干细胞生长因子和粒细胞集落刺激因子与心肌梗死大鼠体内骨髓间充质干细胞的迁移*

背景：外周静脉移植间充质干细胞只有1%~5%的移植细胞能归巢到心肌梗死区域。 目的：观察干细胞生长因子、粒细胞集落刺激因子对骨髓间充质干细胞归巢的影响。 方法：采用贴壁培养法分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,取传至3~5代细胞。建立SD大鼠急性心肌梗死模型,干细胞生长因子组、粒细胞集落刺激因子组、干细胞生长因子+粒细胞集落刺激因子组在骨髓间充质干细胞移植前3 d和移植后3 d单独或混合皮下注射干细胞生长因子、粒细胞集落刺激因子,骨髓间充质干细胞组不注射细胞因子。 结果与结论：荧光显微镜下观察,骨髓间充质干细胞迁移至心肌梗死组织,骨髓间充质干细胞组、干细胞生长因子组、粒细胞集落刺激因子组迁移至心肌梗死区的骨髓间充质干细胞数量没有明显的区别(P > 0.05),干细胞生长因子+粒细胞集落刺激因子组的骨髓间充质干细胞数量明显高于其他3组(P < 0.05)。免疫荧光组织化学显示,植入的部分骨髓间充质干细胞表达心肌特异蛋白cTnI。结果说明干细胞生长因子和粒细胞集落刺激因子两种细胞因子联合应用可以促进骨髓间充质干细胞归巢至心肌梗死区域,在体内微环境的诱导下,骨髓间充质干细胞能够转化为心肌样细胞。     

不同方法移植骨髓间充质干细胞在体内重要器官的分布及分化

背景：大量实验显示心肌损伤后,趋化或直接心肌内注射的骨髓干细胞可以在体内分化为心肌细胞、血管内皮细胞或血管平滑肌细胞。 目的：观察不同方法移植的骨髓间充质干细胞体内重要器官的分布、生长和分化情况。 方法：选用3月龄日本大耳白兔39只,均制作急性心肌梗死动物模型并随机分为4组,3个组为实验组分别以心肌内直接注射、经冠脉注射、经静脉注射3种不同移植经BrdU标记的自体骨髓间充质干细胞。对照组分为3个亚组,分别经冠脉、静脉和心肌内直接注射等量的生理盐水。4周后处死动物,取心、肺、肝、肾制作组织切片并观察BrdU阳性细胞和BrdU及α-横文肌肌动蛋白双阳性细胞。 结果与结论：①骨髓间充质干细胞移植各实验组在梗死区及其周边均可见到BrdU阳性细胞和BrdU及α-横文肌肌动蛋白双阳性细胞。BrdU阳性细胞间及与宿主心肌细胞间有细胞突起相连,并可见明显的横纹和肌小节。②各实验组新生毛细血管密度较对照组都有增加(P < 0.05),其效果顺序由好到差依次为冠脉注射组、心肌注射组和静脉注射组。③经冠脉和静脉移植组非目的器官肺、肝、肾的标本切片内均发现BrdU阳性细胞表达,且静脉移植组肺内BrdU阳性细胞数多于肝、肾,但均未见有分化趋势和恶性细胞表达。结果提示骨髓间充质干细胞经3种方法移植均能使心肌梗死区及其周边区心肌细胞和毛细血管再生,除心肌注射组外非目的器官都有BrdU阳性细胞表达,但仍以目的器官表达为主。     

