重组腺病毒IκBαM在人肝癌细胞HepG2中的表达及对NF-κB活性的抑制

目的　检测重组腺病毒IκBαM (AdIκBαM)在肝癌细胞HepG2 中的表达及TNF α诱导下IκBαM变化情况 ,并观察此超级抑制物对NF κB活性的抑制作用。方法　利用GFP及有限稀释法测定病毒滴度和感染靶细胞的效率 ,Western印迹法检测 2 93细胞和HepG2 中重组腺病毒介导IκBαM的表达及TNF α诱导下IκBαM变化情况 ,EMSA观测感染AdIκBαM前后经TNF α处理的HepG2 细胞核中NF κB活性水平的变化。结果　扩增AdIκBαM的滴度为 2× 10 8pfu/ml,MOI为 2 0 ;AdIκBαM在HepG2 中能稳定高效表达且不因TNF α的诱导而降解 ,未感染细胞基础水平的IκBα及转入的AdIκBα对照则随诱导时间延长而呈现先逐渐降低后升高的趋势。EMSA显示 ,感染AdIκBαM的细胞在处理前后均无NF κB活化迹象 ,而未感染及感染AdIκBα的细胞经TNF α诱导后则有NF κB过度活化情况。结论　AdIκBαM能高效扩增并有效感染靶细胞HepG2 ,能在HepG2 细胞中稳定高水平表达 ,且不会被TNF α诱导而降解 ,能稳定有效的抑制HepG2 细胞中NF κB的过度活化 ,上述结果初步表明 ,通过IκBαM超级抑制物抑制NF κB的活性 ,再辅以常规的抗肿瘤治疗 ,有望成为一种十分有效的肿瘤基因治疗方法。     

重组腺病毒IκBαM抑制高糖诱导的血管内皮细胞凋亡

目的 研究NF-κB在高浓度葡萄糖(高糖)诱导的ECV-304血管内皮细胞凋亡中的作用。方法 用携有NF-κB抑制物IκBα突变体的IκBαM重组腺病毒(AdIκBαM)感染ECV．-细胞,利用Western Blot、EMSA、电镜、流式细胞仪等检测方法,研究NF-κB在高糖诱导的血管内皮细胞凋亡中所起的作用,以及阻断NK-κB活性对血管内皮细胞凋亡及细胞周期改变的影响。结果 高糖能诱导ECV-304细胞IκBα的降解和NF-κB的激活,G0/G1百分比增加,S和C2／M比例下降,延缓G0/G1向S期过渡,出现细胞凋亡的形态学改变,而感染AdIκBα的ECV-304／IκBαM细胞则能加速G0/G1向S期过渡,未出现细胞凋亡的形态学改变。结论 AdIκBαM能抑制高糖诱导的ECV-304细胞NF-κB的过度活化及对ECV-304细胞的致凋亡作用,加速细胞周期转换,证实NF-κB的激活在高糖所致的内皮细胞凋亡及生长周期的改变过程中起重要作用。     

重组腺病毒介导siRNA抑制大鼠肝细胞NF-κB p65的表达

目的构建重组腺病毒Ad-NF-κB p65-siRNA，并观察其抑制大鼠肝细胞NF-κB p65表达的效果。方法（1）筛选针对大鼠NF-κB p65特异性siRNA靶序列，设计合成其对应的双链DNA，插入到pShuttle—H1中，得到psiRNA—NF-κB p65质粒。将构建好的psiRNA—NF-κB p65质粒与腺病毒骨架载体pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行重组，酶切鉴定、293A细胞包装、扩增，得到重组腺病毒Ad—NF-κB p65-siRNA。（2）将构建好的Ad—NF-κB p65-siRNA转染大鼠肝细胞株BRL，48h后，采用RT-PCR和Western blot检测NF-κB p65表达。结果成功地构建了重组腺病毒Ad—NF-κB p65-siRNA；Ad—NF-κB p65-siRNA转染大鼠肝细胞48h后，NF—κB的mRNA水平下降了81％，细胞内的NF—κB蛋白浓度下降了71％。结论腺病毒介导的RNAi技术体外显著地抑制大鼠肝细胞NF-κB p65的表达。     

