家蝇幼虫天蚕素基因的克隆与序列分析

目的对家蝇幼虫天蚕素基因进行克隆和序列分析。方法根据Genbank公布的家蝇成虫天蚕素Cecropin基因序列设计一对引物，以家蝇幼虫cDNA库液为模板，PCR扩增该基因的编码区序列。结果家蝇幼虫天蚕素cDNA目的基因的长度为229bp，与成虫防御素基因一致性为96％；最大的ORF位于20bp～211bp，含192bp。编码63个氨基酸。结论初步预测了该基因编码蛋白的化学性质和二级结构，为该基因的重组表达研究打下基础。     

家蝇幼虫抗菌肽Defensins基因的克隆与序列分析

目的：克隆家蝇幼虫的抗菌肽defensins基因并对其进行序列分析。方法：提取家蝇幼虫总RNA，根据家蝇成虫defensins基因cDNA序列设计一对引物，RT-PCR扩增目的基因片段，T-A克隆后测序，应用相关生物信息学软件对该序列进行分析。结果：RT—PCR扩增出一条约310bp的目的片段，序列分析表明，其与家蝇成虫防御素基因同源性高达97％，核酸序列变异主要发生在信号肽区域。结论：成功克隆及分析了家蝇幼虫防御素基因全长编码区cDNA序列，为其下一步的重组表达和生物活性研究奠定了基础。     

蚊防御素基因的克隆及序列分析

目的：克隆是我国重要蚊媒的防御素基因并对其序列进行分析。方法：分别提取埃及伊蚊、白纹伊蚊、致乏库蚊、中华按蚊的基因组DNA和总RNA。根据国外已发表的防御素基因序列设计、合成引物，进行PCR 和RT－PCR。结果：分别从埃及伊蚊、白纹伊蚊、中华按蚊基因组DNA中扩增出预期片段，将片段切胶纯化后进行序列分析并与已发表的防御素基因比较，显示埃及伊蚊和白纹伊纹的扩增片段与已发表的防御素基因序列有很高的同源性，而中华按蚊的拉增片段则与已发表的防御素基因序列的同源性较低，且不具备特征性的6个半胱氨酸序列。结论：克隆出运行及伊蚊和白纹伊蚊的防御素基因，蚊虫防御素基因的同源性高低与其遗传分类距离有一定的平行关系。     

蚊防御素基因的克隆及序列分析

目的克隆我国重要蚊媒的防御素基因并对其序列进行分析。方法分别提取埃及伊蚊、白纹伊蚊、致乏库蚊、中华按蚊的基因组DNA和总RNA。根据国外已发表的防御素基因序列设计、合成引物,进行PCR和RT-PCR。结果分别从埃及伊蚊、白纹伊蚊、中华按蚊基因组DNA中扩增出预期片段,将片段切胶纯化后进行序列分析并与已发表的防御素基因比较,显示埃及伊蚊和白纹伊蚊的扩增片段与已发表的防御素基因序列有很高的同源性,而中华按蚊的扩增片段则与已发表的防御素基因序列的同源性较低,且不具备特征性的6 个半胱氨酸序列。结论克隆出埃及伊蚊和白纹伊蚊的防御素基因,蚊虫防御素基因的同源性高低与其遗传分类距离有一定的平行关系。     

致倦库蚊防御素基因的克隆与生物信息学分析

目的:获取致倦库蚊(贵阳株)防御素基因CxDefensin全长编码序列.方法:采用RT-PCR方法扩增致倦库蚊(贵阳株)CxDefensin开放阅读框(ORF)序列,并通过生物信息学方法分析其核苷酸和蛋白质序列.结果:CxDefensin ORF序列全长300 bp,编码99个氨基酸,包含1个内含子,蛋白质分子量是10.58 kDa,等电点为6.52.CxDefensi蛋白与其他昆虫的defensin蛋白具有同源性.结论:所获致倦库蚊(贵阳株)防御素基因CxDefensin归属昆虫防御素基因家族,为昆虫β型防御素.     

家蝇幼虫Defensin成熟蛋白序列的克隆及在原核中的表达

目的 克隆家蝇幼虫defensin成熟蛋白编码序列并在大肠杆菌中表达，为进一步的研究该基因的功能奠定基础。方法 以家蝇幼虫cDNA文库为模板扩增出defensin基因的成熟蛋白全长编码序列，构建重组原核表达载体pGEX／MDEF，转化的克隆(质粒)通过筛选并测序鉴定。重组的pGEX／MDEF在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，SDS-PAGE鉴定其表达情况和分子质量并用抗鼠GST单抗作western blot杂交进一步鉴定融合蛋白的表达。结果 以家蝇幼虫cDNA文库扩增出一条长约为140bp的cDNA片段，经测序证实其为defensin基因成熟蛋白的编码序列，它编码含40个氨基酸的蛋白质，预测其分子质量单位为4kD。被成功克隆入pGEX-4T-1载体的家蝇幼虫defensin基因的cDNA，在重组大肠杆菌BL21(DE3)中诱导可大量生成相对分子质量30KD融合蛋白。结论 成功构建了家蝇幼虫defensin基因原核表达载体，且其成熟蛋白的编码序列在大肠杆菌高效表达。为下一步表达蛋白纯化，以及研究其生物活性提供了材料。     