微血管内皮细胞诱导骨髓间充质干细胞向心肌样分化及其移植的可行性

背景：骨髓间充质干细胞通过再生心肌细胞在心肌损伤性疾病治疗方面突显较大潜力,但目前仍未找到一种理想的诱导方式。 目的：探讨微血管内皮细胞诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的潜能,并分析其移植的可行性。 设计、时间及地点：细胞学体外观察及体内移植实验,于2008-07/2009-02在重庆市神经病学重点实验室完成。 材料：清洁级二三月龄健康雄性SD大鼠16只,购自重庆医科大学实验动物中心 方法：孔径0.4 µm的transwell小室,置入培养板孔构成双室培养体系。取SD大鼠1只,Ficoll密度梯度+贴壁筛选法分离培养骨髓间充质干细胞,组织块法分离培养微血管内皮细胞。培养瓶中融合至50%生长良好的微血管内皮细胞,每3 d更换培养液,收集更换液过滤即制成条件培养液。体外实验分为4组：直接接触组、双室培养组、条件培养液组、培养液对照组,观察各种培养条件对骨髓间充质干细胞的心肌诱导效应。取SD大鼠15只建立心肌梗死模型,冠状动脉结扎后第6天任取1只大鼠明确心肌梗死建模是否成功,其余大鼠随机分为细胞移植组8只、模型对照组6只。造模1周后,细胞移植组将在双室模型中与微血管内皮细胞共培养5 d的骨髓间充质干细胞调整浓度为109 L-1,通过鼠尾静脉缓慢注入1 mL,模型对照组予等量DMEM,观察4周。 主要观察指标：体外实验通过免疫荧光染色检测心肌标志物TnI、α-actin的表达;采用心电图、荧光镜检、苏木精-伊红染色等方式评价体内移植的安全性及可行性。 结果：直接接触组、双室培养组、条件培养液组部分骨髓间充质干细胞心肌标志物TnI、α-actin阳性表达,荧光镜下胞浆发绿光(或红光),前2组诱导率基本相似(P > 0.05),且均明显高于条件培养液组(P < 0.05);培养液对照组细胞未向心肌样细胞分化。细胞移植后两组大鼠均存活良好,未出现死亡及恶性心律失常,4周后细胞移植组心脏冰冻切片荧光镜检显示心肌内有少量胞核蓝染的细胞,提示干细胞成功归巢,结合苏木精-伊红染色,归巢细胞位于心肌梗死灶周边区域,呈单个或小团聚集;而模型对照组心肌切片未见胞核蓝染的细胞。 结论：微血管内皮细胞能够通过旁分泌途径诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化,经微血管内皮细胞预处理过的骨髓间充质干细胞移植入大鼠体内是安全的,可成功归巢到大鼠心肌梗死灶及周边区。     

高压氧联合骨髓间充质干细胞移植修复缺氧缺血性脑损伤

背景：单纯骨髓间充质干细胞移植对脑梗死组织的修复作用并不理想,需要结合药物及生物工程材料等手段进行综合治疗。 目的：验证高压氧结合骨髓间充质干细胞移植修复大鼠缺氧缺血性脑损伤的效果。 方法：体外培养大鼠骨髓间充质干细胞。应用线栓法建立大脑中动脉阻塞大鼠模型,按随机区组法分为3组,即对照组、骨髓间充质干细胞移植组及高压氧+骨髓间充质干细胞移植组。静脉移植后24 h,3 d及伤后1,2 周行Longa行为学评分,检测神经功能的损伤情况。移植2周后,应用RT-PCR法测定生长相关蛋白43 mRNA的表达,并以BrdU免疫组化和苏木精-伊红染色行梗死处组织学检查以证实恢复程度。 结果与结论：移植后1周,高压氧+骨髓间充质干细胞移植组大鼠神经功能障碍评分低于骨髓间充质干细胞移植组,骨髓间充质干细胞移植组低于对照组(P < 0.05)。2周后脑梗死周围组织生长相关蛋白43 mRNA的表达高压氧+骨髓间充质干细胞移植组高于骨髓间充质干细胞移植组,骨髓间充质干细胞移植组高于对照组(P < 0.05)。BrdU免疫组化和苏木精-伊红切片中的神经元数量高压氧+骨髓间充质干细胞移植组多于骨髓间充质干细胞移植组,骨髓间充质干细胞移植组多于对照组(P < 0.05)。提示高压氧联合骨髓间充质干细胞静脉移植治疗大鼠缺氧缺血性脑损伤可明显改善大鼠的神经功能,效果优于单纯骨髓间充质干细胞移植。     

