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1.
乙型肝炎病毒序列准种个体化特征的研究 总被引:14,自引:2,他引:12
以乙型肝炎病毒(HBV)多聚酶(P)逆转录酶(RT)区及表面抗原(HBsAg)主蛋白、e抗原(HBeAg)氨基酸序列异质性来探讨HBV准种群在感染个体中的变异特点。应用多聚酶链反应(PCR)方法自8例慢性HBV患者血清中扩增靶基因,克隆入T载体,随机挑选27株克隆测序,将获得基因的推断氨基酸序列进行比较后发现:病毒结构/非结构蛋白氨基酸序列存在广泛的变异现象,替换突变表现出一定的个体特异性,其结果是导致HBV在特定的患者体内可能存在特征性的变异。本研究提示HBV在患者体内的蛋白序列多样性是乙型肝炎慢性化的一个重要原因。 相似文献
2.
乙型肝炎病毒基因组准种与变异特点的研究 总被引:49,自引:7,他引:42
探讨乙型肝炎病毒(HBV)基因组异质性及其生物学意义。以已知HBV基因序列为依据,设计特异性多聚酶链反应(PCR)引物,自2例慢性HBV感染患者外周血血清中扩增HBV基因组序列,克隆入pGEM Teasy质粒,随机挑选克隆进行DNA测序并加以比较。测序结果发现,来源不同的5株HBV全基因组核苷酸序列的一致率为93.6%,不同克隆的4个开放读码框架长度有明显区别,氨基酸序列中存有移框、缺失、替换等多种变异类型。说明来源于同一患者的HBV基因组序列之间存在有较明显的变异现象,在患者体内构成了准种群。 相似文献
3.
乙型肝炎病毒前C/C基因准种与变异特点的研究 总被引:22,自引:1,他引:21
以乙型肝炎病毒(HBV)前C/C基因异质性来探讨在慢性感染者体内是否存在HBV准种。以中国株HBV基因序列为依据,设计特异性多聚酶链反应(PCR)引物,自4例慢性HBV感染患者血清中扩增HBV前C/C基因序列,克隆入pGEM Teasy载体,每例患者挑选5个克隆测序以比较病毒的变异程度。测序结果发现同一患者前C/C基因碱基序列之间的同源性大于98%,但存有G83→A替换、C抗原内部缺失、移框突变等多种变异类型。结果提示,HBV长期携带者体内有HBV准种共存,推测前C/C区的多种变异可能与感染慢性化有关。 相似文献
4.
乙型肝炎病毒核心启动子区基因异质性及对其转录活性的影响 总被引:24,自引:2,他引:22
从慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染患者外周血中扩增核心启动子(CP) 基因序列,克隆入pGEM-Teasy质粒,随机挑选克隆进行DNA测序以确定病毒的变异程度。结果提示,HBV长期携带者体内有准种共存,CP区内存在热点缺失突变及散在点突变。为了进一步探讨CP区基因异质性对其转录活性的影响,将野生株及不同缺失突变的CP基因片段克隆入pcDNA3.1(-)载体的EcoRI位点,筛选反向克隆,经KpnI和XhoI双酶切后克隆入氯霉素乙酰转移酶(CAT)报告基因表达载体pCAT3-basic上,构建重组报告质粒。以Lipo-fectamine PLUS转染试剂转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,用ELISA方法检测CAT表达量,反映了CAT基因上游启动子的转录活性。结果显示,成功构建了重组报告质粒,与野生株比较,HBV CP区准种群的存在不同程度地降低了CP基因的转录活性。 相似文献
5.
