乳腺定位表达载体在小鼠乳腺中的活性检测

目的 检测乳腺定位表达载体在动物乳腺中的表达活力。方法与结果 将乳腺定位表达载体乳清酸蛋白－人组织型纤溶酶原激活剂（ＷＡＰ－ｔＰＡ）通过乳腺导管直接注入妊娠后期小鼠的乳腺中,待小鼠产子、泌乳后,检测出小鼠乳汁中ｔＰＡ的表达量为８０ｍｇ／ｍｌ。结论 此方法可作为从动物整体水平上检测乳腺定位表达载体表达效力的一种简便而有效的方法。     

人组织型纤溶酶原激活剂牛乳腺生物反应器的研究

目的 构建组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)乳腺定位表达载体，使其在牛乳汁中高效表达，从而建立牛乳腺生物反应器。方法 RT-TD-PCR法克隆目的基因，通过酶切、连接、分离、纯化等方法构建含t-PA-cDAN的乳腺定位表达载体：采用显微注射法和乳腺注射法将融合基因转入小鼠的受精卵和小鼠及牛的乳腺组织中。结果 显微注射法和乳腺注射法转基因后，t-PA可在小鼠和牛的乳汁中表达。结论 所构建的乳腺定位表达载体可有效地使t-PA基因在小鼠和牛乳汁中表达，t-PA基因的表达不受转基因方法的影响，但t-PA在牛乳汁中的表达量明显高于小鼠的表达量。提示不同动物的乳蛋白调控系统有一定的差异，可能受着不同的因素或调控系统的影响。     

人组织型纤溶酶原激活剂牛乳腺生物反应器的研究

目的 构建组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)乳腺定位表达载体,使其在牛乳汁中高效表达,从而建立牛乳腺生物反应器。方法 RT-TD-PCR法克隆目的基因,通过酶切、连接、分离、纯化等方法构建含t-PA-cDAN的乳腺定位表达载体;采用显微注射法和乳腺注射法将融合基因转入小鼠的受精卵和小鼠及牛的乳腺组织中。结果 显微注射法和乳腺注射法转基因后,t-PA可在小鼠和牛的乳汁中表达。结论 所构建的乳腺定位表达载体可有效地使t-PA基因在小鼠和牛乳汁中表达,t-PA基因的表达不受转基因方法的影响,但t-PA在牛乳汁中的表达量明显高于小鼠的表达量,提示不同动物的乳蛋白调控系统有一定的差异,可能受着不同的因素或调控系统的影响。     

从兔乳汁分离原代乳腺上皮细胞用于乳腺特异性启动子活性检测

目的在含牛α-S1-酪蛋白调控序列的乳腺特异性定位表达载体pCA1基础上，构建乳腺细胞绿色荧光蛋白表达载体pCA1-GFPuv，转染分离培养的兔原代乳腺上皮细胞并检测启动子活性与组织特异性．方法用PCR法获取绿色荧光蛋白基因（即GFPuv基因），将其重组到乳腺特异性定位表达载体pCA1中，构建乳腺细胞特异绿色荧光蛋白表达载体pCA1-GFPuv，直接从兔乳汁中分离兔原代乳腺上皮细胞进行培养，通过脂质体法用pCA1-GFPuv转染乳腺上皮细胞，最后在倒置荧光显微镜下观察荧光表达情况以检测乳腺特异性启动子活性与组织特异性．[第一段]     

小鼠乳腺组织中组织型纤溶酶原激活剂乳腺特异性表达载体的瞬时表达

目的：验证所构建的组织型纤溶酶原激活剂(tPA)乳腺特异性表达载体pWTA能否在小鼠乳腺组织中瞬时表达。方法：采用直接注射法将pWTA DNA、pWTA DNA／脂质转染胺试剂Lipofectamine^TM2000复合物及PBS分别注射入妊娠末期小鼠乳腺组织。应用原位杂交技术,以地高辛标记的tPA cDNA为探针,观察pWTA在小鼠乳腺组织中的瞬时表达。结果：tPA表达阳性细胞散在分布于pWTA DNA及pWTA DNA／Lipofectamine^TM2000复合物注射小鼠部分乳腺腺泡,PBS注射组无阳性细胞。结论：载体pWTA能够在小鼠乳腺组织中特异性表达tPA。     