兔自体骨髓间充质干细胞移植联合激光心肌血运重建治疗急性心肌缺血

背景：应用骨髓间充质干细胞移植修复坏死心肌，改善心脏功能已受到广泛关注。最近有报道指出激光具有促进骨髓间充质干细胞治疗心肌缺血的作用。 目的：观察兔自体骨髓间充质干细胞移植联合激光心肌血运重建治疗急性心肌缺血的效果。 设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2006-01/07在安贞医院外科实验室完成。 材料：成年雄性新西兰大白兔32只，随机分为4组：模型对照组、细胞移植组、激光组、联合组，8只/组。 方法：造模前3 d，经兔双侧胫骨穿刺抽取骨髓，经密度梯度离心和换液法分离纯化骨髓间充质干细胞，并行BrdU标记。各组兔均在全麻下结扎冠状动脉前降支建立急性心肌缺血模型，2周后，模型对照组在标记部位分3点注射0.6 mL α-MEM培养基；细胞移植组同法注射等量第4代骨髓间充质干细胞悬液，细胞总数约3×106个；激光组应用高功率CO2治疗仪进行激光心肌打孔3个，功率为5 J；联合组在标记点先行激光打孔，再在孔道周围心肌中层注射等量细胞悬液。 主要观察指标：治疗4周后取出心脏，采用抗BrdU及抗肌钙蛋白T双重免疫组化染色检测骨髓间充质干细胞在梗死区心肌存活及分化情况，采用抗CD146免疫组化染色测定毛细血管密度，通过超声测定左室射血分数，通过计算心尖部位位移趋势及运动速度(应变)评价心肌阶段运动功能。 结果：细胞移植组、联合组均检出岛状分布的双染阳性细胞，胞核呈黑色、胞浆呈棕色。与模型对照组比较，细胞移植组、激光组、联合组治疗区血管密度均显著增加(P均< 0.05)，且联合组增加幅度明显高于细胞移植组、激光组(P均< 0.05)，细胞移植组、激光组血管密度基本相似。与治疗前比较，治疗后4周细胞移植组、联合组左室射血分数、心尖段位移和应变值均明显改善(P < 0.05)，且与模型对照组、激光组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。 结论：兔自体骨髓间充质干细胞可在心肌微环境内存活并分化为心肌样细胞，移植后联合激光心肌血运重建在增加心肌毛细血管密度方面优于单纯细胞移植或激光心肌血运重建治疗，在提高心脏功能方面的优势尚需进一步分析。     

同种异体骨髓间充质干细胞穴位移植：急性心肌梗死后血管新生及相关细胞因子的变化*☆

背景：骨髓间充质干细胞移植途径主要包括外周静脉注射移植、冠状动脉移植以及心肌内注射移植,但存在迁移缺少靶向性,价格高昂等局限性。 目的：观察同种异体骨髓间充质干细胞穴位移植兔急性心肌梗死后梗死区血管新生及相关细胞因子的变化。 方法：提取兔骨髓进行骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化、扩增、鉴定,并标记。将55只兔随机分为正常组与手术组。手术组急性心肌梗死后1周,再随机分为3组：穴位注射干细胞组、模型对照组、穴位注射生理盐水组。5周后,取心肌组织进行免疫组织化学BrdU染色、心肌特异性肌钙蛋白T免疫组织化学染色检测;免疫组织化学法检测梗死心肌组织血小板内皮细胞黏附因子1水平;免疫组织化学法、夹心酶联免疫法、RT-PCR法、Western-Blot法检测血管内皮细胞生长因子及免疫组织化学法检测碱性成纤维细胞生长因子。 结果与结论：穴位注射的骨髓间充质干细胞可迁移至梗死区,并可以在梗死区分化为心肌样细胞。与模型对照组及穴位注射生理盐水组比较,穴位注射骨髓间充质干细胞可使梗死区及周围组织血小板内皮细胞黏附因子1表达上调,诱导梗死区及周围组织血管新生,其机制是刺激心肌组织中碱性成纤维细胞生长因子表达上调。穴位注射骨髓间充质干细胞组梗死心肌组织中和血清中血管内皮细胞生长因子表达均无上调趋势,因此推测,血管新生由碱性成纤维细胞生长因子及未知因素诱导。     

