NOB1基因对膀胱癌细胞凋亡的影响及其机制研究

目的探讨干扰NOB1基因对膀胱癌细胞凋亡和Wnt/β-catenin信号通路的影响。方法将膀胱癌T24细胞分为对照组(CON组),不进行转染、siRNA阴性对照组(siRNA-CON)、NOB1-siRNA组。分别采用RT-PCR和Western blot检测转染后三组细胞中NOB1 mRNA和蛋白的表达水平;MTT法检测细胞活力;流式细胞技术检测细胞凋亡情况;Western blot检测β-catenin和c-Myc蛋白表达水平。用Wnt/β-catenin信号通路抑制剂FH535处理NOB1-siRNA组细胞,设置为NOB1-siRNA-FH535组,检测细胞活力、细胞凋亡情况和β-catenin、c-Myc蛋白表达水平。结果NOB1-siRNA组NOB1 mRNA和蛋白表达水平均低于siRNA-CON组和CON组,差异有统计学意义(P<0.05)。NOB1-siRNA组细胞活力低于siRNA-CON组和CON组,差异有统计学意义(P<0.05)。流式细胞检测结果显示,NOB1-siRNA组细胞凋亡率高于siRNA-CON组和CON组,差异有统计学意义(P<0.05)。NOB1-siRNA组β-catenin和c-Myc蛋白表达水平均低于siRNA-CON组和CON组,差异有统计学意义(P<0.05)。NOB1-siRNA-FH535组细胞活力低于NOB1-siRNA组(P<0.05)。流式细胞技术检测结果显示,NOB1-siRNA-FH535组细胞凋亡率高于NOB1-siRNA组(P<0.05)。Western blot检测结果显示,NOB1-siRNA-FH535组β-catenin及c-Myc蛋白表达水平低于NOB1-siRNA组(P<0.05)。结论干扰NOB1表达可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活而促进膀胱癌细胞的凋亡。     

RB1抑癌基因对人膀胱癌细胞抑癌作用的研究

采用电穿孔方法将组装于ＤＮＡ质粒载体ｐＣＭＶ－ｎｅｏ的ＲＢ１基因导入该基因功能丧失的膀胱癌细胞系ＨＴＢ９－５６３７。结果表明ＲＢ１抑癌基因对人类膀胱癌细胞具有明显抑癌作用。     

Ganciclovir对转导HyTK基因人膀胱癌EJ细胞DNA含量的影响

目的了解ＨｙＴＫ基因转移联合Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ（ＧＣＶ）对人膀胱癌细胞的杀伤作用。方法采用５７０型粘附式细胞激光定量分析筛选仪测定ＧＣＶ作用下人膀胱癌细胞株ＥＪ细胞、转导ＨｙＴＫ基因的ＥＪ细胞（ＥＪ／ＴＫ）ＤＮＡ含量的变化。结果实验组ＥＪ／ＴＫ细胞ＤＮＡ平均荧光值１５９２０８±１８０７０,明显低于对照组２０４７１７±２２８４１（Ｐ＜０００１）;而ＥＪ细胞ＤＮＡ平均荧光值实验组为２２４６０６±２３４．６６,对照组为２２３２９７±２５２．０８,两组间差异无显著性（Ｐ＞０５）。结论ＧＣＶ作用能明显降低转导ＨｙＴＫ基因ＥＪ细胞（ＥＪ／ＴＫ）的ＤＮＡ含量,提示ＨｙＴＫ基因转移联合ＧＣＶ对膀胱癌细胞有杀伤作用     