可用于基因表达研究的转基因小鼠乳腺上皮细胞模型的构建

目的建立转基因小鼠乳腺上皮细胞模型,为研究乳腺内环境因素调控外源基因的表达和制备高效表达外源基因的乳腺生物反应器提供研究平台。方法通过机械破碎和胶原酶消化的方法获取人转铁蛋白(hTF)转基因小鼠的乳腺上皮细胞,并进行体外原代培养。经胰蛋白酶纯化后,绘制乳腺上皮细胞生长曲线;免疫组织化学方法检测角蛋白18的表达;透射电子显微镜(透射电镜)观察乳腺上皮细胞超微结构;流式细胞仪检测细胞周期分布;显微镜下分析乳腺上皮细胞核型。将牛催乳素真核表达载体(pCMV-bPRL)转染至转基因乳腺上皮细胞中,检测外源bPRL的表达。结果乳腺上皮细胞生长曲线呈"S"形;免疫荧光组织化学分析结果显示hTF转基因小鼠乳腺上皮细胞角蛋白18呈阳性表达;透射电镜观察发现乳腺上皮细胞胞核较大、偏位,有双核或多核,胞质丰富,空泡、粗面内质网、高尔基体丰富;流式细胞仪检测结果显示:乳腺上皮细胞增殖活跃,G2/M期+S期细胞占15%;细胞核型分析结果显示处于分裂期的细胞具有正常的二倍体,染色体完整。pCMV-bPRL转染乳腺上皮细胞24 h后,上清液中检测到bPRL的表达。结论体外培养的转基因乳腺上皮细胞具有类似体内细胞的生物学特征,并可表达真核表达载体,为研究环境因素对乳腺功能的影响及制备乳腺生物反应器提供了一种细胞模型。     

哺乳动物乳腺上皮细胞的研究和应用

转基因动物-乳腺生物反应器的研制是近十多年发展起来的一项生物制药方法,具有巨大的应用前景.外源目的基因载体的构建是制备转基因动物-乳腺生物反应器成功的关键技术环节,因此建立简单、快捷检测外源基因载体构建的合理性和表达情况的方法至关重要.由于乳腺上皮细胞能较真实反映哺乳动物乳腺生长发育及泌乳的各项生理功能,开展体外培养哺乳动物乳腺上皮细胞,可作为转基因动物制备过程中载体有效性检验的一种体外模型途径.本文将对哺乳动物乳腺组织的结构和乳腺上皮细胞体外培养的增殖能力、诱导、维持分化的特点,以及乳腺上皮细胞的培养和它在生物、医学领域中的应用研究进行简要概述.     

利用转基因动物乳腺生物反应器生产溶栓药物的研究进展

目前,溶栓试剂主要有七大类,其中,纤溶酶原激活剂（PA）及其突变体是急性心肌梗塞的常规用药,但是由于来源有限,价格昂贵,远远不能满足临床需要。利用转基因动物乳腺作为生物反应器来生产溶栓药物能够降低成本,是一种高效率的表达系统,转基因动物乳腺生物反应器是将目的基因构建于乳腺表达载体,通过显微注射等方法注入动物的受精卵中,使目的基因整合到动物的染色体中,最终在动物乳汁中获得目的的蛋白的一种制药方法。到目前为止,转基因组织型纤溶酶激活剂（tPA),尿激酶型纤溶酶原激活剂（uPA),长效组织型纤溶酶原激活剂（ＬＡtＰＡ)的基因小鼠,及长效组织型纤溶酶原激活剂（LAtPA)的转基因单都已产生,并且在从转基因羊乳汁中纯化长效组织型纤溶酶原激活剂（LAtPA)蛋白方面也取得了突性的进展。可以预测,利用转基因动物乳腺生物反应器生产熔栓药物将会有广阔的前景。     

Model establishment of transgenic mouse mammary epithelial cells for research of gene expression

目的 建立转基因小鼠乳腺上皮细胞模型,为研究乳腺内环境因素调控外源基因的表达和制备高效表达外源基因的乳腺生物反应器提供研究平台.方法 通过机械破碎和胶原酶消化的方法获取人转铁蛋白(hTF)转基因小鼠的乳腺上皮细胞,并进行体外原代培养.经胰蛋白酶纯化后,绘制乳腺上皮细胞生长曲线;免疫组织化学方法检测角蛋白18的表达;透射电子显微镜(透射电镜)观察乳腺上皮细胞超微结构;流式细胞仪检测细胞周期分布;显微镜下分析乳腺上皮细胞核型.将牛催乳素真核表达载体(pCMV-bPRL)转染至转基因乳腺上皮细胞中,检测外源bPRL的表达.结果 乳腺上皮细胞生长曲线呈“S”形;免疫荧光组织化学分析结果显示hTF转基因小鼠乳腺上皮细胞角蛋白18呈阳性表达;透射电镜观察发现乳腺上皮细胞胞核较大、偏位,有双核或多核,胞质丰富,空泡、粗面内质网、高尔基体丰富;流式细胞仪检测结果显示:乳腺上皮细胞增殖活跃,G2/M期+S期细胞占15％;细胞核型分析结果显示处于分裂期的细胞具有正常的二倍体,染色体完整.pCMV-bPRL转染乳腺上皮细胞24 h后,上清液中检测到bPRL的表达.结论 体外培养的转基因乳腺上皮细胞具有类似体内细胞的生物学特征,并可表达真核表达载体,为研究环境因素对乳腺功能的影响及制备乳腺生物反应器提供了一种细胞模型.     

