小鼠抵抗素基因及其反义核酸真核表达体系的构建与鉴定

目的构建载有小鼠抵抗素(resistin)基因及其反义核酸的重组真核表达质粒,为下一步进行resistin生物功能研究打基础。方法用resistin基因mRNA编码区序列特异引物,从小鼠脂肪组织中,通过RT-PCR的方法合成resistin cDNA,T4DNA连接酶将resistin cDNA克隆于pGEM-T载体,经双酶切及测序鉴定克隆成功后再亚克隆于pcDNA3.1(+)或pcDNA3.1(-)真核表达载体,并测序鉴定。结果PCR产物长度与resistin cDNA理论长度363bp相符;重组pGEM-T被EcoRⅠ和XbaⅠ内切酶切为约3000bp和355bp两个片段,测序结果表明插入pGEM-T的DNA片段的核苷酸序列与小鼠resistin基因mRNA编码区序列完全一致。重组pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(-)测序结果表明插入的DNA片段分别与小鼠resistin基因mRNA编码区序列和反义resistin基因mRNA编码区核苷酸序列一致。结论成功克隆载有resistin基因和载有resistin基因反义核酸的重组真核表达质粒。     

应用RT-PCR构建人表皮生长因子基因真核表达质粒

目的体外克隆及构建带信号肽的人表皮生长因子(hEGF)基因真核表达质粒。方法设计人表皮生长因子(hEGF)基因和信号肽基因引物,采用RT-PCR技术从胎肾组织总RNA中扩增出hEGF基因和信号肽基因序列,克隆入pGEM-T载体,酶切鉴定和序列分析后经T4连接酶连接并克隆入表达质粒pcDNA3.1( ),再次酶切鉴定和序列分析。结果RT-PCR扩增产物电泳获得约90 bp和180 bp条带,与hEGF及其信号肽cDNA大小符合;克隆入T载体后经序列分析与hEGF及信号肽基因一致,克隆入pcDNA3.1( )质粒后双酶切获得约230 bp和5.4 kb条带,再次测序与hEGF cDNA一致。结论成功构建带信号肽的hEGF基因的真核表达质粒。     

小鼠T2细胞特异性转录因子GATA3基因的克隆和序列分析

目的:克隆小鼠Th2细胞分化转录因子GATA3基因的全长编码区cDNA。方法:利用RTPCR方法,从Balb/c小鼠脾细胞的mRNA中扩增GATA3基因全长cDNA,并将其连接到pMD18-T载体上,进行测序和核酸分析。结果:扩增得到的小鼠GATA3基因cDNA全长1332bp,编码444个氨基酸,其结构含有识别和结合DNA所需的高度稳定的蛋白区;blast结果分析表明,该cDNA与Genbank中发表的序列(BC062915)具有100%的同源性。结论:获得小鼠GATA3基因的克隆,为进一步研究转基因免疫干预奠定了基础。     

日本血吸虫pcDNA3．1．（＋）-SjPGK重组质粒的构建及鉴定

目的 构建日本血吸虫中国大陆株磷酸甘油酸激酶基因片段(SiPGK)的真核表达重组质粒，寻找新的预防日本血吸虫病的候选疫苗分子。方法 采用逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)技术，从日本血吸虫总RNA中体外扩增SPGK基因片段；克隆人pMD18-T载体中，然后挑取阳性克隆经双酶切分析、PCR鉴定；亚克隆人真核表达载体pcDNA3．1( )中，阳性克隆经鉴定后进行脱氧核糖核酸序列测定；运用Blast程序，将测序结果及其推导的编码氨基酸序列与NCBI数据库在核苷酸水平和氨基酸水平进行同源性比较。结果 RT-PCR特异性扩增出一条长约830bp大小的条带；重组质粒pMD18-T-SPGK和pcDNA3．1( )-SPGK经双酶切和以质粒为模板进行PCR扩增，均可获得一条与RT-PCR产物一致的DNA片段；脱氧核糖核酸序列测定和分析结果表明：SjPGK基因片段长为830bp，与SmPGK的核苷酸同源性为85％，分值为672；氨基酸同源性为94％，分值为473。结论 成功地构建pcDNA3．1( )-SiPGK重组质粒，为构建其核酸癌苗提供了条件。     