NF-κB报告基因重组腺病毒的构建及活性分析

目的:探讨基于腺病毒载体的核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)报告基因系统作为NF-κB上游调控信号分子筛选模型的可行性。方法:利用5型E1/E3缺陷型腺病毒载体pAdxsi构建NF-κB报告基因的重组腺病毒,并利用该腺病毒感染多种贴壁细胞和悬浮细胞进行NF-κB报告基因的活性分析。结果:成功构建了NF-κB报告基因重组腺病毒Ad-NF-κB-luc,其能够感染HepG2、MGC803、THP-1、U937等细胞,肿瘤坏死因子α(tumor necrosisfactor-α,TNF-α)或脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激显示重组腺病毒携带的NF-κB报告基因具有活性。结论:以腺病毒Ad-NF-κB-luc作为NF-κB报告基因的转移载体,不仅可以感染常规方法难以转染的细胞系,而且产生的报告基因活性稳定可靠,拓展了NF-κB报告基因的应用范畴。     

人CTIA4Ig，IκBα双基因共表达腺病毒载体的构建

目的制备细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4融合蛋白(cytotoxic T lymphocytic associated antigen4，CTIA4Ig)和核因子的抑制蛋白(inhibition of NF-κB，IκBα)双基因共表达腺病毒载体。方法将IκBα和CHA4Ig通过内部核糖体进入部位(internal ribosome entrysite，IRES2)连接，并以基因重组的形式插入腺病毒表达载体，以同源重组的形式转染293细胞，构建重组腺病毒。结果①成功构建Padtrack-CMV—CTLA4Ig-IRES2表达质粒；②与BJ5183重组后转染293，获得重组腺病毒；③PCR鉴定重组腺病毒正确。结论构建了人CHA4IGg，IκBα双基因共表达腺病毒载体，为进一步研究其在免疫耐受中的作用提供研究基础。     

人CTLA4Ig,IκBα双基因共表达腺病毒载体的构建

目的制备细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4融合蛋白(cytotoxic T lymphocytic associated antigen 4, CTLA4Ig)和核因子的抑制蛋白(inhibition of NF-κB, IκBα)双基因共表达腺病毒载体.方法将IκBα和CTLA4Ig通过内部核糖体进入部位(internal ribosome entry site, IRES2)连接,并以基因重组的形式插入腺病毒表达载体,以同源重组的形式转染293细胞,构建重组腺病毒.结果①成功构建Padtrack-CMV-CTLA4Ig-IRES2表达质粒; ②与BJ5183重组后转染293,获得重组腺病毒;③PCR鉴定重组腺病毒正确.结论构建了人CTLA4IGg,IκBα双基因共表达腺病毒载体,为进一步研究其在免疫耐受中的作用提供研究基础.     

Effect of N-tosyl-L-phenylalanylchloromethyl Ketone on Tumor Necrosis Factor-alpha -induced NF-κB Activation and Apoptosis in U937 Cell Line

Summary: To investigate the effect of N-tosyl-L-phenylalanylchloromethyl ketone (TPCK) on tumor necrosis factor-alpha-induced NF-κB activation and apoptosis in U937 cell line, changes and subcellular localization of NF-κB/p65 and IκB-α were observed by fluorescencemicroscopy and expression and degradation of IκB-α by flow cytometry. The apoptosis of U937 cells was measured by flow cytometry and electrophoresis of DNA. Immunolfluorescence assay showed that NF-κB/p65,IκB-α only localized in cytoplasm. After TNF-α stimulation, p65 was localized only in nuclei, and IκB-α was only localized in cytoplasm and decreased. The changes of TNF-α stimulation were specifically inhibited by TPCK. Flow cytometry also revealed the downregulation of IκB-α protein during TNF-α-induced apoptosis and the down-regulation was specifically inhibited by TPCK. Flow cytometry also showed the apoptosis of U937 cells after TNF-α induction. DNA ladder can be detected in cells treated by TNF-α. It is concluded that degradation of IκB-α protein and NF-κB/p65 translocation occur during TNF-α-induced apoptosis of U937 cells, suggesting the activation of NF-κB.TPCK-sensitive protease plays an important role in the degradation of IκB-α protein induced by TNF-α in U937 cells. TPCK sensitive protease also plays an important role in the apoptosis of U937 cells induced by TNF-α.     