Rab25基因对人乳腺癌细胞的生物学行为的影响及其与Her-2/neu基因的关系

目的:探讨Rab25基因表达水平对乳腺癌细胞生物学活性的影响以及其作用与Her-2/neu基因的关系.方法:通过质粒转染和RNA干扰采用,升高或降低不同的乳腺癌细胞株Rab25基因表达,以及升高或降低稳定表达Rab25基因的不同乳腺癌细胞株Her-2/neu基因表达.检测各组细胞的增殖活性、克隆形成率和转移侵袭力.结果:不同细胞株Rab25转染组的增殖活性、克隆形成率、转移侵袭力均较其Rab25干扰组、原株细胞组及阴性对照组有明显增强(均P＜0.05).在稳定表达Rab25基因的不同乳腺癌细胞系中无论升高或降低Her-2/neu基因表达,其增殖活性、克隆形成率、转移侵袭力均无明显改变(均P＞0.05).结论:Rab25基因在乳腺癌细胞中发挥着促进癌细胞生长、增强其增殖及侵袭的作用,且Her-2/neu基因的表达水平不能影响其发挥作用.     

microRNA-449a靶向Notch1抑制膀胱癌细胞J82的迁移

【摘要】〓目的〓研究microRNA-449a(miR-449a)对膀胱癌细胞J82迁移能力的影响以及对靶基因Notch1表达的影响。方法〓通过mimics转染膀胱癌细胞株J82使其过表达miR-449a,利用Transwell实验、细胞划痕实验观察细胞迁移能力的变化;采用实时定量PCR和蛋白印迹检测细胞Notch1表达水平的变化,并通过荧光素酶实验验证miR-449a与Notch1基因的直接调控关系。结果〓与对照组相比,转染miR-449a组的J82细胞的迁移能力减弱。过表达miR-449a后,J82细胞Notch1的mRNA表达无明显变化(P=0.5739),但Notch1蛋白表达下调(P=0.0135)。荧光素酶报告基因实验显示,miR-449a能明显抑制Notch1-3’UTR的荧光素酶活性(P=0.0016)。结论〓过表达miR-449a可能通过靶向降低Notch1基因的蛋白表达,抑制膀胱癌细胞的迁移。     

基因沉默技术在膀胱癌治疗中的应用进展

基因沉默技术早期一般指反义核酸技术,它是将特定的序列导入细胞后,在转录或翻泽水平阻断某些基因的异常表达,以达到治疗疾病的目的.基因沉默技术既是一种筛选、研究癌基因的有效方法,也是一种极具潜力的抗肿瘤治疗方法.其中包括反义RNA技术、核酶技术、三链技术及干扰RNA技术等.随着反义RNA技术的进展、干扰RNA技术的发现、成熟,以反义技术为核心的研究策略日益受到科研工作者的重视,反义人工核酸的应用成为基因治疗中的重要研究方向,利用反义技术进行研究取得了令人兴奋的成果.本文概述了近期已经研究完成的关于通过反义寡(脱氧)核苷酸(AS-ODNs)和小干扰RNA分子(siRNAs)阻断潜在的膀胱癌与异种移植物细胞靶基因的相关研究以及应用反义人工核酸预处理对不同化疗下杀伤膀胱癌细胞的加强效果.     

5-Aza-dc对膀胱癌ScaBer细胞CDH13基因甲基化状态和蛋白表达以及细胞增殖迁移侵袭的影响

目的 探讨去甲基化药物5-Aza-dc对膀胱癌ScaBer细胞CDH13基因甲基化状态和蛋白表达以及细胞增殖迁移侵袭的影响.方法 以膀胱癌ScaBer细胞为研究对象,分为5-Aza-dc处理组和对照组.应用5-Aza-dc与ScaBer细胞共同孵育后,用MSP检测CDH13基因甲基化状态、western blot检测CDH13的表达水平、MTT法检测细胞增殖、划痕实验检测细胞迁移能力、Transwell法检测细胞侵袭能力.结果 5-Aza-dc与ScaBer细胞共同孵育后CDH13基因甲基化状态得到逆转,与对照组相比CDH13蛋白表达明显增加(P＜ 0.05);实验组细胞增殖能力下降,迁移和侵袭能力减弱,与对照组相比差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 5-Aza-dc可逆转CDH13基因的甲基化状态并使其蛋白表达增加,CDH13表达增加后细胞的增殖、迁移和侵袭能力明显减弱,CDH13有可能成为膀胱癌治疗的新的靶点.     

