强力霉素抑制角膜移植后的新生血管

背景:角膜移植后40%～60%的患者发生了角膜新生血管,移植后的角膜新生血管加速了角膜免疫排斥反应的发生.抑制角膜移植后的角膜新生血管有利于延长植片的存活时间,提高角膜移植手术的成功率.目的:探讨强力霉素对角膜移植后角膜新生血管的抑制作用.设计、时间及单位:随机对照,动物实验观察,于2007 03/08在中山大学中山眼科中心(眼科学国家重点实验室,2006DA1050541)完成.材料:健康清洁级SD大鼠48只作为角膜移植受体,Wistar大鼠24只作为供体,受体眼为右眼,供体眼为双眼.CD31-PE荧光抗体由美国Sigma公司提供,VEGF ELISA试剂盒由美国RapidBio公司提供.方法:建立大鼠同种异体角膜移植模型,48只受体鼠随机分为2组:盐水对照组和强力霉素用约组,24只/组.术前20min以1%阿托品滴眼液散瞳,植片直径为2.75 mm,植床直径为2.5 mm.术后盐水对照组右眼结膜囊内滴用生理眼水,3次/d;强力霉素用药组右眼结膜囊内滴用1%强力霉素眼药水,3次/d:直至术后30d.主要观察指标:全角膜免疫荧光法检测角膜移植后角膜新生血管的发展,ELISA动态检测角膜组织中VEGF蛋白的表达.结果:①强力霉素用药组植片存活(20.67±3.01)d,比盐水对照组(9.67±9.73)d明显延长(P＜0.01).②角膜移植后3,7,14d盐水对照组新生血管面积相对百分比分别为(4.00±1.00)%,(14.33±4.04)%,(31.33±3.51)%;强力霉素用药组新生血管面积相对百分比分别为(1.67±1.15)%,(4.67±1.53)%,(18.33±1.53)%.其中7,14d时两组比较差异显著(P＜0.05).③角膜移植后强力霉素用药组血管内皮生长因子蛋白水平均低于盐水对照组(P＜0.01),.角膜移植后3,7,14d,盐水对照组血管内皮生长因子蛋白水平为(541.00±75.44),(960.00±90.14),(976.00±130.41)ng/g:强力霉索用药组为(115.33±9.29),(239.00±41.62),(361.00±65.20)ng/g,各时间段比较差异显著(P＜0.05).结论:强力霉素能抑制角膜移植后角膜新生血管的生长,延长植片的生存时间.     

雷帕霉素滴眼剂抑制大鼠角膜血管新生:血管内皮生长因子及炎症因子的作用

背景:雷帕霉素全身用药可明确抑制角膜移植后植片新生血管的生长,但雷帕霉素滴眼剂能否起到相同或者类似的作用尚有待验证.目的:观察雷帕霉索滴眼剂抑制大鼠角膜新生血管生长过程中血管内皮生长因子及炎症因子的作用.方法:角膜缝线法建立SD大鼠左眼角膜新生血管模型,以抽签法随机分为生理盐水对照组与雷帕霉素滴眼剂组.各组均术后第1天开始用药,4次/d,1滴,次.每日行裂隙灯显微镜检查,术后第3,7,14天测量角膜新生血管的长度,计算新生血管面积.14 d后切取角膜行组织学检查,并采用免疫组织化学染色法检测血管内皮生长因子以及白细胞介素2受体α的表达.结果与结论:生理盐水对照组不同时间点角膜新生血管面积均高于雷帕霉素滴眼剂组(P=0),说明雷帕霉索滴眼剂可抑制缝线后角膜新生血管的生长.与生理盐水对照组比较,雷帕霉素滴眼剂组角膜上皮层、浅基质层、新生血管内皮、角膜缝线处上皮以及浸润的炎性细胞内血管内皮生长因子及白细胞介素2受体α表达明显降低,病理切片上炎性细胞浸润减少.结果提示雷帕霉素滴眼剂抑制角膜新生血管生长,可能通过降低血管内皮生长因子的表达及抑制炎性细胞的分化浸润从而抑制新生血管的生长.     