TSG-6促进瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡及其NF-κB信号通路影响的实验研究

目的 探讨TSG-6预处理对瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡及NF-κB信号通路的影响.方法 标本人瘢痕疙瘩共3例,采用酶消化法分离纯化得到人瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFs),MTT法检测rhTSG-6蛋白对KFs的增殖抑制作用,计算半数抑制浓度(IC50),流式细胞术检测KFs(空白对照组)与接近IC50 rhTSG-6蛋白处理组(rhTSG-6实验组)细胞凋亡情况.Western blot检测各组细胞中IκBα、p-IκBα、活化caspase3及caspase8的表达.凝胶电泳迁移率实验(EMSA)检测各组细胞NF-κB DNA结合活性.结果 rhTSG-6在体外对KFs增殖有明显抑制作用(IC50接近300 ng/ml),细胞凋亡率增高,差异有统计学意义(P＜0.05);Western blot法检测显示rhTSG-6实验组KFs中IκBα表达增加,p-IκBα表达减少,活化caspase3和caspase8表达明显增多.EMSA结果显示rhTSG-6实验组NF-κB DNA结合活性明显降低.结论 TSG-6在体外可能通过抑制NF-κB信号通路活性进而抑制KFs增殖并促进其凋亡.     

Ad5F35-IκBαΔN重组腺病毒对K562/DNR细胞耐药性逆转的研究

目的:研究Ad5F35-IκBαΔN重组腺病毒对K562/DNR细胞耐药性的逆转作用及相关机制。方法:采用流式细胞仪分析细胞凋亡;NF-κB p65活性分析试剂盒检测K562/DNR细胞NF-κB活性。结果:感染Ad5F35-IκBα△N腺病毒后,K562/DNR细胞NF-κB活性受到明显抑制,从0.224±0.021活性单位/μg核蛋白降至0.132±0.015;凋亡率明显增高,从(10.4±1.5)%升至(43.2±4.8)%。结论:感染Ad5F35-IκBα△N腺病毒后,可通过抑制NF-κB的活性,增加K562/DNR细胞凋亡率,从而逆转K562/DNR细胞的耐药性。     

供肝冷保存再灌注期间核因子NF-κB和抑制蛋白IκBs的变化及其意义

目的:研究肝移植期间供肝组织中核因子NF-κB的激活特征及其活性调控机制.方法:改良Kamada法建立大鼠原位肝脏移植模型,按供肝在4℃乳酸林格液中的冷保存时间,实验分冷保存2 h组和6 h组,凝胶迁移率改变分析法(EMSA)和Western印迹法测定移植期间不同时相供肝组织中NF-κB的活性变化及其主要抑制蛋白IκB-α、IκB-β的表达水平.结果:两组供肝组织在冷缺血保存期间其NF-κB活性与正常肝组织相比无明显差异(P>0.05),再灌注后30 min至6 h两组的NF-κB活性均出现显著的诱导激活(P<0.01),其中冷保存2 h组供肝组织的NF-κB活性高峰出现在再灌注1 h;而冷保存6 h组在再灌注30 min即达到活性高峰,并维持在较高的激活水平;供肝组织中抑制蛋白IκB-α的含量显著高于IκB-β,两组的IκB-α蛋白在再灌注30 min至1 h均有明显降解(P<0.05),而IκB-β蛋白仅在冷保存6 h组有较明显的降解(再灌注30 min).结论:核因子NF-κB仅在供肝的再灌注早期呈诱导性激活,其激活特征与供肝的冷保存再灌注损伤有关,抑制蛋白IκB-α在供肝的NF-κB活性调控中可能起了主要作用.     