Notch1基因表达的变化对人肾细胞癌ACHN细胞凋亡的影响

目的 探究Notch1基因表达的变化和人肾细胞癌(RCC) ACHN细胞凋亡的关系.方法 选取人RCC细胞株ACHN细胞为研究对象,采用不同浓度的姜黄素作用于ACHN细胞,收集不同时间段的ACHN细胞,采用实时荧光定量多聚酶链反应法(RT-qPCR)、Western blot方法分析Notch1基因mRNA及蛋白的表达...     

沉默 Notch-1 基因影响人膀胱癌 RT4 细胞生物学行为的体外实验研究

目的：研究沉默 Notch-1 基因对人膀胱癌 RT4 细胞增殖、凋亡、侵袭和上皮间质转化等生物学行为的影响。方法： 设计并构建 Notch-1 shRNA,选取 RT4 细胞作为研究对象分别进行转染。实验细胞分为 Notch-1 阴性对照组（shRNA NC）, Notch-1 干扰组（Notch-1 shRNA）。细胞转染 48 h 后,MTT 法检测细胞增殖水平变化;Transwell 检测细胞侵袭力的改变;流式细胞术检测细胞凋亡水平情况;RT-PCR 和 Western blot 检测凋亡相关蛋白（Bax、Bid、Bcl-2）及上皮间充质转化（EMT） 因子（E-cadherin、N-cadherin、Vimentin）在 mRNA 和蛋白水平上的改变。结果：与 shRNA NC 组相比,Notch-1 shRNA 组细胞增殖率明显下降（t =4.629,P =0.010）,侵袭力减弱（t = 8.193,P=0.001）,细胞凋亡率明显升高（t= –18.441,P<0.001）,Bad（t = –12.521,P<0.001 ;t = –6.983,P =0.002）、Bid（t = –9.231,P<0.001 ;t= –8.871,P=0.001）、E-cadherin（t= –13.457,P<0.001 ;t= –5.610,P=0.005）mRNA 和蛋白表达量增多,Bcl2（t=10.651,P<0.001 ;t=6.973,P=0.002）、N-cadherin（t=6.505,P<0.001 ;t=10.132,P=0.001）、Vimentin（t=9.135,P<0.001 ;t =5.630,P =0.005）mRNA 和蛋白表达量显著降低。结论：沉默 Notch-1 的表达能够抑制人膀胱癌 RT4 细胞的增殖和侵袭迁移,促进其细胞凋亡,其机制可能与诱导 Bad、Bid、E-cadherin,抑制 Bcl2、N-cadherin、Vimentin 的表达有关。     

TGF—β1蛋白的表达对膀胱癌生物学行为的影响

应用ＴＧＦ－β１放免分析方法对１８例膀胱移行细胞癌进行研究，并选取９例下沉膀胱对照。结果显示：膀胱癌组织中ＴＧＦ－β１蛋白表达量显著高于正常膀胱粘膜，分期Ｔ１组和Ｔ２组ＴＧＦ－β１蛋白表达量显著高于Ｔａ组。Ｇ３组ＴＧＦ－β１蛋白表达量显著高于Ｇ１组。     

