表皮生长因子促进胚胎神经干细胞生长分化的研究

目的:观察表皮生长因子EGF对胚胎神经干细胞生长分化的影响。方法:从孕11d大鼠胚胎神经管分离神经干细胞,分为EGF组和对照组,进行体外培养。观察神经干细胞的生长,显微测量细胞突起长度,在第3、7天用免疫组化方法检测细胞神经元特异烯醇化酶(NSE)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,并观察神经干细胞分化为神经元及神经胶质细胞的状况。结果:加入EGF后,细胞生长旺盛,细胞突起长度明显高于对照组;免疫组化染色结果显示,培养3、7d时,NSE、GFAP阳性细胞数均明显多于对照组。结论:EGF既能促进胚胎神经干细胞的生长,也可促其分化为神经元及神经胶质细胞。     

培养胚胎神经干细胞向少突胶质细胞诱导分化的实验研究

目的培养大鼠胚胎神经干细胞,诱导分化获得较高纯度的少突胶质细胞。方法取孕11.5 d的胚胎大鼠神经管尾段制备单细胞悬液,无血清条件培养基培养,获得神经干细胞;加入胎牛血清诱导分化,利用神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞不同的生长特性进行分离,获取较高纯度的少突胶质细胞。结果本实验得到纯度达90%以上的少突胶质细胞。结论利用培养大鼠胚胎神经干细胞诱导分化可以获取较多较高纯度的少突胶质细胞,以进行进一步研究。     

3～18周胎龄人胚胎神经干细胞的分离、培养及增殖

目的:在分离、纯化、培养3～18周胎龄人胚胎神经干细胞(NSC)的基础上,进一步研究3～18周胎龄NSC的增殖特点.方法:从3～18周龄流产人胚胎的大脑皮质和神经管组织中分离NSC,实验分组:A组(3～6周龄),B组(7～11周龄),C组(12～18周);培养、纯化NSC;以单细胞克隆实验及免疫细胞化学对其进行生物学特性鉴定;计数神经球数目、直径检测其生长情况.结果:从3～6周流产人胚胎大脑皮层和神经管组织中以及7～18周的人胚胎大脑皮层中均分离获得了可在体外生存增殖的NSC,经鉴定,该类细胞在生长方式、形态结构、功能特征、表面标志等方面,均具有典型NSC的生物学特征;A组人胚胎NSC的神经球数目和直径均大于B、C组(P＜0.05).结论:3～18周胎龄组NSC的增殖能力均随胎龄的增加而逐步减弱.     

躯干神经嵴干细胞体外分离培养及其增殖、分化的实验研究

目的体外分离培养鉴定躯干神经嵴干细胞,探讨其生物学特性,为研究周围神经再生修复提供新的细胞来源。方法取大鼠胚胎躯干部神经管,组织块法培养获取躯干神经嵴干细胞,通过形态学及免疫细胞化学观察其细胞生长、增殖、分化等特性。结果原代培养的躯干神经嵴干细胞呈梭形,其特异性标记物nestin和p75表达阳性,并有较高的增殖活性。传代培养后,在含血清培养基中,其分化细胞呈GFAP、MAP 2、α SMA阳性。结论成功地培养了躯干神经嵴干细胞,细胞表现出多潜能干细胞特性,为研究周围神经组织工程种子细胞来源提供实验依据。     

组织块法体外培养人胚胎神经干细胞

目的：探讨体外分离、培养人胚胎脑组织神经干细胞的实用方法。方法：从人胚胎脑额叶皮层分离组织块，采用DMEM／F12＋N2无血清培养基，进行体外培养、传代。采用免疫细胞化学法鉴定神经干细胞和分化后的其他细胞表型。结果：从人胚胎脑额叶皮层分离的细胞具有增殖和多向分化潜能，可进行传代培养，获得的细胞中大部分为Nestin表达阳性的细胞。诱导分化后可以出现NSE、GFAP表达阳性的细胞。结论：用上述方法分离培养的细胞具有神经干细胞的特性，并表达Nestin蛋白，认为是神经干细胞。此方法是一种具有实用价值的体外培养人胚胎脑神经干细胞的技术。     