Adenovirus-mediated overexpression of novel mutated IκBα inhibits nuclear factor κB activation in endothelial cells

Nuclear factor κB （NF-κB） overactivation, requiring phosphorylation and degradation of its inhibitor IκBα, is the basis for chronicity of airway inflammation in asthma. Based on our previous plasmid pShuttle-IκBα, carrying an IκBα gene from human placenta, we optimized a novel IκBα mutant （IκBα） gene, constructed and characterized its replication-deficient recombinant adenovirus （AdIκBαM）, and tested whether AdIκBαM-mediated overexpression of IκBαM could inhibit the NF-κB activation in endothelial cells.     

HCVC蛋白调控肝门部胆管癌细胞中NF-κB活性的研究

目的 探讨丙型肝炎病毒核心蛋白(HCV C)在肝门部胆管癌细胞中对核转录因子κB(NF-κB)的调控作用。方法 利用稳定表达HCV C蛋白的QBC939细胞株(QBC939HCV C ),通过NF-κB报道基因分析法、凝胶迁移率分析(EMSA)检测HCVC蛋白增强肝门部胆管癌细胞NF-κB的DNA结合活性和反式激活活性。RT-PCR、Western blot检测HCV C蛋白对核转录因子-κB抑制蛋白α(IκBα)mRNA及P50、P65、IκBα蛋白表达及IκBα蛋白磷酸化的影响。结果 ①EMSA结果显示QBC939HCV C 细胞系中NF-κB相对信号密度明显比QBC939细胞高。②将pNF-κB-lun表达质粒转染稳定表达HCVC蛋白胆管癌细胞系中,通过单光子检测仪检测荧光素酶活性,结果显示QBC939HCV C 细胞中活化NF-κB为12．8倍,而QBC939细胞中NF-κB为2．6倍。③RT-PCR显示IκB mRNA在QBC939HCV C 细胞和QBC939细胞中的表达无明显差异;Western blot结果显示稳定表达HCVC蛋白的QBC939HCV C 细胞株的胞核中的P50、P65蛋白高水平表达,而未转染HCVC蛋白的QBC939细胞仅检测出极低水平的P50、P65蛋白。在QBC939HCV C 细胞胞浆中IκBα蛋白低水平表达。QBC939细胞高水平表达,但IκBα蛋白磷酸化水平则相反。结论 HCVC蛋白通过增加IκB降解激活的NF-κB在肝门部胆管癌的发生中起重要作用。     

阿魏酸钠对缺氧致脑血管内皮细胞NF-κB、IκBα表达的影响

目的 研究阿魏酸钠对缺氧脑血管内皮细胞核转录因子κB(nuclear factor-κB, NF-κB)及IκBα表达的影响.方法 建立大鼠脑皮质微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cell, BMEC)体外培养模型,并施加12 h缺氧条件,分为对照组、缺氧组、阿魏酸钠组.应用MTT法测定细胞活性,采用放射免疫方法测定内皮素(endothelin-1, ET-1)含量,采用免疫细胞化学法检测BMEC的NF-κB及IκBα表达.结果 阿魏酸钠(100 μg/ml)能抑制缺氧诱导的ET-1释放(P<0.01).缺氧刺激血管内皮细胞NF-κB的表达,降低IκBα的表达,阿魏酸钠可以显著抑制缺氧内皮细胞中NF-κB的表达及核移位现象,增加IκBα的表达和BMEC活性.结论 阿魏酸钠对大鼠脑皮质BMEC缺氧损伤具有保护作用,机制与其减少BMEC分泌ET-1,抑制NF-κB蛋白表达,促进IκBα蛋白表达有关.     