乙型肝炎病毒X基因异质性及对其反式激活功能的影响 总被引:38,自引:3,他引:35
从慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染患者外周血中扩增X基因序列,克隆入pGEM-Teasy质粒,随机挑选克隆进行DNA测序以确定病毒的变异程度。结果提示,HBV长期带者体内有HBV准种共存,X区内存在热点缺失突变区。为了进一步探讨X区突变对X蛋白反式激活功能的影响,将野生株及不同缺失突变的X基因片段克隆入pcDNA3.1(-)载体的EcoRI位点,构建重组表达质粒,并分别与报告质粒pSV-lacZ共转染HepG2细胞,提取细胞裂解液,检测SV40启动子调控下的β-半乳糖苷酶表达活性。共转染结果显示:野生株X蛋白能够反式激活SV40病毒早期启动子。提示X区不同核苷酸缺失突变和点突变均在不同程度上降低了其反式激活作用。 相似文献
6.
HBV表型耐药方法的建立及临床分离株的表型耐药分析 总被引:2,自引:2,他引:0
目的建立HBV表型耐药分析方法 ,体外培养慢性乙型肝炎患者血清HBV分离株并系统分析其对拉米夫定(LAM)的敏感性。方法从1例LAM耐药慢性乙型肝炎患者血清中提取HBV DNA,PCR扩增RT基因,克隆到pGEM-Teasy载体中,随机挑选10个克隆进行DNA序列测定,并分析RT区LAM耐药相关的突变位点。用XhoI和NcoI双酶切pGEM-Teasy-RT及pTriEx-HBV(C),构建1.1倍HBV野生株和LAM耐药突变株的重组载体pTriEx-wRT和pTriEx-mRT,转染人肝癌细胞系HepG2细胞。转染60h后加入不同浓度(0、0.01、0.1、1、10、100μmol/L)的LAM,药物连续作用5d后,抽提病毒核心颗粒HBV DNA,通过实时荧光PCR及Southern blotting检测不同药物浓度作用下HBV DNA的复制水平。结果成功建立体外HBV表型耐药分析方法。野生未突变株重组载体pTriEx-wRT转染HepG2细胞后,随着LAM浓度的升高,HBV DNA水平明显下降,而突变株重组载体pTriEx-mRT转染HepG2细胞后,HBV DNA水平无明显下降,IC50值与野生株相比增加了2500倍。结论建立的HBV表型耐药分析方法对监测HBV耐药性具有可行性。 相似文献
7.
目的 分析乙型肝炎病毒(HBV)HBsAg+抗HBs双阳性患者S基因主要亲水区(MHR)新增N-糖基化突变的特点,探讨HBsAg+抗HBs双阳性的发生机制和临床意义.方法 对284例HBsAg+抗HBs双阳性和314例HBsAg单阳性的慢性HBV感染者S基因进行测序分析.对1例携有MHR区双N-糖基化新型突变株的慢性乙肝患者样本进行随访收集和研究.构建双N-糖基化突变和对照前S/S基因重组质粒,转染HepG2细胞,分析突变对病毒复制力和抗原性的影响.结果 HBsAg+抗HBs双阳性患者MHR区新增N-糖基化突变的检出率为11.3%(32/284),显著高于HBsAg单阳性患者的2.9%(9/314)(P<0.01).HBsAg+抗HBs双阳性组中,72例肝细胞癌(HCC)在N-糖基化突变阳性和阴性患者中所占比例分别为46.9%(15/32)和22.6%(57/252) (P<0.01).从1例患者中检出的新型株突变形式为s116-118TST→NST+s 131-133TSM→NST,并联合sP120缺失+G145D突变,在3份随访样本中该突变株分别占98.0%、2.0%和2.5%,第2份样本中检出s130-132GTS→NSS单N-糖基化突变株,占17.6%,但无sP120缺失+G145D联合突变.与野生株相比,新型突变株复制力提高31%,但HBsAg定量降低99%.免疫荧光结果显示,双N-糖基化定点回复突变株可部分恢复HBsAg检出水平,提示除双N-糖基化突变外,sP120缺失+G145D联合突变对HBsAg抗原性减弱也有明显影响.结论 HBV S基因MHR区新增N-糖基化突变与HBsAg+抗HBs双阳性相关,两者同时出现可能是HCC发生的高风险因素;S基因MHR区新增双N-糖基化+sP120缺失+sG145D联合突变共同影响HBsAg的抗原性. 相似文献
8.