胚胎神经上皮干细胞体外克隆增殖与分化的实验研究

目的观察胚胎神经上皮干细胞在体外克隆增殖和诱导分化的情况。方法取孕11 d大鼠的胚胎,经分离获得神经管上皮细胞,在无血清培养基内克隆、增殖、传代。取不同时期的神经球进行神经干细胞的鉴定和诱导分化,并通过免疫组织化学染色鉴定分化的结果。结果胚胎神经上皮干细胞在体外能够克隆、增殖,形成的神经球呈nestin阳性,在分化培养基内可分化为星型胶质细胞和神经元。结论胚胎神经上皮干细胞可在体外进行单细胞克隆和诱导分化。     

大鼠视网膜共培养诱导神经干细胞分化为视网膜神经节细胞

目的:研究新生大鼠视网膜组织与胚胎上丘源神经干细胞共培养对干细胞分化的影响.方法:采用机械分离、无血清培养基选择培养的方法从孕14 d的胚鼠上丘中获取神经干细胞并传代培养.使用组织-细胞共培养系统将出生4 d的乳鼠视网膜组织与上丘源神经干细胞共培养,观察干细胞分化过程,对分化细胞进行鉴定,并与干细胞的自然分化过程进行比较.结果:从胚鼠上丘中获得的细胞在无血清培养条件下聚集呈球形悬浮生长,可以持续传代培养,具有多向分化能力,经免疫荧光鉴定证实为神经干细胞.新生大鼠视网膜组织与胚胎上丘源神经干细胞共培养促进干细胞的分化,并诱导分化出Thy1.1阳性细胞.结论:从胚胎大鼠上丘可以分离培养神经干细胞,与新生鼠视网膜组织共培养可以诱导上丘源神经干细胞分化出视网膜神经节细胞.     

神经干细胞的培养观察及鉴定

目的：建立一个稳定的神经干细胞系．方法：从孕12～16d小鼠胚胎脑内分离纹状体，吹打消化为单细胞悬液，于DMEM／F12(1：1)培养基(含有bFGF，EGF和N2添加剂)中培养．通过MTT法检测细胞活性，并绘制生长曲线．采用免疫荧光法观察神经干细胞nestin的表达情况和其分化的子代细胞NSE及GFAP等的表达情况．结果：原代分离培养4～6d后，培养基内可见神经克隆球，分散克隆球所获的单细胞继续培养可以重新生成克隆球．新生克降球细胞呈nestin阳性，传代入含血清的培养基后可以分化为NSE和GFAP阳性细胞．结论：所获新生克隆球细胞是神经干细胞．     

羊膜上皮细胞促进共培养神经干细胞存活及分化

目的：探讨羊膜上皮细胞是否能在体外促进胚胎脑神经干细胞的存活及分化。 方法：Neurosphere法分离、克隆E12~14 d Wistar大鼠脑组织的神经干细胞,同时从羊膜中分离羊膜上皮细胞。将神经干细胞与羊膜上皮细胞在不同条件下共培养,通过免疫组织化学法对羊膜上皮细胞及神经干细胞的分化进行检测。 结果：羊膜上皮细胞表达神经干细胞及神经元、神经胶质细胞表面抗原;与羊膜上皮细胞共培养的神经干细胞克隆的分化细胞总数、分化为神经元的百分率及神经元初级突起长度明显高于对照组。 结论：羊膜上皮细胞与神经干细胞具有一定的同源性;羊膜上皮细胞能促进体外培养的神经干细胞的分化,且主要向神经元分化,并促进神经元初级突起的生长。提示羊膜上皮细胞为神经干细胞提供促进其分化及存活适宜的微环境。     

胚胎大鼠神经干细胞的培养及鉴定

目的：探讨胚胎大鼠神经干细胞培养，传及鉴定方法。方法：从胚胎大鼠脑室下区（SVZ）组织分离得到神经干细胞，采用无血清培养技术进行培养，并诱导分化，采用SABC法对分化后后的细胞进行神经元特异性烯醇化酶（NSE）、胶质纤维酸蛋白（GFAP）检测及姬姆萨染色进行细胞鉴定。结果：成功培养出了胚胎大鼠神经干细胞，培养出的细胞具有自我更新能力的增殖能力，可分化为神经元，神经胶质细胞及少突胶质细胞，结论：胚胎大鼠神经干细胞在体外适宜的培养条件下具有自我更新，增殖和多向分化潜能。     