羟基喜树碱抑制大鼠角膜移植免疫排斥反应:与环孢素A的比较

背景:近期研究表明羟基喜树碱在一些器官移植过程中具有免疫抑制作用,但在角膜移植中的免疫抑制作用却未见报道.目的:观察羟基喜树碱对大鼠穿透性角膜移植术后免疫排斥反应的影响,并与经典抗排斥药环孢素A进行比较.方法:18只成年雌性Wistar大鼠为供体,36只成年雄性SD大鼠为受体,建立大鼠穿透性角膜移植动物模型.受体大鼠随机分为3组,羟基喜树碱组、环孢素A组和对照组,每组12只.羟基喜树碱组和环孢素A组分别在术后腹腔注射羟基喜树碱2.0 mg/(kg·d)和环孢素A 10 mg/(kg·d),连续用药12 d.对角膜植片进行临床观察,以混浊、水肿和新生血管3项指标作为临床评估标准,记录角膜植片存活时间.结果与结论:羟基喜树碱组、环孢素A组和对照组角膜植片的存活时间分别为(21±2),(19±2)和(11±2)d,各用药组与对照组比较角膜植片存活时间显著延长(P<0.01),羟基喜树碱组比环孢素A组植片存活时间明显延长(P<0.05).实验结果提示羟基喜树碱能对大鼠穿透性角膜移植术后免疫排斥反应具有明显的抑制作用,可延长植片存活时间,抑制新生血管,其作用优于环孢素A.     

缝线诱导角膜新生血管形成:术后核因子кB表达的动态变化

背景: 角膜新生血管化不但严重影响视力, 也是同种异体角膜移植术后发生排斥反应的高危因素, 因此研究角膜新生血管发病机制和能阻止其形成的抑制剂, 一直是眼科学的热点和难点。目的: 采用缝线法建立大鼠角膜新生血管模型, 以地塞米松作为糖皮质激素类角膜新生血管抑制剂, 探讨核因子κB在角膜新生血管发生发展中的作用机制。设计: 随机对照的实验研究。单位: 南方医科大学珠江医院眼科。材料: 实验于 2005- 01/04 在解放军第一军医大学珠江医院眼科完成。选用 55 只出生二三个月雄性健康清洁级 Wistar 大鼠。兔抗大鼠核因子κB P65 多克隆抗体, 兔抗大鼠血管内皮生长因子、细胞间粘附分子 1 多克隆抗体均购自武汉博士德生物工程有限公司。方法: ①实验干预: 摸球法随机将大鼠分为生理盐水组(n =25) 、地塞米松组(n =25) 、正常角膜组(n =5) 。生理盐水对照组及地塞米松组大鼠采用缝线法建立大鼠角膜新生血管模型后, 分别给予生理盐水及地塞米松眼液点右眼, 2 滴 / 次, 3 次 /d, 至术后 18 d。正常角膜组无干预措施。②实验评估: 术后 1, 3, 7, 12, 18 d 对生理盐水对照组及地塞米松组大鼠进行角膜新生血管生长评分, 取各组角膜切片后光镜下观察各组角膜组织学变化, 并采用免疫组织化学染色检测各组角膜核因子κB与细胞间粘附分子 1、血管内皮生长因子的表达。主要观察指标: ①角膜新生血管生长评分。②角膜组织学变化。③各组角膜核因子κB与细胞间粘附分子 1、血管内皮生长因子的表达。结果: ①角膜新生血管生长评分: 地塞米松组角膜新生血管受到了明显的抑制, 其术后各时间点的角膜新生血管评分均低于生理盐水组 (P <0.05～0.01)。②角膜组织学变化: 地塞米松组角膜缝线诱导后新生血管及炎性细胞浸润均较对照组明显减轻, 角膜各层结构相对完整。③角膜核因子κB与细胞间粘附分子 1、血管内皮生长因子表达: 地塞米松组各时间点角膜中核因子κB与细胞间粘附分子 1、血管内皮生长因子的表达低于生理盐水组(P < 0.05) , 且核因子κB表达强度与角膜新生血管评分及下游基因细胞间粘附分子 1、血管内皮生长因子的表达强度成正相关(r =0.961, 0.922, 0.958, P < 0.01) 。结论: 核因子κB参与角膜新生血管的形成, 其可能通过上调下游基因血管内皮生长因子、细胞间粘附分子 1 等基因的表达参与角膜新生血管的形成。地塞米松通过减弱核因子κB活性, 抑制受其调控的多种细胞因子、粘附分子等角膜新生血管相关因子的表达, 从而抑角膜新生血管的发生发展。     