幽门螺杆菌热休克蛋白A核酸疫苗的构建

目的 构建幽门螺杆菌(Hp)热休克蛋白A (HspA)亚单位核酸疫苗,为进一步研制Hp核酸多价疫苗提供技术平台.方法 以PMD-HspA为模板,扩增、纯化Hp hspA基因,插入到真核表达载体PcDNA3中,转化大肠埃希菌DH5a,经氨苄西林抗性筛选阳性克隆,得到重组核酸疫苗pcDNA3-HspA,用特异性PCR方法和小提质粒酶切电泳鉴定重组质粒,同时将pcDNA3-HspA进行测序,进一步确定是否构建成功及鉴定构建过程中是否发生基因突变.结果 PCR鉴定结果显示,扩增产物为0.36 kb的目的基因;酶切鉴定结果显示,得到5.45 kb克隆载体片段和0.36 kb的目的基因片段;重组质粒pcDNA3-HspA测序,得到基因全长357 bp目的基因片段,与克隆质粒测序图比较,无基因变异.结论 成功构建了Hp单价核酸疫苗pcDNA3-HspA,为研制Hp核酸多价疫苗奠定基础.     

人细胞间黏附分子1cDNA的克隆及表达载体的构建

目的 构建人细胞间黏附分子-1真核表达重组体pcDNA3．1hisB-ICAM-1。方法 设计、合成ICAM-1基因序列特异性引物，从肝癌组织中提取总RNA，以此为模板经RT-CR扩增人ICAM-1的cDNA片段；然后将其克隆到pGEM-T Easy Vector，构建中介重组体(pGEM-ICAM-1)，再克隆，构建真核表达重组体pcDNA3．1HisB-ICAM-1，经菌落PCR和限制性酶切有目的片段出现，进行DNA序列分析。结果 RT-PER扩增得到人成熟ICAM-1的cDNA片段大小为1622bp，中介重组体(pGEM-ICAM-1)，酶切后与真核表达载体连接，根据酶切鉴定和DNA序列分析得到真核表达重组体pcDNA3.1HisB-ICAM-1；结论：成功构建了真核表达重组体pcDNA3．1HisB-ICAM-1。     

周期型马来丝虫GAPDH部分编码基因原核及真核表达载体的构建

[目的]构建我国流行的周期型马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶(BmGAPDH)部分编码基因原核和真核表达质粒以及基因序列分析,为进一步的研究奠定基础。[方法]根据GeneBank中马来丝虫GAPDH基因的已知序列设计引物,以周期型马来丝虫总RNA为模板,反转录PCR(RT-PCR)扩增目的编码基因。扩增产物经初步鉴定后将其克隆入pGEM-T载体,转化大肠杆菌(E.coli)DH5α,筛选阳性克隆,进行双酶切及PCR扩增鉴定,获得阳性重组质粒pGEM-BmGAPDH,经测序验证,并进行同源性比较。亚克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(+),构建真核表达载体pcD-NA3.1(+)-BmGAPDH,转染COS-7细胞后进行RT-PCR验证。[结果]RT-PCR扩增出一条约877 bp大小的特异性条带,重组质粒双酶切的PCR结果与预期相符,DNA序列分析与GeneBank已知的基因序列同源性为99%。转染的COS-7细胞高水平表达BmGAPDH的mRNA,根据克隆的目的基因序列推导的氨基酸序列与GenBank登录的一致。[结论]成功构建了周期型马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶部分编码基因原核及真核表达载体,为进一步功能研究提供了条件。     