CRISPR/Cas9介导的小鼠BRCA1/BRCA2/CDH1基因乳腺特异性修饰研究

目的应用CRISPR/Cas9系统构建BRCA1、BRCA2和CDH1三基因乳腺特异性修饰小鼠模型。方法针对小鼠BRCA1、BRCA2和CDH1基因分别设计并合成sgRNA,构建p X330-sp Cas9-U6-gRNA共表达载体,将共表达载体中CBh启动子替换为乳腺组织特异性启动子WAP。利用小鼠受精卵原核注射的方法制备转基因小鼠。结果共注射受精卵190枚,得到活性受精卵130枚,移植4只受体鼠。产下F0代仔鼠42只,鉴定出11只转基因阳性小鼠,阳性率为26.19%。F0代阳性鼠繁育后得到39只F1代仔鼠,其中9只为F1代转基因阳性鼠。结论通过构建乳腺组织特异表达Cas9载体成功制备了转基因阳性鼠。     

Targeted Expression and Secretion of Human Apoprotein AI,Apoprotein E and Lecithin-choles-terol Acyltransferase from Myogenic Cell

Objective To investigate the possibility of heterologous expression for apoAI, apoE and LCAT by skeletal muscle cells and secretion into blood and to develop a safe and convenient gene therapy method for atherosclerosis. Methods Viral and nonviral vectors containing apoAI, apoE or LCAT genes were constructed and transfected into myogenic cells in vitro or injected directed into mouse skeletal muscle. The expression efficiencies of these vectors were investigated by ELISA assay for human apoAI and apoE3 and by the proteoliposome method for human LCAT. Genomic DNA was extracted from stable transduced myoblasts and analyzed for the presence of vector sequence by PCR amplifications. Immunocytochemistry assay was also performed to make an intuitionistic detection for the expression of transgene in myoblasts. Results All viral or nonviral vectors constructed in present study expressed the transgenes efficiently in mice skeletal muscles in vivo or cultured myoblasts in vitro. The transgene expression level of cells transfected with AAV-based plasmid vectors were 2-4 times higher then that of cells transfected with conventional plasmid vectors. Additionally, cells transfected with AAV-based bicistronic vector or tricistronic retroviral vector expressed both human apoAI and LCAT simultaneously. The sequences of retroviral or AAV-based plasmid vectors were found to be retained in host cells after transfection when that of conventional plasmid vectors were lost. Furthermore, transduced myoblasts maintained the ability for heterologous expression of human apoAI and LCAT even after differentiation into myotubes. For cells transfected with retroviral vectors, stable transduced clones can be selected by G418 and continued to efficiently express human apoAI and LCAT for 3 months. Conclusion These finds indicated that mice skeletal muscles or cultured myoblasts transduced with viral or non-viral vectors could efficiently express and secret human apoAI, apoE and LCAT. It suggested that the use of nonviral, adenoviral or AAV-based vectors to directly inject into skeletal muscle or the use of polycistronic retroviral to genetically modify myoblasts ex vivo and then implantation back to skeletal muscle to high efficiently and long-term express apoAI, apoE and LCAT in vivo might be a safe and feasible strategy to prevent or reduce the formation of atherosclerotic lesions.     