雷帕霉素联合环孢霉素A滴眼液对大鼠高危角膜移植排斥反应的作用

目的:观察雷帕霉素滴眼液眼局部应用对大鼠高危角膜移植免疫排斥反应的影响,并观察其与环孢霉素A联合应用的效果。方法:实验于2004-12/2005-03在辽宁医学院动物实验室完成,选用健康雄性SD受体大鼠50只及雌性Wistar供体大鼠23只。以SD角膜新生血管化大鼠为受体,建立大鼠高危穿透性角膜移植动物模型。①造模及移植术后40只受体大鼠进入结果分析,按随机数字表法分为4组,每组10只。对照组滴用滴眼液基质,雷帕霉素组滴用2g/L雷帕霉素滴眼液,环孢霉素A组滴用10g/L环孢霉素A滴眼液,各组均100μL/次;雷帕霉素 环孢霉素A组应用2g/L雷帕霉素滴眼液联合10g/L环孢霉素A滴眼液滴眼,各50μL/次。手术后第2天起术眼开始用药,4次/d,连续用药至排斥反应发生。②对角膜植片在裂隙灯下进行临床观测,混浊、水肿和新生血管3项指标评分之和为当日排斥反应指数,当排斥反应指数≥5时,或者植片混浊一项达到3时视为排斥反应发生,记录角膜植片存活时间。③角膜移植术后第14天各组随机抽取4只受体大鼠行角膜组织学检查。结果:40只受体大鼠进入结果分析。①各组受体大鼠角膜植片的存活时间比较:对照组、雷帕霉素组、环孢霉素A组及雷帕霉素 环孢霉素A组角膜植片的存活时间分别为(7.67±1.03,16.67±1.63,15.50±2.43,21.33±2.94)d,各用药组角膜植片的存活时间与对照组比较均显著延长(P<0.01);联合用药组优于单独用药组(P<0.01);雷帕霉素组与环孢霉素A组比较差异无显著性意义(P>0.05)。②各组受体大鼠角膜移植术后14d角膜的组织形态学变化:各用药组角膜植片炎细胞浸润、新生血管形成及水肿程度均明显轻于对照组,雷帕霉素与环孢霉素A联合用药组植片中央部未见炎性细胞浸润及新生血管。结论:2g/L的雷帕霉素滴眼液能显著延长高危角膜移植角膜植片的存活时间,联合应用10g/L的环孢霉素A滴眼液具有协同作用,治疗效果优于雷帕霉素或环孢霉素A单独用药。     

高危角膜移植后免疫排斥反应与颈淋巴结切除

背景:颈淋巴结是角膜的引流区淋巴结.角膜移植后,抗原提呈细胞随着房水经由脉络膜巩膜外途径引流至颈淋巴结而诱发角膜免疫排斥反应.目的:观察在碱烧伤的角膜植床上行角膜移植后的免疫排斥反应现象,认识颈淋巴结切除抑制角膜移植后免疫排斥的效应.设计:随机对照动物实验.单位:中山大学中山眼科中心.材料:实验于2005-05/2007-02在中山大学中山眼科中心完成(眼科学国家重点试验室.实验室编号2006DA105054).选用SD大鼠104只, Wistar大鼠40只,均为雄性,鼠龄1～2个月,均由中山大学实验动物中心提供.实验所用的白细胞介素2 和干扰素γ ELISA试剂盒由美国Biource International公司提供.实验过程对动物的处置符合在眼科研究使用动物的ARVO声明.方法:以SD鼠为受体,Wistar鼠为供体,所有受体大鼠均行同种异体角膜移植.受体鼠被随机分为4组:正常对照组:行正常角膜移植;B组为颈淋巴结切除组:正常大鼠切除双侧颈淋巴结;碱烧伤后角膜移植组:角膜碱烧伤后21 d时行角膜移植;碱烧伤后角膜移植合并颈淋巴结切除组:角膜碱烧伤后立即行双侧颈淋巴结切除,21 d后再行角膜移植;每组20只.应用ELISA法检测角膜移植后各组植片中干扰素γ、白细胞介素-2蛋白的表达,记录角膜排斥反应发生的时间并比较各组植片平均存活时间.其余24只受体鼠用于在裂隙灯下及组织切片后显微镜下观察碱烧伤后角膜炎症及新生血管的动态变化.结果: ①病理组织学:正常角膜无炎症及新生血管.碱烧伤后3天时,角膜基质中存在着大量的炎症细胞浸润.3周末时无明显的炎症征象,但角膜新生血管达到高峰.碱烧伤后8周时,角膜新生血管已完全消退.②植片平均存活时间: 正常对照组、颈淋巴结切除组、碱烧伤后角膜移植组、碱烧伤后角膜移植合并颈淋巴结切除组分别为(10.40±1.14),(46.30±9.46),(7.00±1.58)和(15.00±3.39)d;颈淋巴结切除组较正常对照组明显延长(P < 0.05),而碱烧伤后角膜移植合并颈淋巴结切除组较碱烧伤后角膜移植组明显延长,差异具有显著性意义 (P < 0.05).③移植后角膜中干扰素γ及白细胞介素2蛋白的表达:角膜移植后颈淋巴结切除组植片中无干扰素γ及白细胞介素2蛋白的表达.在角膜移植后3,7,10,14 d,碱烧伤后角膜移植合并颈淋巴结切除组干扰素γ和白细胞介素-2的表达均明显下降,与碱烧伤后角膜移植组比较,差异有显著性意义(P < 0.05).结论:颈淋巴结切除能有效抑制正常及碱烧伤后角膜移植术后的免疫排斥反应.     