核转录因子κB RNA适体重组腺病毒载体的构建

目的：构建核转录因子κB(NF—κB)RNA适体(aptamer)重组腺病毒载体pAdeasy—aptamer，制备重组腺病毒Ad—aptamer并测定其活性。方格：采用亚磷酸二酯法合成aptamer cDNA的6个寡核苷酸片段并拼接完整，克隆至pGEM—7Z载体中，经酶切鉴定和测序后把aptamer cDNA定向插入穿梭质粒pShuttle—CMV的多克隆位点上，再将重组质粒pShuttle—CMV—aptamer与腺病毒载体pAdeasy在大肠杆菌BJ5183中同源重组产生重组腺病毒载体pAdeasy—aptamer。用脂质体转染pAdeasy—aptamer至HEK293细胞，产生有感染能力的重组腺病毒Ad—aptamer，RT—PCR检测重组腺病毒在感染细胞中的表达，并测定其对体外抑制炎症细胞系释放炎症介质IL-1β和IL—6的影响。结果：感染重组腺病毒的细胞具有aptamer cDNA的表达，重组腺病毒能抑制感染细胞炎症介质的释放，具有预期的生物学活性。结论：产生具有生物学活性的重组腺病毒Ad—aptamer，为下一步基因治疗因NF—κB过度激活引起的急慢性炎症反应奠定基础。     

乳酸调控大鼠肠黏膜微血管内皮细胞的NF-κB信号通路

目的探讨内毒素(LPS)刺激大鼠肠黏膜微血管内皮细胞(RIMMVECs)后,乳酸(LA)调控NF-κB信号通路中磷酸化IκBα和NF-κB p65蛋白表达情况,肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)mRNA表达情况,阐明乳酸发挥作用的最佳时间及其调控NF-κB信号通路的部位。方法提取RIMMVECs总蛋白和总RNA,用Western blotting检测NF-κB p65、IκBα及p-IκBα蛋白表达水平,用real-time PCR对TNF-α和IL-6 mRNA进行定量检测。结果乳酸能降低LPS诱导RIMMVECs分泌的TNF-α和IL-6 mRNA表达水平,并分别于24 h和3 h下调效果最明显;乳酸能抑制IκBα磷酸化及NF-κB转录活性,并于4~8 h达到最佳效果;乳酸发挥作用部位是抑制信号通路中IκBα磷酸化。结论乳酸通过抑制IκBα磷酸化而阻断NF-κB的激活,抑制下游炎性因子表达,进而发挥出很好的预防炎症效果。     

NF-κB及其活化的研究进展

核因子-κB/Rel蛋白(NF-κB)是一种分布和作用均十分广泛的真核细胞转录因子，因首先发现于B细胞Igκ轻链转录调控而得名。NF-κB可双向调控一系列基因的表达，这些基因的表达产物主要是参与调控机体的免疫反应和炎症反应。     

NF-κB/IκB信号通路与皮肤病

核因子-κB (nuclear factor kappa binding,NF-)是广泛存在于细胞中的具有多向调节作用的蛋白质分子,可调节100多种靶基因的表达,其中的大多数均参与了宿主的免疫和炎症反应.NF-κB抑制蛋白 (inhibitor of NF-κB,IκB) 是NF-κB的抑制因子.本文主要就NF-κB/IκB信号通路的概况及其在某些皮肤病发病机制中的作用进行综述.     