人小肠粘膜防御素-5 cDNA的克隆与序列分析

小肠粘膜Paneth细胞合成、分泌的天然抗菌物质防御素-5(HD-5)，因具有独特的杀菌／抑菌作用而颇受国内外学者关注。我们采用RT-PCR方法，从人回肠粘膜中获得了HD-5编码序列HD-5cDNA，并进行了克隆和测序分析，为重组防御素5(rHD-5)的高效表达奠定了基础。     

长爪沙鼠β-防御素基因的克隆与鉴定

目的 克隆长瓜沙鼠β-防御素基因序列,并对其进行鉴定及分析.方法 从长爪沙鼠小肠中提取总RNA,根据GenBank中大、小鼠的β-防御素的基因序列,通过防御素基因的保守性设计引物,采用RT-PCR技术得到预期的PCR产物,将所得的片段进行克隆、测序,并应用相关生物信息学软件对序列进行鉴定和分析,序列提交genbank.结果 Blast比较发现,最终测序的结果与小鼠β-防御素-1和大鼠β-防御素-1的同源性均都大于78%,genbank登录号为EU784838.结论 经测序鉴定证实该PCR产物为长爪沙鼠β-防御素基因1的一部分,且与大、小鼠的相应基因高度同源.     

人类防御素基因cDNA片段的克隆

为了获得一种具有生物学活性的小分子多肽基因cDNA，作者采用RT－PCR方法，从慢性粒细胞白血病患者的外周血细胞总RNA中扩增得到长度约为280bp的防御素（Defensin）基因cDNA片段，并将该扩增产物克隆到pUCm-T载体中，为筛选一种更高效的融合杀菌肽基因奠定基础。     

人β-防御素-3基因的克隆和序列测定

目的 克隆人β-防御素－3的基因。方法 提取人皮肤组织的总RNA，反转录为cDNA作为模板，采用PCR的方法克隆人β－防御素－3基因。PCR产物连接入pGEM-T-EASY载体，转化DH－5α受感态细胞，蓝白筛选，对酶切及PCR鉴定含有目的片段的克隆进行测序。结果 获得预期大小的PCR产物，经序列鉴定证实为人β－防御素－3基因。结经 获得了人β-防御素－3基因。     

大劣按蚊感染约氏疟原虫defensins基因的克隆及生物信息学分析

目的为探讨大劣按蚊对约氏疟原虫侵入的免疫反应,克隆大劣按蚊的抗菌肽defensins基因并对基因序列进行生物信息学分析。方法分别提取感染疟原虫的大劣按蚊的蚊胃总RNA,根据冈比亚按蚊defensins基因设计、合成简并引物,进行RT-PCR扩增目的片段,TA克隆后测序并进行序列分析。结果用简并引物的RT-PCR扩增出约氏疟原虫感染的大劣按蚊的189bp目的片段,序列分析表明与冈比亚按蚊defensins有87%同源性,与白蚊伊蚊defensinsD有88%同源性,为大劣按蚊的defensins基因。结论成功克隆并分析了大劣按蚊抗菌肽defensins基因,为进一步的重组表达和研究按蚊抗菌肽的生物活性奠定基础。     

家蝇黏蛋白mucin-46基因的序列分析

目的：分析和预测家蝇黏蛋白mucin-46基因及其编码蛋白的结构和特性.方法：利用EST测序技术从家蝇幼虫cDNA文库中获得家蝇黏蛋白mucin-46基因cDNA序列,采用美国国家生物技术信息中心（NCBI）、瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统（Expasy）中的相关工具,对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、疏水性、信号肽、二级结构和亚细胞定位等方面进行预测和分析.结果：家蝇黏蛋白mucin-46基因的cDNA序列具有完整的开放阅读框（ORF）,全长1 383 bp,编码460个氨基酸;其编码的蛋白质理论分子量为46.42 kDa,等电点4.13;无信号肽及跨膜区,属于亲水性蛋白,具有4个几丁质结合功能域,含有4个糖基化位点及多个蛋白磷酸化作用位点;二级结构β折叠（E）和无规则卷曲（L）的比例是14.13∶85.87,没有α螺旋（H）结构类型;主要分布于细胞核.结论：应用生物信息学方法从家蝇cDNA文库中筛选出了家蝇黏蛋白mucin-46基因序列并预测了其结构及功能等生物学信息,为进一步研究家蝇围食膜蛋白的功能奠定了一定的基础.     