养心通脉有效部位方与急性心肌梗死大鼠骨髓间充质干细胞的动员及定向归巢

背景：急性梗死心肌修复过程中,寻找可有效提高外周血骨髓间充质干细胞的数量、并动员其定向归巢于损伤心肌的骨髓间充质干细胞动员剂尤为关键。 目的：探讨养心通脉有效部位方对急性心肌梗死大鼠骨髓间充质干细胞动员入血及定向归巢于梗死心肌的影响。 方法：养心通脉有效部位方主要成分包括人参皂苷、丹参酮ⅡA、总生物碱、人参多糖等,由中南大学药学院依课题组稳定的制作工艺制作提供。SD大鼠70只,取8只大鼠作为正常对照组,剩余62只大鼠建立急性心肌梗死模型。取造模成功的32只大鼠,随机分为养心通脉有效部位方组、复方丹参注射液组、重组人粒细胞集落刺激因子组、模型对照组,各组均于造模3 h后给与对应药物,连续5 d。流式细胞仪检测外周血CD34+细胞数,免疫组化染色检测梗死心肌边缘区CD34+细胞数。 结果与结论：与模型对照组比较,重组人粒细胞集落刺激因子组、养心通脉有效部位方组外周血CD34+细胞数均明显增加(P < 0.01);心肌梗死边缘区胞浆CD34+细胞数均显著增加(P < 0.01)。与重组人粒细胞集落刺激因子组比较,养心通脉有效部位方组心肌梗死边缘区胞浆CD34+细胞数显著增加(P < 0.01)。养心通脉有效部位方能促进骨髓干细胞动员入血,并定向归巢于梗死心肌,其作用与重组人粒细胞集落刺激因子大体相当,在归巢CD34+细胞方面甚至强于重组人粒细胞集落刺激因子,是一种良好的骨髓间充质干细胞动员剂。     

骨髓间充质干细胞移植在大鼠急性肝损伤组织中的定植能力

背景：目前对于移植后的骨髓间充质干细胞在肝组织中的分化途径以及能够在多大程度上修复损伤的肝细胞等问题,尚未达成统一共识。 目的：观察经尾静脉移植的骨髓间充质干细胞在急性肝损伤大鼠肝组织中的定植分化情况。 设计、时间及地点：细胞学体内对照观察,于2007-12/2008-06在兰州大学中心实验室地点完成。 材料：清洁级6~8周龄雄性SD大鼠47只,取5只用于制备骨髓间充质干细胞,剩余42只随机分为3组：肝正常细胞移植组15只、肝损伤细胞移植组14只、肝损伤盐水对照组13只。 方法：肝损伤细胞移植组、肝损伤盐水对照组大鼠通过腹腔注射D-氨基半乳糖建立急性肝损伤模型。造模后24 h,肝损伤细胞移植组、肝正常细胞移植组经尾静脉注入BrdU标记的第3代大鼠骨髓间充质干细胞悬液1 mL,含(1.5~2.0)×106个细胞;肝损伤盐水对照组大鼠同法注入等量生理盐水。 主要观察指标：移植后肝功能恢复情况,肝脏免疫组织化学检测结果。 结果：与造模后24 h比较,移植后2,3周肝正常细胞移植组、肝损伤盐水对照组血清谷丙转氨酶活性无明显变化（P > 0.05）;肝损伤细胞移植组血清谷丙转氨酶活性明显降低(P < 0.05),肝功能恢复较好。与肝正常细胞移植组比较,肝损伤细胞移植组Brdu+细胞数明显增多(P < 0.01),多分布在汇管区及中央静脉周围,但随着时间延长BrdU+细胞数逐渐减少。 结论：经尾静脉移植的骨髓间充质干细胞可促进急性肝损伤大鼠的肝功能恢复,并能够在受损肝脏及正常肝脏中定植分化,且定植与分化的程度可能与肝脏损伤程度有关。     

骨髓间充质干细胞在IgA肾病大鼠肾脏中的定位与分布

背景：由于骨髓间充质干细胞缺乏特异性表面抗原,常根据其贴壁生长、成骨成脂分化等生物学特点来鉴定。 目的：观察骨髓间充质干细胞在IgA肾病大鼠肾脏中的定位与分布情况。 方法：以牛血清白蛋白+葡萄球菌肠毒素B+皮下注射四氯化碳的改良法建立SD大鼠IgA肾病模型。造模成功分别经尾静脉移植大鼠骨髓间充质干细胞或生理盐水,并设立不造模的正常对照组。移植后1,4周观察各组大鼠的尿蛋白、肾功能、肾脏病理变化、IgA荧光沉积变化,并通过免疫组织化学观察BrdU标记的骨髓间充质干细胞在肾组织中的分布情况。 结果与结论：移植后1周,骨髓间充质干细胞组尿蛋白、血肌酐明显低于生理盐水组;移植后4周,骨髓间充质干细胞组肾脏病理变化、IgA荧光沉积与生理盐水组比较差异有显著性意义。提示骨髓间充质干细胞输注可促进大鼠IgA肾病的修复,并可定位于肾小球系膜区及少数肾小管间质区,但随时间延长,BrdU标记的髓间充质干细胞在肾组织中分布却逐渐减少。     