HBV全基因核心蛋白变异株稳定表达载体的构建及其抗原表达 总被引:3,自引:0,他引:3
通过定点突变技术将HBV质粒p3.8Ⅱ构建成核心蛋白变异株V60和L97。经序列测定和生物学活性检测后,亚克隆入EB病毒稳定表达载体。重组载体分别作内切酶酶切鉴定和序列测定证实,用脂质体介导转染HepG2细胞稳定传代,定量测定各株培养上清HBV抗原表达。结果发现,3株HBsAg含量S/N值接近,变异株HBeAg含量S/CO值低于野生株。上述3种重组载体的构建可为体外研究HBV核心蛋白热点变异与致病的关系提供基础。 相似文献
9.
慢性乙型肝炎表面抗原携带者前S1基因的高度异质性 总被引:1,自引:0,他引:1
应用半巢式聚合酶链式反应(PCR)从一例慢性HBsAg携带者血清中扩增出HBV前S1基因,将其克隆于噬菌体M13mp19中进行序列分析。结果发现:与同源性最好的HBVadr野生林相比,所测的10个克隆均有替代和插入突变,9个克隆有缺失突变,10个克隆的核苷酸变异率为5.0%-17.0%,氨基酸的变异率为13.0-60.0%;10个克隆之间的核苷酸变异率为2.3%-24.3%,氨基酸的变异率为14. 相似文献
10.
慢性乙型肝炎患者血清HBV全长序列分析及复制力评价 总被引:3,自引:3,他引:0
目的 分析乙型肝炎患者HBV全长基因组序列并对其复制力进行评价.方法 从慢性乙型肝炎患者血清中提取HBV病毒DNA,PCR扩增HBV全长基因组,克隆到pGEM-Teasy载体中,每个样品挑选5~10个克隆测序,分析基因型以及全长基因组耐药相关的突变位点,并对个别位点进行定点突变.将克隆到pGEM-Teasy载体中的全长HBV基因组经BspQ Ⅰ/Sca Ⅰ双酶切后,转染入肝癌细胞系HepG2、Huh7.转染3d后榆测上清HmAg表达量及细胞内HBV复制中间体核心颗粒DNA载量,分析全长HBV基因组的复制力(1.0倍HBV复制模型).结果 从2份慢性乙型肝炎患者血清中成功获得5条HBV全长克隆,来自同一份血清的克隆核苷酸,其一致性为98%~100%,提示HBV存在准种特性.测序结果 表明5条HBV全长基因均为C型.通过定点突变又获得3个全长克隆.经序列分析发现,HBV反转录酶区存在A181V/S、L229M、V84M、M204I氨基酸位点的突变,前C/C区存在T1753C、A1762T、G1764A和G1896A核苷酸位点的突变.复制力分析提示上述位点突变后病毒复制力均有不同程度下降,L229M还可以进一步降低A181V突变株的复制力.结论 自行建立的无载体1.0倍HBV复制模型可在细胞内分泌抗原蛋白以及装配子代病毒,完成生活周期,这为下一步分析HBV的耐药表型打下了基础.此外,还可指导临床制定更加合理的抗病毒策略,筛选针对已出现或将来可能出现的耐药突变的新型抗病毒药物. 相似文献
11.
DNA序列测定法与实时荧光PCR法检测YMDD突变结果的比较 总被引:3,自引:1,他引:2
目的比较DNA序列测定法与实时荧光法检测YMDD突变的结果,并对除YMDD突变之外的耐药相关基因突变及其意义进行讨论。方法收集89例慢性乙肝患者的92份血清样本,均用实时荧光PCR法做YMDD突变检测。采用巢式PCR法扩增HBV反转录酶(RT)基因,对PCR产物进行DNA双向测序,采用NTI软件比对结果,并对RT基因上其他11个已知耐药相关突变位点进行分析。结果在37份YMDD突变阴性的样本中,DNA测序法检测结果为33份M204M(未突变)、1份M204I、3份M204V;4份YMDD突变阳性样本均为突变/未突变序列共存;另检出7份样本存在ADV耐药相关突变,占18.9%(7/37)。在55份YMDD突变阳性样本中,DNA测序法检测到52份,阳性结果符合率为94.5%(52/55);另检出5例存在ADV或ETV耐药相关突变,占9.1%(5/55)。结论DNA序列测定法检测HBVRT基因耐药相关突变敏感性高,重复性好,与实时荧光PCR方法的检测结果有较高的符合率,可同时检出YMDD突变以外的各种耐药相关突变,有助于临床全面了解患者对核苷(酸)类似物的耐药情况,合理地制订抗HBV治疗方案。 相似文献
12.