人类神经干细胞的长期培养和传代

【目的】探讨人类神经干细胞的体外培养条件及其传代的方法。【方法】采用机械方法从胎脑中分离神经细胞 ,应用N2培养基进行培养 ,碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)和表皮生长因子 (EGF)刺激细胞扩增 ;传统方法和对神经球切割的方法进行传代培养 ;应用免疫组织化学染色对培养的细胞及其分化的细胞进行鉴定。【结果】从流产胎脑当中成功培养出人类的神经干细胞 ,培养条件下呈悬浮状态生长 ,形成神经球 ,绝大多数的细胞表达波形蛋白和Musashi1两种神经干细胞的标志物 ;这种细胞可分化为神经元和星型胶质细胞 ,早期的培养有少量的少突胶质细胞 ;在这种培养条件下 ,神经干细胞生长速度较慢 ,而采用切割神经球的方法保持了细胞间的联系 ,神经干细胞可获得较大的扩增速度。【结论】体外的培养条件下 ,可从胎脑组织中培养出神经干细胞 ,它可做为中枢神经系统疾病移植治疗的潜在细胞来源。     

大鼠脊髓来源神经干细胞NgR的表达

目的：检测大鼠脊髓来源神经干细胞Nogo-66受体（NgR）是否表达。方法：悬浮培养法培养大鼠脊髓来源的神经干细胞，形成神经球后，以免疫荧光法鉴定神经干细胞并检测NgR的表达情况。结果：神经球及单个神经干细胞均显著表达NgR。结论：NgR在脊髓神经发育的干细胞阶段即开始表达。     

人胚胎干细胞神经分化的方法探讨

【目的】 利用新建系的人胚胎干细胞株SYSU-7,运用胚体形成的方法,探讨不同的分化条件对胚胎干细胞神经分化的影响。【方法】 首先检测人胚胎干细胞株SYSU-7的Oct4、SSEA4(stage-specific embryonic antigen-4)、TRA-1-60和AKP(Alkaline phosphatase)等胚胎干细胞特异性标志物的表达及体内外三胚层分化的能力;之后,应用含20% Knockout Serum Replacement (KSR)的培养液和神经干细胞培养液(neural progenitor medium, NPM)分别诱导细胞形成悬浮的拟胚体(悬浮时间为4 d或7 d),然后将拟胚体贴壁于多聚鸟氨酸(Polyornithine, PO)和纤维粘连蛋白(Fibronectin, FN)包被的培养皿中继续培养4 ~ 10 d。在分化的不同时间点利用免疫荧光染色的方法检测胚胎干细胞和神经细胞相关的标志性抗原。【结果】 SYSU-7胚胎干细胞表达未分化细胞特异性标志Oct4、SSEA4,TRA-1-60,AKP染色呈强阳性,在体内外具有向三胚层分化的潜能;在体外诱导其向神经分化,结果发现KSR培养液比神经干细胞培养液更有利于胚胎干细胞的神经分化,悬浮生长7 d的拟胚体贴壁后出现特征性的玫瑰花环样结构(rosette structure)的时间更早。数量更多。【结论】 SYSU-7细胞系具有自我更新及多向分化潜能等胚胎干细胞特性。本实验为研究人胚胎干细胞的神经分化提供了新的细胞模型和研究思路。     

成鼠神经干细胞的分离、克隆和增殖

目的：从成年大鼠前脑室下带（SVZ)中分离神经干细胞,证实其增殖潜能和胚胎源性。方法：利用无血清培养和单细胞克降技术,在成年大鼠SVZ中分离出具有多潜能的神经干细胞。在单个细胞克实验中,将培养板分为两组：第1组采用纯新鲜培养液,第2组为新鲜与原代培养液各半的混合液。选取单个细胞克隆连续传代获得大量来源于同一细胞 的亚细胞系克隆。用5－溴－2－脱氧尿苷（BrdU）标记和免疫荧光检测证实其增殖潜能,并用免疫荧光技术检测神经上皮干细胞蛋白（Nestin)抗原的表达以证实其胚胎源性。结果：原代培养1周后每瓶细胞培养液中可见形成这些克隆细胞可连续传代。BrdU标记、免疫荧光检测及Nestin免疫荧光标记均获得阳性结果。结论：采用新鲜和原代培养各半混合的方法可提高神经干细胞单克隆形成率,且本实验中分离培养的神经干细胞具有增殖潜能和胚胎源性。我们的研究结果为下一步神经干细胞的分化研究奠定了基础。     