骨髓间充质干细胞旁分泌作用与脑缺血后的细胞凋亡*

背景：骨髓间充质干细胞移植治疗脑缺血的机制之一是骨髓间充质干细胞的旁分泌作用,而目前对于这一机制的研究报道较少。 目的：观察骨髓间充质干细胞旁分泌作用对脑缺血后细胞凋亡的抑制作用并探索相关机制。 方法：体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,建立大鼠大脑中动脉缺血模型。24只SD大鼠随机数字表法分为4组,每组6只。细胞移植给药组：大鼠纹状体内移植骨髓间充质干细胞后给予ERK1/2抑制剂U0126;非移植给药组：注射等量的PBS后给予U0126;细胞移植对照组：移植骨髓间充质干细胞后给予溶剂对照;非移植对照组：注射等量的PBS后给予溶剂对照。7 d后通过Western blot检测血管内皮细胞生长因子、磷酸化ERK1/2蛋白的表达;TUNEL染色检测梗死区周围及皮质区细胞凋亡情况。 结果与结论：细胞移植组较非移植组大鼠纹状体内血管内皮细胞生长因子蛋白的表达明显增高,磷酸化ERK1/2表达增强,细胞凋亡数明显减少;经U0126处理后,血管内皮细胞生长因子的表达没有变化,而随着磷酸化ERK1/2的表达受到抑制,细胞凋亡数明显增高。提示骨髓间充质干细胞在大脑纹状体内可以旁分泌血管内皮细胞生长因子,并通过激活ERK1/2抑制了脑梗死区细胞的凋亡。     

骨髓间充质干细胞立体定向移植治疗大鼠脊髓损伤*

摘要 背景：传统观念认为,神经组织损伤后几乎不能再生,以往对SCI的治疗缺乏有效手段,致使本病致残率高,疗效差。干细胞治疗关键在于移植具有再生能力的干细胞,通过多种作用机制,可以重建中枢神经系统的结构和功能,近年来引起了广泛的关注。 目的：探讨立体定向移植骨髓间充质干细胞（MSCs）对大鼠脊髓损伤修复的影响并探讨其机制 设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2007-10/2008-6在天津市环湖医院完成。 材料：1月龄SD大鼠20只,用于制备骨髓间充质干细胞;健康成年Wistar大鼠45只,雌性、同系,体质量280±20 g。将动物随机分为对照组、假手术组与移植组,每组各15只。 方法：密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离骨髓间充质干细胞,经流式细胞仪鉴定为MSCs。以动脉瘤夹夹闭法制备大鼠脊髓损伤（SCI）模型,在SCI大鼠致伤后第7天,通过立体定向途径移植MSCs到移植组大鼠脊髓损伤中心,移植等量生理盐水至假手术组大鼠脊髓损伤中心,对照组大鼠不做处理。 主要观察指标：SCI大鼠损伤前及损伤后第7天、14天、30天、60天、90天的BBB评分;损伤后第90天处死大鼠,观察其脊髓组织中有无BrdU阳性细胞、Brdu+NSE、Brdu+GFAP、Brdu+bFGF、Brdu+BDNF免疫组化双染阳性细胞并观察NSE、GFAP、bFGF、BDNF单染阳性细胞。 结果： ①BBB评分发现,MSCs移植组大鼠BBB后肢功能评分恢复优于对照组（p<0.05）;假手术组BBB评分在损伤后30天内恢复速度慢于对照组（p<0.05）,至第90天与对照组比较无显著差异（P>0.05）;②免疫组织化学染色发现,移植组大鼠脊髓内在损伤中心及头、尾端距离脊髓损伤中心1cm处均可见BrdU染色阳性细胞及Brdu+NSE、Brdu+GFAP、Brdu+bFGF、Brdu+BDNF免疫组化双染阳性细胞。移植组NSE、GFAP、bFGF、BDNF单染阳性细胞数明显高于对照组和假手术组（p<0.05）。 结论： MSCs移植可以促进SCI大鼠的神经功能的恢复,其机制可能与移植细胞分化为神经元样和神经胶质细胞样细胞,并分泌或促进宿主分泌神经营养因子有关。 关键词 脊髓损伤 骨髓间充质干细胞 立体定向 细胞移植     