野生小鼠抗肺肿瘤基因差异表达文库的构建

目的构建野生小鼠抗肺肿瘤基因差异表达文库。方法应用抑制性消减杂交（SSH）技术对TAF1小鼠与A／wy近交系小鼠中差异表达的抗肺肿瘤基因进行筛选，构建消减cDNA文库，并对部分克隆进行核苷酸序列分析，利用BLAST检索分析其可能代表的基因。结果166个差异表达克隆测序后进行BLAST分析，其中134个克隆与87个已知小鼠的mRNA或cDNA序列同源，32个克隆与14个DNA序列同源；87个已知基因按功能分为7大类。其他32个克隆中，20个克隆与9个鼠DNA序列同源，其中可能含有新基因，2个克隆与1个细菌序列同源，3个克隆为克隆载体。结论应用SSH技术成功构建了野生小鼠抗肺肿瘤基因差异表达文库。     

幽门螺杆菌GroEL基因真核表达载体构建及鉴定

目的构建幽门螺杆菌热休克蛋白GroEL基因的真核表达载体pcDNA3.0-GroEL,为幽门螺杆菌的基因疫苗研制提供参考依据。方法提取幽门螺杆菌基因组DNA,PCR扩增GroEL基因,克隆至pMD19-T载体,通过PCR、酶切及测序鉴定后,将GroEL基因片段用限制性内切酶切下,克隆至真核表达载体pcDNA3.0,构建pcDNA3.0-GroEL重组质粒;采用PCR、酶切对重组质粒pcDNA3.0-GroEL进行鉴定。结果扩增出幽门螺杆菌GroEL基因片段约1 640 bp;pcDNA3.0-GroEL重组质粒经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切,产生1个与GroEL基因PCR产物大小一致的小片段和1个不同于pcDNA3.0-GroEL重组质粒的大片段,表明GroEL基因已成功插入pcDNA3.0质粒中。结论成功构建幽门螺杆菌GroEL基因真核表达载体pcDNA3.0-GroEL。     

马来丝虫肌球蛋白基因序列及编码产物预测

目的 克隆周期型马来丝虫肌球蛋白(BmMyosin)基因,进行序列测定、分析及编码产物的B细胞表位预测.方法 依据公布的BmMyosin基因序列设计引物,以周期型马来丝虫总RNA为模板,反转录PCR(RT-PCR)扩增目的 编码基因.扩增产物经初步鉴定后将其克隆入pGEM-T载体,转化大肠埃希菌(E. coli)DH5α,筛选阳性克隆,进行双酶切及PCR扩增鉴定,获得阳性重组质粒pGEM-BmMyosin,经测序验证,并进行同源性比较.应用5种参数和方法 对其编码产物进行B细胞表位预测.结果 RT-PCR扩增出一条约1 292 bp大小的特异性条带,重组质粒双酶切的PCR结果 与预期相符,DNA序列分析与GeneBank已知的基因序列同源性为98.45%.经表位预测分析,BmMyosin的B细胞表位可能在287～300位、339～350位和416～422位氨基酸区域.结论 成功构建了周期型马来丝虫肌球蛋白重组质粒pGEM-T克隆载体,对其编码产物进行B细胞表位预测.为蛋白质特性分析及免疫学研究提供基础依据.     

白假丝酵母菌天冬氨酸蛋白酶真核表达质粒pcDNA3．1／SAP2的构建

目的构建白假丝酵母菌天冬氨酸蛋白酶真核表达质粒pcDNA3．1／SAP2．为以其作为基因疫苗进行免疫动物实验奠定物质基础。方法从白假丝酵母菌中提取基因组DNA，以其为模板采用聚合酶链反应（PCR）法获取SAP2基因，将真核表达质粒pcDNA3．1（＋）myc-HisC和SAP2基因行EcoRI和XhoI双酶切，琼脂糖凝胶纯化，连接酶切产物，转化TOP10感受态细菌，筛选菌落和测序鉴定。结果经PCR扩增获得的目的基因分子量与预计相同，并定向插入真核表达载体pcDNA3．1（＋）myc-HisC，电泳获得预期的SAP2条带,测序证实为正确的SAP2序列。结论利用真核表达质粒pcDNA3．1（＋）myc-HisC可以方便而高效地构建pcDNA3．1／SAP2重组质粒，该质粒能直接激活抗原提呈细胞，可以使重组质粒具有较强的免疫原性和免疫反应性。     