外源性基因经乳腺导管注射在大鼠乳腺组织中表达的机制研究

目的研究外源性基因经乳腺导管注射在乳腺组织中表达的机制。方法依据乳腺发育时期的不同（即9周龄未孕、妊娠7d、妊娠12d、妊娠18d、产后7d、产后14d）将36只SD大鼠分为6个实验组（6只／组）,以绿色荧光蛋白（GFP）高效表达质粒pCE-29与脂质体混合后,经乳腺管导人各组大鼠第5对乳腺。48h后取材冰冻切片,荧光显微镜下观察各组GFP的表达情况,如有表达则对该张冰冻切片行HE染色,前后图像对比以确定GFP表达位置。另取不同发育时期正常大鼠乳腺组织制作石蜡切片,HE染色。结果pCE-29质粒由乳头管导人后,实验组中妊娠12d组和产后7d组中各有2只有GFP表达,图像对比后确定GFP是在乳腺腺泡细胞中表达：石蜡切片HE染色后观察大鼠乳腺组织,在从妊娠初始到产后的发生变化过程中,在妊娠12d和产后7d时处于分裂期的腺细胞较多,而其他时期处于分裂期的腺细胞较少。结论在妊娠12d和产后7d这两个时期,外源性基因经乳腺管注射可以转入腺泡上皮细胞而得到表达。表达的机制可能是在妊娠期及分娩后,由于体内激素作用,乳腺干细胞在以上两个时期不断分化．启动腺细胞分裂增殖,分裂期的腺细胞进行DNA复制,因此可能接受外源性基因的机率大。本实验为外源性基因经乳腺管注射在动物乳腺的表达提供了重要的研究资料。     

Targeted Expression and Secretion of Human Apoprotein AI, Apoprotein E and Lecithin cholesterol Acyltransferase from Myogenic Cells

Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓａｎｄｉｔｓｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓａｃｃｏｕｎｔｆｏｒｍｏｓｔｍｏｒｂｉｄｉｔｙａｎｄｍｏｒｔａｌｉｔｙｉｎｔｈｅｗｏｒｌｄ.Ａｎｕｍｂｅｒｏｆｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌｓｔｕｄｉｅｓｈａｖｅｄｅｍｏｎ ｓｔｒａｔｅｄａｎｉｎｖｅｒｓｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎ ｐｌａｓｍａｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ (ＨＤＬ)ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｉｎｃｉｄｅｎｃｅｏｆａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ[1 ] .Ｉｔｉｓｗｉｄｅｌｙａｃ ｃｅ…     

重组质粒pIRES2-EGFP/CCK的构建及其在仓鼠体内及COS-7细胞中的表达

目的：构建猪源性CCK基因重组真核表达质粒pIRES2-EGFP／CCK（CCK pDNA），研究其在哺乳动物细胞和仓鼠体内的表达。方法：以限制性内切酶法从中介载体pMD18-T／CCK中切取目的片段CCK，将其克隆入真核表达载体pIRES2-EGFP中，以脂质体法转染COS-7细胞，同时采用直接肌肉注射法免疫仓鼠，利用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达。结果：用CCKpDNA转染COS-7细胞后24，48，72h均可检测到绿色荧光蛋白的表达，其中72h组荧光强度达到最强。用CCK pDNA免疫仓鼠后，第4天注射部位可检测到绿色荧光蛋白的表达，第14天荧光强度明显增强，第42天荧光强度进一步增强，正常对照组始终未检测到绿色荧光蛋白的表达。结论：成功构建了猪源性CCK基因真核表达质粒pIRES2-EGFP／CCK，并成功地在哺乳动物细胞和仓鼠体内进行了表达，为仓鼠胰腺癌的交叉免疫治疗奠定了基础。     

脂质转染剂增强基因疫苗诱导的免疫应答效力

目的 研究脂质转染剂（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ）提高丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心（Ｃ）基因疫苗的抗病毒免疫应答效力。方法 人工构建包含ＨＣＶ Ｃ基因片段的的真核表达载体ｐｃＤ－ＮＡＨＣＶ－Ｃ,在证实期可以在真核细胞中表达之后,将期用脂质转剂包裹,形成ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ－ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ脂质混合物,将该混合物或单纯ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ直接注射ＢＡＬＢ／ｃ小鼠股四头肌,以空载体ｐｃＤＮＡ     

Phagocytosis and related phenomena in polymorphonuclear leukocytes from cow's milk

There were fewer efficient phagocytes among leukocytes collected from artificially irritated mammary glands than among the leukocytes from blood of the same animals. The milk polymorphonuclear (PMN) leukocytes adhered poorly to a column of siliconised glass beads when compared with the blood cells. However, investigations of the O(2) uptake and CO(2) production of the milk PMN leukocytes revealed that these cells appeared to utilize metabolic pathways similar to those used by human and guinea pig PMN leukocytes during phagocytosis. These pathways are associated with degranulation and the production of H(2)O(2) following particle ingestion. It is therefore suggested that the milk PMN leukocytes appear not to have lost the ability to produce this bactericidal substance.     

