 ,假手术组和正常组未见凋亡细胞 ;EPO组和缺血再灌注组缺血侧皮层Bcl -2阳性细胞数均高于假手术组和正常组 ,与缺血再灌注组相比 ,EPO组Bcl-2蛋白表达显著增高。结论　EPO可抑制缺血再灌注损伤后缺血侧皮层的细胞凋亡 ,其机制可能是通过上调bcl-2基因表达而实现。