幽门螺杆菌Lpp20真核表达重组体的构建及其表达鉴定

目的构建含幽门螺杆菌（Hp）Lpp20基因的真核表达重组体,并鉴定其在Hela细胞中能否有效表达,为进一步开展Lpp20核酸疫苗与该蛋白的生物学功能的研究打下基础。方法抽提Hp标准菌株26695基因组DNA,应用聚合酶链式反应（PCR）技术从基因组DNA扩增Lpp20基因,经过一系列酶切、连接反应将其克隆入真核表达载体pcD-NA3.1（＋）,转入大肠杆菌,筛选阳性克隆,通过PCR和酶切反应鉴定;用脂质体法将构建好的重组载体pcDNA3.1（＋）-Lpp20转染Hela细胞,通过免疫细胞化学法及Western印迹法检测其在Hela细胞中表达的Lpp20蛋白。结果成功扩增出长约528 bp的Lpp20基因,测序结果表明扩增出的Lpp20基因与Hp Lpp20序列一致,PCR和酶切鉴定结果证实Lpp20基因正确克隆入真核表达载体pcDNA3.1（＋）,并经免疫细胞化学法和Western印迹法检测到重组体可在Hela细胞中有效表达。结论成功构建了Lpp20基因的Hp真核表达重组体,并检测到其在Hela细胞中可表达出免疫反应性良好的蛋白,为进一步探索其免疫作用及生物学功能奠定了基础。     

帕金森病PINK1蛋白真核表达载体pcDNA3．1-myc／PINK1的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的构建帕金森病PINK1基因真核表达载体pcDNA3．1-mye／PINK1,检测其转染COS-7细胞后的表达。方法用PCR方法从人cDNA文库DNA中扩增PINK1全长cDNA,该基因片段两端设计了EcoR I和BamH I限制性酶切位点。将所得片段连接到T载体上测序证实。利用重组DNA技术将PINK1的cDNA构建到真核表达载体pcDNA3．1-myc—his（-）B上,酶切鉴定。通过脂质体介导的转染技术将所构建的载体导入COS-7细胞中,体外培养,于转染48h后利用RT—PCR和Western Blotting方法检测目的基因的表达情况。主要观察指标：（1）PINK1基因cDNA扩增产物检测。（2）pcDNA3．1-myc／PINK1重组体酶切鉴定。（3）Western—blotting。结果经琼脂糖凝胶电泳及测序证实,PCR获得的片段与GenBank中登记的PINK1序列完全相同;pcDNA3．1-myc／CHIP酶切片段的长度与理论大小相符;转染48h后的COS-7细胞可检测到PINK1蛋白的表达。结论PINK1蛋白真核表达载体构建成功,在COS-7细胞中可获得表达。     

THY1基因影响上皮性卵巢癌SKOV3细胞株生长的体内和体外实验研究

目的构建THY1基因真核表达载体，并转染卵巢癌细胞株SKOV3，观察重组载体在体内和体外对SKOV3生长的影响。方法本研究于2005年3月至2007年3月通过目的基因克隆、载体构建技术构建重组载体pcDNA3．1（＋）-THY1，转染SKOV3（SKOV3-THY1组），同时设空载体转染组（SKOV3-Null组）和空白对照组（SKOV3组），甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）测定法及流式细胞术检测细胞生长及细胞周期变化；并建立雌性裸鼠异体移植卵巢癌模型，观察瘤体生长速率。结果PCR、酶切及DNA测序证实，THY1基因正确插入真核表达载体pcDNA3．1（＋），RT—PCR和蛋白质斑迹法（Westernblot）证实重组载体已整合于SKOV3；SKOV3-THY1组细胞抑制率明显高于SKOV3-Null组（P〈0．05）；建立裸鼠致瘤模型4周后，SKOV3-THY1组瘤体体积较SKOV3-Null组和SKOV3组显著降低（P〈0．05）。结论THY1真核表达载体能抑制SKOV3的恶性增殖，THY1基因可能在上皮性卵巢癌发生发展中起重要作用。     