兔角膜碱烧伤模型房水中肿瘤坏死因子α及血管内皮生长因子表达与姜黄素的抑制☆

背景:稳定的角膜新生血管动物模型是研究角膜新生血管调控机制,姜黄素对碱烧伤角膜新生血管具有抑制作用和保护作用. 目的:探讨姜黄素对碱烧伤角膜新生血管模型中肿瘤坏死因子α及血管内皮生长因子表达的影响,为防治角膜新生血管提供理论依据. 方法:纳入33只新西兰大耳白兔,随机取3只设为正常组,其余30只建立兔角膜碱烧伤诱发角膜新生血管模型,右眼设为对照组给予生理盐水,左眼设为干预组给予姜黄素,裂隙灯观察角膜新生血管生长及角膜混浊情况,酶联免疫吸附实验检测肿瘤坏死因子α和血管内皮生长因子在房水中的表达. 结果:正常组没有角膜新生血管生成.与对照组比较,干预组角膜新生血管受到抑制且角膜混浊较轻(P <0.05).房水肿瘤坏死因子α和血管内皮生长因子在3组中均有表达,对照组和干预组明显高于正常组,但干预组低于对照组(P<0.05).说明姜黄素可以有效降低角膜碱烧伤后房水肿瘤坏死因子α及血管内皮生长因子的表达进而抑制兔角膜碱烧伤后角膜新生血管的生长.     

大鼠穿透性角膜移植模型建立过程中的技术特征

背景大鼠角膜的主要组织相容性抗原的表达与人类角膜相似.早期实验证实大鼠作为穿透性角膜移植具有较好的重复性和可靠性,且移植手术难度比小鼠低.目的建立大鼠穿透性角膜移植模型,分析模型制作中并发症出现的原因及相应对策,探讨提高大鼠角膜移植模型成功率的方法.设计随机对照实验.单位华中科技大学同济医学院协和医院眼科.材料实验于2004-03/05在华中科技大学同济医学院协和医院眼科完成.选取远交系两月龄Wistar雌性大鼠76只,随机分为实验组和对照组,38只/组,无眼部疾病,清洁级,体质量180～200 g,右眼作为受体;SD雌性大鼠38只,双眼作为供体.全部动物均由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供.方法采用中心穿透性原位角膜移植术,均选择Wistar大鼠右眼建立模型.术前10min用美多丽滴眼两次,将右眼瞳孔充分扩大,达到4.0mm.按体质量3.0 mL/kg水合氯醛腹腔注射全麻,体积分数0.1地卡因滴眼液术前5 min点眼两次.大鼠头部常规消毒,保持鼠眼处于水平位置,保持大鼠呼吸道通畅.用有齿眼科镊夹持大鼠术眼后部,固定术眼使其处于半脱位状态.以3.5 mm直径环钻钻取SD大鼠双眼角膜作为植片,内皮面向上放入培养皿中,用质量浓度20g/L甲基纤维素覆盖备用.以3.0 mm直径环钻钻取Wistar大鼠右眼角膜作为植孔,立即将植片用10-0尼龙线间断缝合于Wistar大鼠右眼植孔,实验组角膜移植缝合8针,对照组角膜移植缝合6针.术后滴氧氟沙星眼药水,胶带粘贴术眼.观察角膜排斥反应,以混浊、水肿及新生血管3项指标进行评分,3项评分之和为当日排斥反应指数.当日排斥反应指数≥5或角膜浑浊达到3级时,视为排斥反应发生.运用x2和Fisher确切概率法进行统计学检验.主要观察指标①两组大鼠角膜移植后并发症发生比较.②角膜植片存活时间及角膜排斥反应.结果作为受体的76只Wistar大鼠中途脱落5只,其中实验组术后意外死亡1只,对照组术后意外死亡2只,互相撕咬伤及术眼角膜2只,淘汰后均及时补充,进入结果分析数量保持76只.①角膜移植后并发症发生比较实验组虹膜前粘连且瞳孔不圆、伤口闭合欠佳且前房不形成数量明显低于对照组(4,14只,P=0.007;2,9只,P=0.047).②角膜植片存活时间及角膜排斥反应实验组和对照组角膜植片存活时间基本接近[(8.9±2.3),(8.6±2.3)d,P＞0.05];角膜移植术后16 d,两组全部发生排斥反应,排斥反应发生率100%.结论在保留缝线、不加干预的情况下,大鼠角膜移植与人类角膜移植急性排斥反应相似.实验结果说明,大鼠3.5 mm植片对3.0mm植孔的角膜移植缝合8针,可以减低大鼠角膜移植的并发症,使其成为理想的角膜移植动物模型.熟练的显微操作技术,良好的手术器械,以及充分散大的瞳孔可以最大程度地减少大鼠术后并发症的发生.     