利拉鲁肽通过circ-sirt1/NF-κB信号通路抑制血管平滑肌细胞炎症的机制研究

目的 探究利拉鲁肽(liraglutide,LIR)对肿瘤坏死因子α(tumour necrosis factor-α,TNF-α）诱导的血管平滑肌细胞炎症反应的作用及其可能的分子机制。 方法 实验分为空白对照组(NC组)、TNF-α组(10 μg/L)和TNF-α+LIR组(10 μg/L TNF-α+100 nmol/L LIR)。酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测细胞培养基中的白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)和白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)。实时荧光定量核酸扩增检测系统(real-time quantitative polymerase chain reaction detecting system,qPCR)检测circ-sirt1及细胞间黏附分子1(inter-cellular adhesion molecule 1,ICAM-1)、单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)、抑制性卡巴蛋白α(inhibitor kppa B-α,IκB-α）mRNA的表达。Western Blot检测细胞ICAM-1、MCP-1和IκB-α蛋白表达。免疫荧光检测核因子κB（nuclear factor kappa-B,NF-κB）p65蛋白分布。 结果 与NC组相比,TNF-α组细胞培养基中的IL-1β和IL-6含量显著升高,ICAM-1、MCP-1 mRNA及蛋白表达显著升高,IκB-α mRNA及蛋白表达显著减低,circ-sirt1表达显著降低,NF-κB p65蛋白主要定位在细胞核。与TNF-α组相比,TNF-α+LIR组IL-1β和IL-6含量显著减少,ICAM-1、MCP-1蛋白表达显著降低,IκB-α蛋白表达显著增加,circ-sirt1表达显著升高,NF-κB p65蛋白细胞核定位减少。 结论 利拉鲁肽能够抑制血管平滑肌细胞的炎性反应,可能是通过抑制炎症介质释放及circ-sirt1/NF-κB信号通路的激活发挥作用。     

辛伐他汀对脂多糖诱导人THP-1单核细胞MCP-1表达与NF—κB活化的影响及机制

目的 通过研究辛伐他汀对脂多糖(LPS)诱导人THP-1单核细胞单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)表达与NF-κB活化的影响,探讨辛伐他汀调控炎症状态下单核细胞MCP-1表达与NF-κB活化的机制.方法 体外培养人THP-1单核细胞,分为对照组、LPS组、辛伐他汀低、中、高浓度组,辛伐他汀3组加入不同浓度(1、5、10 μmol/L)辛伐他汀预孵2h与LPS组均加入LPS刺激24 h.应用Western blot检测各组细胞质蛋白IκBα、NF-κB p65、MCP-1水平与各组细胞核蛋白NF-κB P65水平,ELISA检测各组细胞培养上清MCP-1水平.结果 辛伐他汀呈浓度依赖性抑制LPS诱导人THP-1单核细胞胞质蛋白与培养上清MCP-1增加;辛伐他汀呈浓度依赖性抑制LPS所致人THP-1单核细胞胞质蛋白IκBα与NF-κB P65降低及核蛋白NF-κB P65增加.结论 辛伐他汀抑制LPS诱导人THP-1单核细胞MCP-1表达可能与其抑制NF-κB活化有关;而抑制NF-κB活化可能与其抑制IκBα降解有关.     

亚硒酸钠对哮喘大鼠肺组织核因子-κB和抑制蛋白α表达的影响

目的:观察哮喘大鼠肺组织中核因子-κB(NF-κB)和抑制蛋白α(IκBα)的表达及炎性细胞的浸润,探讨用亚硒酸钠干预后对其的影响及其作用机制。方法:18只健康雄性SPF级W istar大鼠随机分为哮喘组(A组),亚硒酸钠干预组(Se组)和正常对照组(C组),每组6只。A组和Se组用卵清蛋白(OVA)致敏激发复制哮喘模型,Se组每次激发前用亚硒酸钠干预,C组用生理盐水作为对照。免疫组化方法观察NF-κB、IκBα在哮喘大鼠肺组织的表达。结果:哮喘组支气管肺组织NF-κB的蛋白表达(31.96±6.22)%显著高于对照组(5.08±1.92)%,IκBα蛋白的表达(1.64±0.58)%低于对照组(14.01±3.99)%,有统计学差异(P<0.01)。干预组NF-κB(18.09±4.13)%的蛋白表达与哮喘组相比显著降低(P<0.01),IκBα(5.04±0.45)%则增高(P<0.05)。哮喘大鼠肺组织NF-κB与IκBα蛋白表达呈负相关(r=-0.819,P<0.01)。结论:亚硒酸钠能够抑制哮喘大鼠肺组织IκBα的降解和NF-κB的激活,进而抑制气道炎症。