抑制聚ADP核糖聚合酶1活性的短发夹RNA载体构建

目的构建抑制人聚ADP核糖聚合酶1(hPARP1)活性的短发夹RNA(shorthairpinRNA,shRNA)表达载体。方法化学合成2对编码短发夹RNA序列的、靶向hPARP1基因的寡核苷酸,各69对碱基,退火,然后利用BamHⅡ及EcoRⅠ与pSIRENRetroQ载体连接。用EcoRⅠ及BglⅡ切取其中U6启动子及下游的shRNA部分,与pEGFPC1载体重组构建pEGFPC1shRNA载体。结果重组构建的pEGFPC1P1、pEGFPC1P2、pEGFPC1N载体经双酶切电泳分析及插入基因片段序列分析,结果表明330个碱基成功插入到预计位点。结论载体的成功构建,为进一步研究聚ADP核糖聚合酶在DNA修复过程中的功能打下基础。     

幽门螺杆菌Lpp20真核表达重组载体的构建及鉴定

目的以幽门螺杆菌外膜脂蛋白Lpp20为目的基因,构建H.pylori Lpp20基因的真核表达重组载体pcD-NA3.1( )-Lpp20,为H.pylori核酸疫苗的研制奠定实验基础。方法用Pri mer5.0软件分析GenBank中H.pylori外膜脂蛋白Lpp20基因序列,设计合成相应特异性引物,引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点,以H.pylori26695株基因组为模板,PCR扩增Lpp20目的基因片段,定向插入真核表达载体pcDNA3.1( )多克隆酶切位点中,构建重组体pcDNA3.1( )-Lpp20;通过酶切分析,PCR鉴定及测序鉴定,筛选阳性重组体。结果以H.pylori26695株基因组DNA为模板扩增出特异的Lpp20基因片段,大小约为528bp;双酶切及测序鉴定证明成功构建了H.pylori真核表达重组载体pcD-NA3.1( )-Lpp20。结论PCR扩增得到了大小约为528bp的H.pylori Lpp20目的基因片段;并成功构建了pcD-NA3.1( )-Lpp20真核表达重组载体。     

HBV S基因与HCV C基因嵌合真核表达质粒的构建及鉴定

目的：构建含HBV S基因及HCV C基因的嵌合基因真核表达质粒，为HBV和HCV嵌合基因疫苗研究奠定基础。方法：PCR扩增分别获得HBV preS1 preS2、preS2 S、S基因片段及HCV C基因片段，以pcDNA3．1( )为载体，构建同时含HBV preSl preS2 S、preS2 S或S基因与HCV C区基因的嵌合真核表达质粒S1S2SCpcDNA3．1、S2SCpcDNA3．1、SCpcDNA3．1。结果：经酶切鉴定及测序分析，所构建的嵌合表达质粒均连接正确，与预计一致。结论：嵌合基因真核表达质粒的成功构建，将为观察嵌合基因免疫及HBV、HCV基因疫苗的研究提供实验基础。     

pcDNA3．1（＋）／NspA真核表达载体的构建及鉴定

目的构建pcDNA3.1( )淋病奈瑟菌外膜蛋白—奈瑟菌表面蛋白A(Neisseria surface Protein A,NspA)基因真核表达载体,为研制淋病奈瑟菌核酸疫苗奠定基础。方法根据淋病奈瑟菌NspA基因序列,设计合成一对引物,用PCR方法从淋病奈瑟菌基因组DNA中扩增出NspA基因片段,将扩增的产物连接于测序载体pUCm-T上,并构建重组体pcDNA3.1( )/NspA,进行酶切、PCR及测序鉴定。结果NspA基因体外扩增产物大小约为525 bp。所构建的pcDNA3.1( )/NspA重组体经双酶切及PCR鉴定,与预期片断的大小相符;测序结果与GenBank中收录的NspA全长序列一致,表明pcDNA3.1( )/NspA真核表达载体构建正确。结论成功地构建了淋病奈瑟菌真核重组表达载体pcD-NA3.1( )/NspA,为NspA蛋白的功能研究和淋病奈瑟菌核酸疫苗的研制提供了物质基础。