Therapeutic effects of differentiated bone marrow stromal cell transplantation on rat models of Parkinson's disease

This study was to explore curative effect of bone marrow stromal cells (BMSCs) differentiated into nestin-positive cells transplantation on rat Parkinson's disease (PD) model. The PD rats were selected and allocated randomly into three groups. BMSCs with differentiation, BMSCs without differentiation and physiological saline were injected into right striatum of PD rat. The rotation test and immunofluorescence double staining were done. Frequency of rotation was significantly less in differentiated or non-differentiated BMSCs groups than that in normal saline group. Brdu/GFAP- and Brdu/NSE-positive cells appeared except BrdU/TH-positive cells. BMSCs differentiated had better effect than that of BMSCs without differentiated and physiological saline group.     

造血干细胞与神经生长因子联合移植治疗脑梗死

背景：目前采用外周血造血干细胞移植治疗脑缺血方面的研究还比较少,缺乏大量、系统的实验数据。神经生长因子可调控神经元再生所需的微环境,对神经细胞的存活、增殖起重要作用。 目的：观察造血干细胞移植后,神经生长因子对其在脑梗死大鼠脑内的存活、分化及神经功能的影响。 设计：随机对照动物实验。 材料：清洁级成年雄性SD大鼠120只,随机分为3组：单纯细胞移植组、细胞移植+神经生长因子组、模型对照组,40只/组。神经生长因子为北大之路药业有限公司产品。 方法：大鼠颈部皮下注射重组人粒细胞集落刺激因子后,密度梯度离心法分离培养造血干细胞,移植前行Brdu标记。3组大鼠根据改良Longa线栓法建立大脑中动脉闭塞模型,造模后7 d,大鼠麻醉后暴露前囟,选取注射位点：前囟后方1.2 mm,中线向右旁开3 mm,硬膜下4 mm。单纯细胞移植组缓慢注入1×106个造血干细胞,细胞移植+神经生长因子组注入1×106个造血干细胞+200 ng神经生长因子,模型对照组给予等量磷酸盐缓冲液。 主要观察指标：采用神经功能缺损评分检测神经功能的改善情况,免疫组化染色观察梗死半球Brdu/CD34、Brdu/Nestin、Brdu/NSE、Brdu/vWF双阳性细胞的分布,TCC染色观察梗死体积的变化。 结果：与移植前比较,移植后1,2周仅细胞移植+神经生长因子组神经功能缺损评分均明显下降(P < 0.05),移植后3,4周各组神经功能缺损评分均明显下降(P < 0.05或0.01),且细胞移植+神经生长因子组下降幅度尤为显著(P < 0.01)。移植后1周,细胞移植+神经生长因子组Brdu/CD34、Brdu/Nestin、Brdu/NSE、Brdu/vWF双阳性细胞数明显多于单纯细胞移植组(P < 0.01);第4周两组未见Brdu/CD34双阳性细胞,Brdu/Nestin较1周时减少,Brdu/NSE、Brdu/vWF双阳性细胞均明显增多(P < 0.05),且细胞移植+神经生长因子组明显多于单纯细胞移植组(P < 0.01);模型对照组始终未见Brdu双阳性细胞。 结论：神经生长因子对外源性移植的造血干细胞在局灶性脑梗死大鼠脑内存活、分化以及神经功能的恢复具有明显促进作用。     