重组质粒pIRES2-EGFP/CCK的构建及其在体内外的表达

目的构建猪源性胆囊收缩素(CCK)基因真核表达质粒pIRES2-EGFP/CCK,并在哺乳动物细胞COS-7中和仓鼠体内进行表达。方法从含CCK的中介载体pMD18-T/CCK中,以限制性内切酶方法获取目的片段,将其克隆入真核表达载体pIRES2-EGFP中,以脂质体法转染COS-7细胞,利用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,同时采用肌肉注射法免疫仓鼠,了解重组质粒pIRES2-EGFP/CCK的体内表达。结果构建了猪CCK基因的重组真核表达质粒pIRES2-EGFP/CCK,用其转染COS-7细胞后24h、48h、72h均可检测到绿色荧光蛋白的表达,其中72h组荧光强度达到最强。用pIRES2-EGFP/CCK免疫仓鼠后,第4d注射部位可以检测到绿色荧光蛋白的表达,第14d荧光强度明显增强,第42d荧光强度进一步增强,正常对照组始终未检测到绿色荧光蛋白的表达。结论成功构建了猪源性CCK基因真核表达质粒pIRES2-EGFP/CCK,并成功地在哺乳动物细胞COS-7中和仓鼠体内进行了表达,为仓鼠胰腺癌的交叉免疫治疗奠定了基础。     

小鼠3D3/LYRIC基因重组质粒构建及蛋白表达和定位

 目的构建小鼠3D3/LYRIC真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内的表达及定位。方法提取小鼠乳腺上皮细胞系
C127 的mRNA,反转录为cDNA。PCR扩增3D3/LYRIC全长编码基因,亚克隆至pEGFP-C1表达载体中。将构建的重组质粒测
序并转染到腺样囊性癌细胞系ACC-2 中,提取细胞蛋白进行Western blot检测。利用免疫荧光显微镜观察pEGFP-m3D3/LYRIC
在腺样囊性癌ACC-2 细胞内的定位。结果3D3/LYRIC全长基因序列克隆到真核表达载体pEGFP-C1 中,酶切鉴定片段大小
为1 740 bp。Western blot 检测到融合蛋白GFP-m3D3/LYRIC 表达,分子量约为91 kDa。pEGFP-C1-m3D3/LYRIC主要在细胞质
内定位,在细胞核内未见表达。结论成功构建了3D3/LYRIC全长基因真核表达载体,pEGFP-m3D3/LYRIC 蛋白主要定位于
细胞质内。     

糖尿病大鼠下颌下腺内瘦素和瘦素受体表达变化

目的观察糖尿病大鼠下颌下腺内瘦素和瘦素受体表达的变化.方法 SD雄性大鼠24只,随机分为实验组12只(4、12周各6只)及对照组12只.用链脲佐菌素复制糖尿病动物模型,分别于4、12周后测体重和血糖,应用HE和免疫组织化学SABC法,观察组织学变化并检测瘦素及其受体表达.结果与对照组比较,实验组腺实质趋于萎缩.对照组大鼠下颌下腺导管上皮细胞呈瘦素及瘦素受体免疫反应中等阳性,免疫反应物分布于细胞胞质内,细胞核和腺泡细胞呈阴性.4周糖尿病组瘦素及其受体免疫反应呈较强阳性;12周时呈强阳性.结论随糖尿病病程延长,大鼠下颌下腺组织发生退变且瘦素及其受体表达增强,为探讨瘦素变化在糖尿病发病机制中的作用及意义提供了形态学依据.     

pEGFPC1-uPAR重组质粒的构建及对细胞增殖和侵袭性的影响

目的构建含人uPAR基因片断的真核表达绿色荧光蛋白质粒,并进行初步的细胞生物学研究.方法设计引物,利用PCR从原核表达质粒中扩增人全长uPAR基因,并导入真核表达载体绿色荧光蛋白质粒pGFPC1中,测序确认后转染Pam 212细胞,使之在细胞中表达,检测其细胞生长特性和侵袭能力的变化.结果测序证实构建的含uPAR的绿色荧光蛋白质粒,其uPAR cDNA阅读框完整,连接部位序列正确;转染Pam 212细胞后,能促进细胞的生长并能增强细胞的侵袭能力.结论成功构建了含pEGFPC1-uPAR质粒,确认uPAR能促进Pam 212细胞的生长和侵袭,为进一步在体定位研究打下了基础.