家蝇幼虫组织匀浆液抗病毒活性的研究

目的 探索家蝇组织匀浆液的抗病毒作用。方法 用鸡胚法检测经针刺或冷冻免疫诱导及同期对照家蝇幼虫组织匀浆液的抗病毒活性。结果 家蝇幼虫组织匀浆液中有抗病毒活性物质存在，针刺或冷冻组抗病毒物质的活性高于同期对照组。结论 家蝇幼虫组织匀浆液中抗病毒活性物质的性质尚待进一步确定。研究结果为抗病毒药物的寻找开辟了新的路径。     

间日疟原虫部分乳酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

目的克隆并测定我国间日疟原虫乳酸脱氢酶(PvLDH)的部分基因序列并进行生物信息学分析。方法根据PvLDH基因已知序列设计合成一对引物,应用PCR技术从间日疟原虫基因组DNA中扩增LDH基因,定向克隆入pMD18质粒。阳性质粒经酶切及PCR鉴定后,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定。应用生物信息学网站www.ncbi.nlm.nih.gov、www.expasy.ch对获得的基因及其推导的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果PCR扩增得到特异的间日疟原虫LDH基因序列。酶切及PCR鉴定获得了正确的重组质粒。测序结果表明,获得的间日疟原虫LDH基因全长897bp,编码299个氨基酸。DNAMAN预测PvLDH存在10个潜在抗原表位,均与PfLDH的相应预测表位间有同源序列。同源性分析显示,我国间日疟原虫与SalvadorⅠ株和Belem株间日疟原虫的氨基酸序列同源性为99%,与其它疟原虫LDH的同源性为88%～90%。结论成功克隆了我国间日疟原虫LDH基因,其基因序列与其它疟原虫LDH基因序列有高度同源性。     

人CD4分子cDNA的克隆及序列分析

目的：克隆人的CD4基因，为进一步研究病毒感染CD4^ 细胞的分子机制奠定基础。方法：用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出SupT1细胞株的编码CD4蛋白分子全长的基因，克隆至质粒pAS2—1中，并转入大肠杆菌DF15α。通过Amp抗性筛选、PCR及限制性内切酶EcoRⅠ，BamH Ⅰ双酶切等鉴定重组质粒并测定其中编码CD4片段的核苷酸序列。结果：克隆出编码CD4蛋白分子全长的cDNA，测序结果与文献报道进行同源比较，序列基本一致。结论：本实验成功克隆了编码人CD4蛋白全长的cDNA片段。     

华支睾吸虫乙醛脱氢酶基因的克隆、表达和序列分析

[目的]通过筛选华支睾吸虫成虫cDNA质粒文库,发现并识别新基因,将发现的新基因编码区克隆到原核表达质粒pGEX-4T-1并表达出融合蛋白.[方法]用文库通用引物对华支睾吸虫cDNA质粒文库进行PCR扩增,对产物为500 bp以上的质粒测序,结果在NCBI和ExPasy网站上进行序列分析,并应用ORFfind、ClustalW、NCBI Conserved Dom ain Search等程序对其进行开放阅读框(ORF)、进化树及结构域分析.根据载体多克隆位点及新基因ORF设计引物,PCR扩增,产物克隆到目的载体上.筛选并鉴定出阳性克隆,对鉴定过的重组体进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳鉴定.[结果]发现CsALDH基因,完整阅读框含1467个碱基,编码489个氨基酸,理论相对分子质量Mr≈52.564×103,理论pI为5.43.序列分析表明,CsALDH基因编码的氨基酸序列与其它物种有较高的同源性,CsALDH与爪蛙属乙醛脱氢酶的同源性为59%,具有乙醛脱氢酶保守功能域.构建的重组原核表达质粒经鉴定与目标基因相符.电泳显示表达产物在Mr≈78×103处有一条特异性条带.[结论]发现华支睾吸虫磷酸甘油醛脱氢酶基因,成功构建重组原核表达质粒并表达出融合蛋白.     

人Hrs cDNA的克隆与序列分析

以小鼠ＨｒｓｃＤＮＡ为探针从人胎盘ｃＤＮＡ文库中克隆出人ＨｒｓｃＤＮＡ，其全长为２９１０ｂｐ，所编码的蛋白质含７７７个氨基酸。人ＨｒｓｃＤＮＡ与小鼠ＨｒｓｃＤＮＡ间高度保守。推定的氨基酸序列含有锌指样结构域、脯氨酸丰富区及脯氨酸、谷氨酰胺丰富区。