骨髓间质干细胞移植减轻犬急性脑梗死模型的缺血性脑损伤研究

目的观察骨髓间质干细胞(BMSCs)对犬急性缺血脑组织的保护作用,并探讨其可能的机制。方法将24只成年杂交犬随机分为治疗组及对照组,DSA引导下行自体血栓栓塞大脑中动脉闭塞缺血模型制作,并抽取骨髓提取BMSCs,传代并给予4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)标记;1周后开颅行多点脑内注射BMSCs移植;移植后1周行脑DWI序列扫描,计算梗死灶体积;4周后将犬处死,每组随机选择6只动物取脑标本行TTC染色测定梗死灶体积;另外6只动物进行HE染色、VG染色、TUNEL染色评价脑损伤情况;免疫荧光染色了解脑源性神经营养因子(BDNF)、碱性成纤维生长因子(b FGF)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)和血管内皮生长因子(VEGF)的表达情况。结果治疗组梗死灶内广泛存在DAPI阳性细胞。治疗组的梗死灶体积明显小于对照组,P0.01。治疗组梗死灶范围、梗死灶内细胞坏死、胶质增生和胶质瘢痕均较对照组减轻。治疗组凋亡细胞明显少于对照组,P0.05。治疗组细胞因子BDNF、BFGF、IGF-1和VEGF表达阳性的细胞均显著多于对照组。结论脑梗死后给予BMSCs移植,BMSCs能存活并自行向梗死灶迁移,并发挥脑保护作用,其机制可能和分泌多种神经营养因子有关。     

骨髓间充质干细胞在心肌梗死犬心肌内分化及对心肌细胞凋亡的影响

背景：体内移植骨髓间充质干细胞对实验动物的心肌梗死和心力衰竭有较好的改善作用，但具体机制尚不清楚。 目的：观察骨髓间充质干细胞在心肌梗死犬梗死区的分化以及对心肌细胞凋亡的影响。 设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2005-03/2007-12在美国Texas Heart Institute干细胞研究室进行骨髓间充质干细胞移植，在第三军医大学完成免疫组织化学染色。 材料：成年杂种犬，平均体质量25~35 kg。 方法：采用密度梯度离心法提取犬骨髓间充质干细胞，移植前以BrdU标记骨髓间充质干细胞。采用外科手术于近端冠状动脉左前降支植入布洛芬缩肌装置并结扎相连分支的方法制作犬心肌梗死模型。造模后分为实验组与对照组，实验组于损伤缺血部位注射同种异体骨髓间充质干细胞。对照组注射等量生理盐水。 主要观察指标：对移植BrdU标记的骨髓间充质干细胞的心肌梗死犬心肌梗死区组织细胞进行免疫组织化学染色，同时采用DeadEndTM Colorimetric TUNEL System对心梗标本进行凋亡细胞的染色观察。 结果： 注射骨髓间充质干细胞的心脏组织切片BrdU免疫组织化学染色可见大量细胞核呈现深褐色或黑色的阳性反应，在心脏组织的不同区域表现出不同的形态特征，其中大多数植入心肌细胞间的骨髓间充质干细胞，形态上与心肌细胞无异，而其他区域的骨髓间充质干细胞则与间质细胞较相似，无特定的形状。骨髓间充质干细胞移植组心肌梗死区凋亡的心肌细胞数少于未移植组。 结论：骨髓间充质干细胞心肌内移植后可在心肌梗死区分化成心肌细胞，并减轻犬心肌梗死后的细胞凋亡。     

胎鼠神经干细胞移植对大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡及凋亡抑制基因Bcl-2表达的影响

目的研究胎鼠神经干细胞(NSCs)移植对大鼠脊髓损伤(SCI)后神经细胞凋亡及凋亡抑制基因Bcl-2表达的影响。方法 40只SD大鼠随机分为正常对照组(Normal组),脊髓损伤组(SCI组),神经干细胞组(NSC组),神经干细胞标记组(BrdU+NSCs组)。采用电控脊髓损伤打击装置制作模型,5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Br-dU)法标记处于对数生长期的NSCs,SCI后即刻进行NSCs移植。免疫组化法观察BrdU标记NSCs的存活、迁移及凋亡抑制基因Bcl-2的表达,TUNEL法标记凋亡细胞(免疫组化及免疫荧光显色),改良Rivlin法观察大鼠后肢运动功能的恢复情况。结果 BrdU+NSCs组在损伤脊髓区域可检测到BrdU标记的阳性NSCs。BrdU+NSC组与NSC组各时间点凋亡阳性细胞数均比SCI组减少(P<0.01),Bcl-2免疫阳性细胞光密度值比SCI组明显增加(P<0.01),且Bcl-2表达高峰延长至伤后7d;移植后7d、14d、28d后肢运动功能评分较SCI组明显升高(P<0.01)。Br-dU+NSC组与NSC组之间比较无明显差异(P>0.05)。结论体外培养的胚胎大鼠NSCs可在脊髓损伤区域存活、迁移,并能通过上调Bcl-2的表达来抑制大鼠脊髓损伤后神经细胞的凋亡,从而促进大鼠瘫痪肢体功能的恢复。     

