破骨细胞转基因永生化问题的初步探讨

目的：通过转基因技术建立破骨细胞永生化细胞系，方法：经1，25（OH）2D3诱导，获得小鼠骨髓来源的破骨前体细胞，脂质体法（Fugene6）将猿猴病毒40（SV40）和绿色荧光蛋白（GFP）质粒分别转染入破抽前体细胞，G418筛选抗性克隆；同时将GFP转染入逆转录病毒包装细胞（P167）中，作为方法对照，继而，用含有GFP的逆转录病毒感染破骨前体细胞，G418筛选抗性克隆。结果：获得小鼠骨髓来源的破骨前体细胞，Fugene6转染SV40和GFP到破骨前体细胞后，G418筛选未获得阳性克隆，但GFP转染PT67细胞获得阳性克隆和含有GFP的逆转录病毒。将含有GFP的逆转录病毒感染破骨前体细胞，G418筛选未获得阳性克隆，结论：通过破骨细胞转基因永生化，建立破骨或破骨前体系细胞系的方法是一个非常有意义的研究课题，但是难度较大。可以初步认为：脂质体和逆转录病毒载体的方法不是破骨细胞转基因的最佳方法。     

腺相关病毒介导的大鼠移植肝基因转移

目的　研究腺相关病毒载体介导的移植肝基因转移的可行性和转导率。方法　以绿色荧光蛋白 (GFP)作为报告基因 ,在大鼠供肝冷保存前经门静脉注入不同剂量 (1× 10 10 pfu/ml、5× 10 10pfu/ml和 1× 10 11pfu/ml)的带有绿色荧光蛋白的腺相关病毒载体 (AAV GFP) ,保存后行异体肝移植 ,术后 2、4及 8周取供肝组织活检 ,运用免疫荧光显微镜和流式细胞仪检测GFP的表达 ,计算转导率 ,观察不同剂量的AAV GFP及不同保存时间 (1h、4h和 10h)对转导率的影响。结果　 3个剂量组肝移植术后第 4周移植肝细胞内均可观察到GFP的表达 ,随着AAV GFP剂量的增加 ,转导率也增加 (6 %、15 %和 34 % ) ;随着冷保存时间的延长 ,转导率逐步提高 (15 %、32 %和 5 4% ) ;除移植肝细胞外 ,脑、心、肺、肾、脾脏内均未见GFP的表达 ;与对照组比较 ,移植肝功能的差异无显著性。结论　在模拟临床肝移植条件下 ,利用腺相关病毒可将目的基因转移入移植肝细胞内 ,且能高效表达 ;转导率随病毒剂量的增加、冷保存时间的延长而提高 ;经冷保存途径腺相关病毒的转染具有嗜肝性 ;移植肝功能不受基因转导的影响     

转基因肝星状细胞株的建立及生物学特性

目的　建立稳定表达肝细胞生长因子 (HGF)的肝星状细胞株CFSC/HGF。方法　构建携带hgf基因全长序列的重组逆转录病毒pMSCV HGF ,反复感染肝星状细胞系CFSC建立转基因肝星状细胞株。对建立的CFSC/HGF用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR )和酶联免疫吸附试验 (ELISA)分别从基因和蛋白水平进行鉴定 ,并通过免疫细胞化学检测、细胞增殖活性测定 ,以及对人肝癌细胞HepG2的扩散试验等对其生物学特性进行初步研究。结果　构建了重组逆转录病毒质粒 pMSCV HGF及包装细胞株PT/HGF ,建立并筛选出HGF表达水平分别为0 .15、2 .2 3、5 .48、9.76μg/L的 4个细胞株CFSC/HGF ,细胞表达结蛋白和α 平滑肌肌动蛋白 ;随HGF表达水平不同 ,CFSC/HGF细胞增殖活性显示出明显的差别 ;CFSC/HGF培养上清可使HepG2细胞扩散 ,生长受抑。结论　建立了稳定表达hHGF的肝星状细胞株CFSC/HGF ,并对其生物学行为进行了初步鉴定。     

转基因技术在肝脏移植中的应用

196 3年 ,美国Starzl施行人类第 1例肝移植以来 ,肝移植技术日趋成熟 ,已成为治疗终末期肝病的有效手段。但肝移植的排斥反应、供肝保护、供肝短缺等问题仍未完全解决。近 10年来 ,人们将转基因技术引入器官移植领域 ,尤其是肝脏移植中。期待通过转基因技术改造同种或异种肝移植物 ,以解决上述问题。一、肝移植中转基因载体、转染方法及途径动物或人类的某些病毒已被证明是转基因的良好载体。腺病毒载体 ,宿主范围广 ,能感染分裂 ,包装容量大 (8～ 37kb) ,病毒滴度高 ,易于生产、纯化、致病力弱。目前 ,在肝移植中 ,腺病毒载体研究得较多 ,…     