PSF1在结肠癌组织中的表达及其对结肠癌细胞增殖的影响

目的检测PSF1在结肠癌组织中的表达,探讨RNA干扰沉默PSF1表达对人结肠癌细胞增殖的影响及其可能的机制。方法收集2004年5月至2006年12月间经病理确诊的40例结肠癌标本．采用Westerllblot检测标本中PSF1蛋白表达水平;应用脂质体法将靶向PSF1的短发夹RNA（shRNA）干扰质粒转染人结肠癌细胞株LOVO、HT．29和HCT116,Westernblot法检测PSF1蛋白表达变化．分别应用MTY法、软琼脂克隆形成实验及荧光定量PCR检测转染PSF1shRNA干扰质粒对结肠癌细胞增殖活性、锚定非依赖性生长能力及PSF2、PSF3和SLD5mRNA表达的影响。结果结肠癌组织中PSF1蛋白相对表达量为0．485±0．113,显著高于正常黏膜组织的0．056±0．014（P〈0．01）。转染PSF1sbRNA干扰质粒后,LOVO、HT-29和HCT116细胞中PSF1蛋白表达水平均显著下降（P〈0．05）,细胞增殖能力显著降低,软琼脂克隆形成率明显下降。与阴性对照组及正常生长组细胞比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）。转染PSF1shRNA干扰质粒后．LOVO、HT-29和HCT116细胞中PSF2、PSF3和SLD5mRNA表达均明显下降（P〈0．05）。结论PSF1与结肠癌的发生发展具有一定关系。利用RNA干扰技术能有效抑制结肠癌细胞中PSF1表达。并抑制结肠癌细胞增殖。PSF1基因有望成为结肠癌靶向治疗的新靶点。     

单核细胞趋化蛋白-1转基因对膀胱肿瘤生物学行为的影响

目的　观察单核细胞趋化蛋白 1 (MCP 1 )局部表达对膀胱肿瘤生物学行为的影响。　方法　通过脂质体介导 ,利用逆转录病毒载体将MCP 1基因导入膀胱肿瘤皮下模型的瘤细胞中。观察肿瘤生长情况 ,测瘤重及病理学检查。　结果　转基因组肿瘤生长受抑制 ,第 1 5天后生长曲线明显下降 ,瘤体湿重 (2 .6 8± 0 .6 1 ) g ,较对照组 (3.87± 0 .78)g和空白组 (3.98± 0 .70 ) g显著减轻。转基因组肿瘤向周围组织的侵袭力减弱 ,瘤内呈弥漫分布的点状或小片状坏死 ,并以单核细胞和淋巴细胞浸润为主。　结论　MCP 1对免疫细胞的趋化与活化在抗膀胱肿瘤的免疫效应中有重要作用。     

结直肠癌Dll-1/Notch信号传导通路的研究

目的 研究Dll-1/Notchl信号传导通路与结直肠癌病理学特征的关系,明确此通路对结直肠癌细胞增殖及凋亡的影响.方法 应用固定化蛋白质印迹法检测63例结直肠癌组织及其邻近正常肠黏膜中Dll-1及Notch1蛋白表达;用Notch1通路中γ-分泌酶抑制剂DAPT作用于结肠癌细胞系SW480,MTT法检测细胞增殖状态,流式细胞仪观察其对细胞凋亡的影响,固定化蛋白质印迹法检测Notch1胞内活性段及其靶基因产物Hes-1和Bcl-2蛋白的表达.分别采用独立样本t检验、配对样本t检验及单因素方差分析.结果 结直肠癌组织中Notch1和Dll-1蛋白表达水平分别高于正常肠黏膜的1.75及2.21倍(t=2.554,P=0.012及t=3.565,P=0.005);二者表达与肿瘤分化程度(t =2.463,P=0.017及t=2.390,P=0.019)、分期(t=2.675,P=0.007及f=2.310,P=0.021)及淋巴结转移(t =2.229,P=0.021及t=2.210,P=0.023)有关.用γ-分泌酶抑制剂DAPT阻断Notch1通路可抑制SW480细胞的增殖,诱导其凋亡;同时NICD和Bcl-2的表达水平随作用时间延长而降低.结论 Dll-1及Notch1的高表达与结直肠癌病理学特征密切相关,阻断Notch1通路可抑制Bcl-2表达,同时可抑制结肠癌细胞的增殖,并诱导其凋亡.     