电针联合骨髓基质细胞移植对脊髓损伤大鼠神经功能恢复的影响

背景：研究认为骨髓基质细胞在损伤、缺血的脑脊髓组织中定向神经分化与损伤局部的微环境变化有关,特别是神经营养因子的诱导作用。课题组前期实验已证实,针刺可以通过增加各种细胞因子及营养因子的表达,促进神经的再生及修复。 目的：观察电针联合骨髓基质细胞移植对脊髓损伤大鼠神经功能恢复的影响。 设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2005-03/2006-07在哈尔滨医科大学细胞生物实验室完成。 材料：健康纯系SD大鼠80只,取8只用于骨髓基质细胞的分离培养,剩余72只随机分为4组：空白对照组、细胞移植组、电针组、联合组,18只/组。KWD-808II型脉冲电针仪由江苏武进第三无线电厂生产。 方法：取体外分离培养的第3代骨髓基质细胞,移植前72 h行BrdU标记,调整细胞浓度为1×1011 L-1备用。4组大鼠均建立脊髓损伤模型,造模后细胞移植组将骨髓基质细胞悬液缓慢注入到脊髓损伤临近区域的灰白质交界处,总细胞数6×105个;空白对照组同法注射等量磷酸盐缓冲液;电针组于造模成功后24 h采用脉冲电针仪进行夹脊电针治疗,在距损伤处上下端两个椎体的棘突间隙旁开距中线3.0~4.0 mm处取穴,针刺20 min,1次/d;联合组行骨髓基质细胞移植+夹脊电针治疗。 主要观察指标：移植后 3,7,14 d,应用联合行为评分评估大鼠脊髓损伤后神经功能的改善状况;免疫双标法检测BrdU标记的骨髓基质细胞胶质纤维酸性蛋白、神经元烯醇化酶的表达。 结果：损伤后3,7,14 d与空白对照组比较,细胞移植组、电针组、联合组联合行为评分均有显著性差异(P < 0.05,0.05,0.01);联合组神经功能恢复情况明显优于细胞移植组、电针组(P < 0.05);而细胞移植组、电针组之间比较无明显差异(P > 0.05)。与空白对照组相比,细胞移植组、电针组损伤区脊髓结构相对较完整,联合组脊髓结构更加完整,骨髓基质细胞移植的组织内可见 BrdU标记细胞在损伤区及其周边区明显聚集并存活;移植后14 d细胞移植组神经元烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞率分别分7.2%和1.5%,联合组阳性细胞率分别为7.9%和2.1%。 结论：骨髓基质细胞移植后可在宿主体内存活,电针可以促进骨髓基质细胞向神经细胞的分化,电针与骨髓基质细胞移植联合应用可以明显改善脊髓损伤大鼠的运动及感觉功能。     

骨髓间充质干细胞移植对大鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护作用

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对大鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护作用,并探讨其可能的机制。方法经体外培养并纯化BMSCs,移植前以10 mg/L的BrdU进行标记。线栓法制作大鼠MCAO模型,随机分为移植A组、B组及对照C组。在模型建立后7 d,通过尾静脉分别将3×10~6个BMSCs、1×10~6个BMSCs移植入A、B组大鼠体内,C组不作处理。于移植前、后分别进行改良神经损伤严重程度评分(mNSS)及Morris水迷宫测试,并取大鼠脑组织行免疫组织化学染色。结果移植A组与移植B组、C组比较,行为学恢复更为明显,(P0.01);B、C两组相比无显著性差异(P0.05);移植A组大鼠学习和记忆能力较C组明显改善(P0.05)。A、B组大鼠在脑损伤中心及周围区,可见Brdu单染阳性细胞及Brdu+MAP-2、Brdu+GFAP、Brdu+vWF、Brdu+VEGF双染阳性细胞。结论 BMSCs经尾静脉移植至MCAO大鼠体内后,可在大鼠体内存活、分化,并促进大鼠伸进功能恢复。疗效与移植细胞数量相关。