猪肝细胞用于生物人工肝的安全性问题

人工肝为肝衰患者过渡到肝移植的桥梁,而生物人工肝更符合生理需要.目前进入临床实验的生物人工肝多以猪肝细胞为材料,本文对猪肝细胞源性生物人工肝脏辅助系统的概念,猪肝细胞应用的潜在危险,猪内源性逆转录病毒的相关问题,以及防止猪病原体传播的方式等进行了综述.     

转基因与移植耐受研究进展

近年来，通过诱导免疫耐受延长移植物存活的研究，已取得了可喜的进步。特别是分子生物学、分子免疫学和基因转移技术的不断进步，对移植耐受的诱导也产生了重要的影响。本文就转基因与移植耐受的相关研究进展作一综述。     

活体肝部分移植最新进展

自１９８８年１２月首次开展临床活体肝部分移植以来，这一技术得到不断推广，已日趋成熟，全球已有３０余个国家和地区成功开展了这一手术［１－３］，推测总例数已突破１０００例，同时还取得了令人瞩目的疗效。我国大陆、香港及台湾相继成功开展了这一手术，作者就近二年来这一领域的最新进展作一综述。一、适应证的变化在１９９６年以前，活体肝部分移植术主要适用于儿童胆汁淤积性疾病患者。日本肝移植研究会统计了１９９６年前全日本开展的３６４例活体肝移植病例，其中小于１０岁者达３４５例，且８０％属先天性胆道闭锁症［４］。日…     

临床活体肝部分移植的发展及现状(文献综述)

自1988年12月首次开展临床活体肝部分移植以来,全世界累计总例数已近500例,仅京都大学已达170例.从适应证上看,绝大多数为先天性胆道闭锁症,供肝多来自患儿的父亲或母亲,日本信州大学成功地开展了来自非血缘关系成人间活体肝部分移植术.     

转基因与移植耐受研究进展

近年来 ,通过诱导免疫耐受延长移植物存活的研究 ,已取得了可喜的进步。特别是分子生物学、分子免疫学和基因转移技术的不断进步 ,对移植耐受的诱导也产生了重要的影响。本文就转基因与移植耐受的相关研究进展作一综述     

肝小肠联合移植

一、概况第一例肝小肠联合移植，是１９９０年加拿大Ｇｒａｎｔ等［１］报道的，受者为４１岁女性，因肠系膜动脉栓塞作全小肠及右半结肠切除，次年作了移植。术后分别用环孢素Ａ及ＯＫＴ３作免疫治疗，术后８周开始完全经口饮食维持正常体重达２年之久。此后肝小肠联合移...     

自体肝段异位移植的实验研究

１２例狗肝段自体异位移植的实验中９例手术成功．说明该方法在技术上是可行的。左外叶切除不会危及狗的生命．修整后的左外叶下段可用作供肝段。提示在不危及供体生命的前提下切取部分肝脏作为供肝．从而扩大辅助性肝移植供肝来源。此外，对供肝段的选择、手术方法及植入肝段的萎缩等进行了初步的探讨。     

腺病毒－BMP7载体的包装与纯化

腺病毒(Adeno)基因组为线状双链DNA,长度大约36kb,适合于容纳较大片段外源基因。与逆转录病毒载体相比,腺病毒载体能有效地将外源基因转染到各种靶细胞中。其宿主范围广,感染性强,尤其能感染分化后的非分裂期细胞。在Adeno生活周期中,其基因不整合到宿主细胞DNA中,故无插入突变激活癌基因的危险,外源基因能游离地表达。商品化的腺病毒载体一般剔除了其基因组的E1区,经体外重组后,产生可复制缺陷型腺病毒。再经过293细胞的包装过程,得到具有感染能力的腺病毒用以转染靶细胞。2002年,我室构建了腺病毒-BMP7(简称AV-BMP7)表达载体,用于组织工程化骨的修复实验,取得实效。现将该病毒包装、纯化技术分述如下。     

肝段移植的外科解剖学（编译）

由于劈离式和活体肝移植的发展，需要对肝脏解剖有更深入和广泛的认识。本文综合了1994～2001年180余例成人和儿童劈离式和活体肝移植的临床经验，认为熟悉肝脏外科解剖是手术成功的基础。     