目的分析乙肝病毒(HBV)反转录酶(RT)区YMDD功能域新变异rtM204Q的表型特点。方法从1例接受拉米夫定(LAM)治疗的慢性乙肝患者血清中提取HBV DNA,扩增HBV全长RT区基因,PCR产物直接克隆到pGEM-Teasy载体中,随机挑选40个克隆进行DNA序列测定并分析耐药相关变异。将Xho I/Sph I双酶切后的RT片段与载体连接成含HBV 1.1倍基因组长度的重组载体。采用FuGENE HD试剂盒,将构建的含野生株和变异株的重组载体转染至人肝癌细胞系HepG2细胞。转染4h后加入不同浓度的核苷(酸)类药物[LAM终浓度为0、0.01、0.1、1、10、100μmol/L;阿德福韦酯(ADV)终浓度为0、0.033、0.1、0.33、1、3.3μmol/L;恩替卡韦(ETV)终浓度为0、0.001、0.01、0.1、1、10μmol/L;替诺福韦酯(TDF)终浓度为0、0.01、0.1、1、10、100μmol/L],隔天换药,连续作用4d后收集细胞上清,采用实时荧光定量PCR技术检测不同药物浓度下HBV DNA的复制水平,以分析变异株的表型特点。结果对从患者血清获得的37个克隆进行测序分析,结果显示13个(35.1%)为野生型,11个(29.7%)为rtM204Q突变型,2个(5.4%)为rtM204I突变型,10个(27.0%)为rtA181T突变型,1个(2.7%)为rtA181T+rtM204Q突变型。后4种变异株的复制力分别是野生株复制力的89.95%、46.28%、55.77%和34.44%(P<0.05)。前2种变异形式的表型耐药分析结果显示,rtM204Q对LAM的敏感性为野生株的1/75.68,而rtM204I对LAM的敏感性不及野生株的1/1000。rtM204Q和rtM204I株对ADV、ETV和TDF均敏感。结论 HBV RT区新的YQDD基序变异在一定程度上抑制病毒复制力,对LAM的敏感性降低,提示这可能是一个新的LAM耐药相关变异。 相似文献
13.
目的了解HBsAg(+)/HBcAb(+)/HBeAb(+)的慢性乙肝病人血清乙肝病毒(HBV)DNA前C区A1896的变异情况及其与临床关系。方法对所有试验对象检测肝功能指标,根据检测结果分为丙氨酸氨基转移酶(ALT)升高组和ALT正常组。用聚合酶链反应杂交(PCR-ELISA)定量检测HBV-DNA并进一步检测HBV前C区A1896位点的变异情况。结果 38例患者中有18例HBV-DNA阳性,其中15例发生A1896位点变异,变异率为83.3%(15/18)。ALT升高组的18例中,血清HBV-DNA阳性13例,阳性率72.2%,平均浓度为9.62×106(1.10×103~1.09×108)拷贝/ml,A1896变异13例,变异率为100%(13/13)。ALT正常组的20例中,HBV-DNA阳性5例,阳性率25.00%,平均浓度2.55×104(3.28×103~4.61×104)拷贝/ml。A1896变异2例,变异率为40%(2/5)。两组比较无论在HBV-DNA阳性率,还是A1896位变异率都具有统计学差异(P<0.05)。结论 HBsAg(+)/HBcAb(+)/HBeAb(+)的慢性乙肝患者存在较高的A1896变异率,ALT升高组HBV-DNA阳性率和变异率均高于ALT正常组(P<0.05),提示HBV A1896位点变异与肝脏病变活动加重和ALT升高有关。 相似文献
14.