人胚脑神经干细胞的分离、培养和鉴定

目的：探讨人胚脑神经干细胞的体外生长特性、分化情况和培养条件，为相关实验研究提供条件。方法：利用神经干细胞的条件培养基，对从9周和12周胚龄的自然流产胎儿分离的前脑、后脑进行神经干细胞培养，并比较其生长特性。以免疫荧光细胞化学技术检测神经上皮干细胞蛋白(Nestin)和分化后神经细胞抗原的表达。结果：两胚龄前、后脑组织中均分离出神经干细胞，他们均表达Nestin抗原阳性。血清诱导分化后，表达神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原。9周胚龄的脑组织原代培养形成细胞克隆的比例高于12周胚龄的脑组织。在条件培养基存在的情况下，后脑组织分离的神经干细胞比前脑组织来源的更容易分化。结论：从人胚脑组织中的前、后脑中分离出神经干细胞，较小胚龄的脑组织原代培养时细胞克隆的形成比例较高，后脑组织分离的神经干细胞比前脑组织来源的更容易分化。     

壳聚糖与神经干细胞生物相容性的研究

目的 探讨生物降解材料壳聚糖与神经干细胞的生物相容性。方法 取SD大鼠胚胎（孕14-16d)大脑皮层组织制成单细胞悬液在无血清培养液中进行培养，获得大量的神经干细胞，再将所获神经干细胞在不同条件下移植接种至壳聚糖膜上联合培养1周，在倒置显微镜下观察神经干细胞生长增殖情况及形态变化，并对其分别进行免疫组化染色，电镜观察，了解壳聚糖对神经干细胞生长，增殖，分化的影响。结果 在无血清联合培养条件下，神经干细胞仍然维持其原有的干细胞特性；在含血清的培养液中，神经干细胞能分化成多种形态的神经细胞，并且在壳聚糖膜上生长良好。结论 壳聚糖与神经干细胞具有良好的生物相容性。     

大鼠胚胎大脑皮层源性神经干细胞体外培养及增殖分化特点

目的 建立大鼠胚脑皮层神经干细胞体外培养及鉴定技术,探讨其增殖分化特性,为应用神经干细胞移植治疗神经疾病提供基础。方法 采用含有丝分裂源表皮生长因子(EGF)的无血清培养基培养SD大鼠孕14．5d的胚胎大脑皮层神经干细胞,应用免疫细胞化学方法了解其增殖分化特性;以单细胞克隆实验及BrdU免疫标记证实神经干细胞自我增殖能力。结果 培养细胞在EGF作用下可分裂增殖,并表达神经干细胞特异性抗原nestin,分化细胞MAP2及GFAP抗原表达阳性。结论 SD大鼠胚脑皮层可分离培养出神经干细胞;并具有增殖、自我更新能力和多向分化潜能特性。     

新生大鼠小脑颗粒神经元原代培养与鉴定

目的:建立一种较为理想的小脑颗粒神经元原代培养方法。方法:取新生5~7天SD大鼠,分离小脑皮质,胰酶消化后差速贴壁,种植在预先涂有左旋多聚赖氨酸的培养板内,第3天加入阿糖胞苷纯化神经元;采用神经元特异性烯醇化酶免疫细胞荧光技术鉴定神经元。结果:细胞存活率达(98±1.07)%;24 h内基本贴壁;第3天细胞突起增多、变长;培养6~8天,细胞突起交织成网,形成典型的神经细胞网络;神经元特异性烯醇化酶鉴定神经元细胞占90%左右。结论:实验获取神经元纯度较高,是小脑颗粒神经元体外培养的一种较理想的方法。     

体外诱导成体大鼠骨骼肌组织来源的干细胞向神经干细胞的转化

目的研究成体Sprague-Dawley(SD)大鼠骨骼肌来源的干细胞(MDSCs)体外诱导向神经干细胞(NSCs)分化的可行性。方法通过酶消化和连续贴壁的方法体外分离成年SD大鼠腓肠肌中的MDSCs。当传代至4-6代时,加入神经干细胞的特殊培养基Neurobasal-A和细胞因子进行诱导分化。用免疫细胞化学、Western blot以及realtime-PCR方法进行鉴定。结果MDSCs在神经干细胞特殊培养基中培养7~10 d后可形成类似神经球的细胞聚集物。运用免疫细胞化学、Western blot以及realtime-PCR检测发现MDSCs的标记蛋白结蛋白(desmin)表达下调,NSCs的特异性抗原神经巢蛋白(Nestin)开始表达。结论在神经干细胞的特殊培养基培养7~10 d后,MDSCs能够向神经干细胞转化。这种现象提示MDSCs有可能作为治疗神经系统疾病尤其是神经退行性疾病的一种新的干细胞来源。