转基因细胞移植治疗慢性疼痛研究进展

转基因细胞移植作为一项新的生物干预手段，已被广泛应用于治疗多种疾病的研究。在疼痛治疗中，目前基因治疗主要有两个方向：上调抗痛基因表达和下调疼痛基因表达。转基因细胞移植主要是将抗痛基因转入基因工程细胞来上调抗痛基因表达。首先由Wu等提出，他将前垂体细胞AtT-20细胞(分泌β-内啡肽)转染人前脑啡肽基因后进行移植，发现能够发挥镇痛效应。     

B7-1转基因细胞株的表达和检测

目的:构建B-7.1基因真核表达载体并导入CAK-1肾细胞癌细胞表达,为进一步研究基因的功能做材料准备.方法:采用RT-PCR方法,以正常肝脏组织cDNA为模板,扩增B-7.1基因全长读码框架,并构建到真核表达载体pCDNA3.1中,将其导入CAK-1肾细胞瘤细胞,对转染后的细胞进行RT-PCR和Westernblot分析.结果:经过克隆测序结果证实,我们成功将B-7.1读码框架插入真核表达载体pCDNA3.1的相应位点,并且,与pCDNA3空载体转染对照细胞相比,pCDNA3-B-7载体转染的CAK-1细胞中B-7基因无论是mRNA水平还是蛋白水平均有明显升高.结论:B-7.1转基因细胞株的成功构建和检测,为深入研究B-7.1蛋白的生物学功能奠定了材料基础.     

转基因在异种移植中的应用

由于供临床移植的器官严重缺乏,而且使用人体器官供移植也还存在各种伦理、法律问题,所以很久以来人们就试图使用动物的器官来替代丧失功能的人体器官。但一直无法克服跨物种间遇到的主要障碍即异种排斥反应,特别是超急性排斥反应,以及迟发性异种移植排斥反应,因此以往的一切尝试均未能成功。进入９０年代以来,由于对异种移植超急性排斥反应的发生机理有了更深入的研究,此外,分子生物学、基因工程等相关学科也得到飞速地发展,有可能通过各种基因工程的手段对供体动物的某些基因进行修饰,使动物有可能作为人体异种移植的供体。现在…     

猪肝细胞用于生物人工肝的安全性问题

人工肝为肝衰患者过渡到肝移植的桥梁,而生物人工肝更符合生理需要.目前进入临床实验的生物人工肝多以猪肝细胞为材料,本文对猪肝细胞源性生物人工肝脏辅助系统的概念,猪肝细胞应用的潜在危险,猪内源性逆转录病毒的相关问题,以及防止猪病原体传播的方式等进行了综述.     

深低温保存后同种带瓣大动脉的转基因研究

目的：观察外源性基因在深低温保存不同时间后的同种带瓣大动脉中的表达。方法：新西兰成年白兔15只作受体，幼兔15只作供体，各随机分为5组，从每只供体处可得到带瓣主动脉，带瓣肺动脉各1条，即每组可得到6条瓣大动脉，Ⅰ-Ⅴ组中的6条动脉分别在液氮深低温条件下保存7，14，30，90，180d，每组保存期满后，快速复温，各组中5条同种带瓣大动脉浸入300ul含重组腺病毒（Ad5CMVLacZ)的DMEM液中；1条浸入300μl不含重组腺病毒的DMEM中作对照组，均在室温下放置30min后分别移植于受体的,两侧颈动脉。各组均在移植术后5d取出移植物，进行组化染色。结果：所有转染重组腺病毒的同种带瓣大动脉均有不同程度的基因表达，对照组均为阴性，组间转基因细胞表达量差异无统计学意义（P＞0．05）。结论：对深低温保存不同时间后的同种带瓣大动脉进行转基因治疗是可行的。     

成人间活体肝部分移植

８０年代末开展的活体肝部分移植,部分解决了小儿供肝短缺的矛盾,该技术的开展克服了供、受体肝脏大小不相配的难题,使得体重大于受者１０倍的供肝移植变为可能,使一个体重仅有１０公斤的患儿便可以利用一个体重达１００公斤的供者的肝左外叶,而且手术效果与全肝移植...     

活体肝部分移植的进展

活体肝部分移植的进展管文贤李开宗３２年前，Ｓｔａｒｚｌ成功地开展临床首例肝移植以来，目前肝移植术已成为晚期肝病患者有效的治疗手段。近年在北美、欧州上百个移植中心，以每年约５０００例的业绩，使肝移植术得到不断发展和完善，现总例数已突破３００００例〔１～...