目的分析我国大样本来源的慢性乙肝病毒(HBV)感染患者多重耐药HBV的基因型和表型特点。方法回顾性分析11 800例慢性乙肝患者血清中HBV反转录酶(RT)区与核苷(酸)类似物耐药相关的突变类型及频率,采用PCR产物直接测序法和克隆测序法(≥20个克隆/样本)对其中的46例多重耐药HBV突变株进行鉴定。采用体外表型耐药分析法检测核苷类与核苷酸类联合处理对多重耐药HBV的抑制效果。分析临床治疗方案在多重耐药HBV感染的发生及控制中的作用。结果在11 800例慢性HBV感染者中,共3658例(31.0%)检出核苷(酸)类耐药相关突变,其中拉米夫定(LAM)耐药突变2592例(70.9%),阿德福韦酯(ADV)耐药突变665例(18.2%),恩替卡韦(ETV)耐药突变293例(8.0%),替比夫定(LdT)耐药突变62例(1.7%),同时针对核苷类和核苷酸类的多重耐药(MDR)突变46例(1.3%)。对46例多重耐药感染样本的克隆测序显示,40例样本在同一病毒基因组上检出MDR突变,其他6例样本的MDR突变则存在于不同的HBV基因组中。基因型分析显示共有15种病毒变异形式,同时耐LAM(或LdT)和ADV,以及同时耐ETV和ADV的MDR株分别为10种和5种。体外表型耐药分析结果显示,ETV(或LAM)和ADV联合用药可有效抑制HepG2细胞内MDR HBV的复制,但对野生株无类似效果。临床用药方案分析显示,多重耐药HBV感染常出现在LAM(或)LdT、ADV、ETV序贯治疗的患者,以LAM→ADV(22例)和LAM→ADV→ETV(10例)最多见,发生多重耐药后大多出现病毒学和(或)生化学突破。LAM+ADV或ETV+ADV联合挽救治疗可成功将大多数多重耐药HBV的DNA复制控制在检测不到的水平。结论我国MDR HBV株具有多样性和复杂性,表型分析和临床观察均证实核苷与核苷酸类似物联合使用可有效控制MDR HBV复制。多重耐药HBV感染的发生与临床长期应用核苷(酸)类似物序贯治疗有关,密切监测病毒应答及耐药突变对于临床尽早制定最优的抗病毒策略具有重要意义。 相似文献
15.
目的分析乙肝病毒(HBV)多聚酶的反转录酶(RT)功能域rtL229突变的演变规律及其与拉米夫定(LAM)耐药的相关性。方法回顾性分析2010年8月在解放军302医院抗病毒治疗过程中发生rtL229F突变的1例慢性乙肝患者的临床资料,从其动态血清中扩增HBV RT基因并克隆测序(>20个克隆/样本)以观测rtL229F突变的演变过程。同时将含有不同突变形式(rtM204I、rtL229F以及rtM204I+rtL229F)的HBV DNA RT区基因定向克隆至HBV1.1载体中获得可复制的HBV复制子,将复制子转染HepG2细胞,在含或不含核苷(酸)类似物[LAM、阿德福韦酯(ADV)、恩替卡韦(ETV)和替诺福韦酯(TDF)]的培养基中连续培养4d,采用实时荧光定量PCR法检测上清中产生的HBV DNA。结果 LAM治疗过程中,rtL229F突变可继发于rtM204I突变,而停用LAM后可逐渐回复为野生型。表型分析结果显示,单独rtL229F突变不改变病毒的药物敏感性,而与rtM204I突变联合后可以增强突变HBV的LAM耐药性。结论 rtL229F位点突变是LAM耐药突变的补偿突变,与LAM应答不佳相关,且对ADV、ETV及TDF敏感。 相似文献