羟基喜树碱对膀胱癌细胞自分泌的影响

目的 检测膀胱癌细胞自分泌因子并探讨羟基喜树碱对自分泌的影响。方法 采用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术,在无血清培养情况下检测膀胱癌Ｔ２４细胞株自分泌因子ＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２、ＩＧＦ－１受体、白细胞介素（ＩＬ）－６受体、ＩＬ－６受体表达情况,并进一步用半定量ＲＴ－ＰＣＲ方法观察膀胱灌流药物羟基喜树碱分别在０．００５、０．０１０、０．０２０ｍｇ／Ｌ浓度时对前述指标的影响。结果 经羟基喜树碱（０．０１０ｍｇ／Ｌ）处理后,ＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２、ＩＧＦ－１受体、ＩＬ－６、ＩＬ－６受体分别下降下４４．８％,５９．７％,３９．３％,５１．５％及４６．２％,同未痉基喜树碱处理组相比差异有显著性（Ｐ〈０．０５）。结论 膀胱癌细胞可自分泌ＩＬ－６、ＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２等自分泌因子,羟基喜树碱对膀胱肿瘤自分泌表达的     

过表达急性早幼粒白血病基因对膀胱肿瘤细胞UM-UC-2体外增殖影响

目的 探讨急性早幼粒白血病基因（PML）对于膀胱肿瘤细胞株UM-UC-2的体外增殖抑制作用及其诱导凋亡的作用。方法 应用脂质体Lipofeetamine2000建立稳定可诱导表达的膀胱肿瘤细胞株UM-UC-2，Western blot检测PML蛋白的表达情况；噻唑蓝（MTT）比色法检测肿瘤生长情况；Giemsa染色、TUNEL和DNA ladder法检测肿瘤的凋亡情况。结果 经100μmol／L的ZnSO4诱导表达后，与对照组比较PML组细胞生长明显受到抑制并且细胞周期停滞在G1期。Giemsa染色提示过表达PML蛋白的细胞核浓染，细胞变圆，DNA ladder电泳提示转染PML细胞细胞在诱导表达后24h出现梯状凋亡特征的电泳条带，TUNEL显示转染PML细胞细胞核内蓝褐色颗粒，对照组未见明显凋亡特征性改变。结论 建立了稳定的可诱导表达PML的膀胱肿瘤细胞株。同时，过表达PML可以抑制膀胱肿瘤细胞株UM-UC-2的体外增殖作用，诱导膀胱肿瘤细胞凋亡。     

人结肠癌相关成纤维细胞对结肠癌Lovo细胞生物学行为的影响

目的探讨人结肠癌相关成纤维细胞（CAF）对结肠癌Lovo细胞增殖、黏附、迁移和侵袭等生物学行为的影响。方法收集人结肠CAF及正常成纤维细胞（NF）条件培养基,建立结肠CAF、NF与Lovo细胞间的共培养模型,以无血清培养基处理的Lovo细胞作为空白组．进行细胞增殖、黏附、迁移及Transwell侵袭能力检测。结果Lovo细胞与结肠CAF共培养后。增殖48和72h反映细胞增殖的吸光度（A）值分别为（0．667±0．059）和（0．709±0．030）,明显高于空白组[（0．574±0．031）和（0．593±0．031）]和NF组[（0．597±0．036）和（0．652±0．029）],差异均有统计学意义（P〈0．01）;黏附细胞的A值为（0．588±0．067）,也明显高于空白组（0．226±0．039）和NF组（O．375±0．059）,差异也均有统计学意义（P〈O．01）;12h和24h细胞迁移率分别为（35．2±8．7）％和（64．6±7．1）％,明显高于空白组[（14．7±3．6）％和（26．3±10．3）％]和NF组[（14．1±7．3）％和（35．2±9．8）％]（P〈O．01）;透膜细胞数为（56．2±4．8）个,多于空白组的（14．6±2．2）个和NF组的（22．9~4．5）个（P〈O．01）。结论人结肠CAF具有增强结肠癌Lovo细胞增殖、黏附、迁移和侵袭的能力。     