兔角膜碱烧伤模型房水中肿瘤坏死因子α及血管内皮生长因子表达与姜黄素的抑制

背景：稳定的角膜新生血管动物模型是研究角膜新生血管调控机制,姜黄素对碱烧伤角膜新生血管具有抑制作用和保护作用。目的：探讨姜黄素对碱烧伤角膜新生血管模型中肿瘤坏死因子α及血管内皮生长因子表达的影响,为防治角膜新生血管提供理论依据。方法：纳入33只新西兰大耳白兔,随机取3只设为正常组,其余30只建立兔角膜碱烧伤诱发角膜新生血管模型,右眼设为对照组给予生理盐水,左眼设为干预组给予姜黄素,裂隙灯观察角膜新生血管生长及角膜混浊情况,酶联免疫吸附实验检测肿瘤坏死因子α和血管内皮生长因子在房水中的表达。结果：正常组没有角膜新生血管生成。与对照组比较,干预组角膜新生血管受到抑制且角膜混浊较轻（P〈0.05）。房水肿瘤坏死因子α和血管内皮生长因子在3组中均有表达,对照组和干预组明显高于正常组,但干预组低于对照组（P〈0.05）。说明姜黄素可以有效降低角膜碱烧伤后房水肿瘤坏死因子α及血管内皮生长因子的表达进而抑制兔角膜碱烧伤后角膜新生血管的生长。     

螺内酯对碱烧伤诱导大鼠角膜新生血管形成的影响及其机制研究

背景:螺内酯为醛固酮受体拮抗剂,近来有实验证实螺内酯在体内外能够有效地抑制新生血管的形成.目的:验证螺内酯对碱烧伤诱导大鼠角膜新生血管的抑制作用.方法:取SD大鼠36只,采用碱烧伤方法制各大鼠角膜新生血管模型,造模后以数字表法随机分成实验组和对照组.实验组术后灌胃给予螺内酯100 mg/kg,1次/d,对照组灌胃给予等量生理盐水.另取大鼠6只不作任何处理作为正常对照组.于造模后4,7,14 d运用裂隙灯观察各组大鼠角膜新生血管并计算面积,并每组随机处死6只大鼠,运用免疫组化染色方法和计算机图像分析系统检测观察血管内皮细胞生长因子及基质金属蛋白酶2的表达.结果与结论:正常角膜组织未见炎症细胞与新生血管,角膜上皮及基质层仅见微弱血管内皮细胞生长因子表达,未见基质金属蛋白酶2表达.与对照组比较,实验组各个时期新生血管面积减小,血管内皮细胞生长因子和基质金属蛋白酶2表达降低(P<0.05).提示螺内酯可能通过参与下调血管内皮生长因子和基质金属蛋白酶2表达,从而有效地抑制角膜新生血管的形成.