Resveratrol activates Notch signalling pathway via Sirtuin 1 in podocytes

Objective To explore the relationship between resveratrol and Notch 1 signalling pathway in podocytes. Methods Interference RNA (RNAi) and doxycycline (Dox) were used to inhibit the Sirtuin (SIRT) 1 expression in the wild - type and inducible SIRT1 shRNA (CAGGS) podocytes respectively. Recombinant mouse delta - like ligand 4 (DLL4) was used to activate Notch1 signalling. The message RNA of SIRT1, Notch1 downstream gene Hes1 and Hey2, as well as the key enzymes of Notch1 signalling pathway were detected by using real - time PCR. Western blotting was used to detect intracellular domain of Notch 1 (ICD1), SIRT1, and metalloprotease (ADAM) 10 and components of γ-secretase complex protein expression. Results In WT murine podoytes, resveratrol up-regulated ICD1 protein production, as well as the mRNA of Hes1 and Hey2 in a dose-dependent manner. Treatment with resveratrol resulted Nicastrin mRNA and protein increase in podocytes (P＜0.05), as well as inhibit ADAM10 expression (P＜0.05), but all these changes were prevented after the use of SIRT1 RNAi(P＜0.05). DLL4 up-regulated the expression of mRNA of Hes1 and Hey2, as well as ICD1 protein production in a dose-dependent manner. Treatment with doxycycline resulted decrease of SIRT1 gene and protein expression in CAGGS podocytes after 24 h and 48 h respectively(P＜0.05),which weakend the role of DLL4 significantly(P＜0.05). Conclusion Resveratrol induces Nicastrin expression, as well as activation of Notch1 signalling pathway in a SIRT1-dependent manner.     

野生型p53基因导入对膀胱癌细胞生长抑制和H－ras基因表达调控

通过逆转录病毒载体将外源野生型ｐ５３基因导入膀胱癌细胞ＢＩＵ－８７和ＥＪ，使细胞在体外标准培养条件下生长速率降低，丧失裸鼠致瘤性。细胞周期分析显示Ｇ０＋Ｇ１细胞比率明显增高，已证明，ＢＩＵ－８７和ＥＪ细胞都有ｒａｓ基因突变和表达扩增。进一步研究发现，转染的细胞内Ｈ－ｒａｓｍＲＮＡ表达低于非转染细胞。结果提示，增加细胞内野生型ｐ５３基因表达量能抑制突变的ｒａｓ基因表达，从而抑制膀胱癌细胞的恶性增殖。     

靶向survivin的shRNA对人胆管癌细胞体外增殖及凋亡的影响

目的：探讨靶向survivin的shRNA对人胆管癌细胞体外增殖及凋亡的影响。方法：合成具有互补序列的能够编码短发卡RNA（shRNA）的双链寡核苷酸并构建pSilencer2．1真核表达质粒,经稳定转染QBC939细胞后对转基因后胆管癌细胞的生物学行为进行观察。结果：neo基因稳定表达于转染阳性质粒及阴性对照质粒的QBC939细胞中。通过RT—PCR及westernblot检测证实shRNA在mRNA及蛋白质水平抑制survivin表达率分别达68固％和613％。细胞计数及平板克隆形成实验显示转染细胞生长速度及细胞克隆明显减缓（P〈O．01）。流式细胞术测定细胞周期显示转染细胞G1期细胞明显增多,S期细胞明显减少。DNAladder、透射电镜观察及流式细胞定量研究显示转染细胞凋亡明显增多。结论：靶向survivin的shRNA能有效抑制目的基因的表达,通过增加细胞凋亡在体外抑制人胆管癌细胞的生长,为胆管癌的基因治疗提供一定的实验基础。