大鼠肺癌癌变过程中Rb肿瘤抑制途径失控的意义

目的 :探讨大鼠肺癌癌变过程中Rb肿瘤抑制途径的主要成员p16、CyclinD1和CDK4基因的动态表达和肺癌发生发展及侵袭转移的关系。方法 :用 3 甲基胆蒽 (3 methylcholanthrene,MCA)及二乙基亚硝胺 (diethylnitrosa mine,DEN)碘油溶液在 80只大鼠诱发大鼠肺癌 ,12只作为对照组。应用免疫组织化学及原位杂交技术检测大鼠肺癌癌变各阶段组织的p16、CyclinD1和CDK4基因的改变。结果 :随大鼠肺癌的发生发展 ,p16基因呈不同程度的缺失或低表达 ,其中p16蛋白在 6 0 .75 % (6 5 10 7)的大鼠肺癌中缺失表达 ;p16蛋白表达的阳性率在对照组及癌前病变与肺癌相比差异有极显著性 (P <0 .0 1) ;浸润癌与原位癌相比 ,p16蛋白阳性率的差异有显著性 (P <0 .0 5 )。CyclinD1、CDK4的表达在对照组较弱或阴性 ,而在实验组有不同程度的过表达 ,阳性率范围分别为 10 .0 0 %～ 79.0 7%、15 .0 0 %～ 72 .0 9% ;在不典型增生与原位癌、原位癌与浸润癌之间 ,cyclinD1和CDK4表达的升高有显著性 (P <0 .0 5 )。大鼠肺癌癌变中p16与cyclinD1呈负相关 (P <0 .0 1) ,Pearson列联系数为 0 .5 30 7;CDK4与CyclinD1呈正相关(P <0 .0 1) ,Pearson列联系数为 0 .5 782 ;p16与CDK4无明显相关性 (P >0 .0 5 )。p16、CyclinD1、CDK4与大鼠肺癌发?     

磷酸化STAT3和p53基因在表皮肿瘤的表达

目的:探讨stat3磷酸化(P-stat3)和p53基因表达在表皮肿瘤发生中的作用.方法:选择皮肤鳞状细胞癌(SCC)30例、基底细胞癌(BCC)、皮肤脂溢性角化(SK)和正常皮肤各20例,运用免疫组化方法,观察细胞中P-stat3和p53蛋白的表达.结果:①与正常皮肤和皮肤SK相比,P-stat3在皮肤SCC、BCC中呈明显的上调表达(P<0.001),皮肤SCC中 P-stat3的表达强度又明显地高于BCC(P<0.05);②P-stat3在皮肤SCC中的表达强度与肿瘤的分化程度有关(P<0.05),阳性表达率与肿瘤浸润的深度有关(P<0.05),与肿瘤的大小无关.③正常皮肤和皮肤SK无p53的表达,皮肤SCC和BCC中p53表达明显上调(P<0.001),且在皮肤SCC中P53的表达强度与肿瘤的分化程度有关(P<0.05),阳性表达率与肿瘤浸润的深度无关,与肿瘤是否位于暴露部位有关(P<0.05).④皮肤SCC中,P-stat3和p53的阳性表达强度具有正相关性,rs=0.641,P<0.05.结论:①P-stat3级联分子的表达异常可能在表皮肿瘤的发生中起重要作用.②stat3的过度活化可能与皮肤SCC的侵袭性生长潜能密切相关.③p53基因可能与stat3共同参与皮肤SCC的发病.     

胃癌中p16INK4a-CDK4-pRb通路蛋白表达异常

目的：检测胃癌组织中p16^INK4a-CDK4-pRb通路p16^INK4a、CDK4、pRb蛋白表达状况，探讨蛋白表达与胃癌发生发展以及临床病理指标的关系。方珐；采用免疫组织化学方法检测了胃癌组织中p16^INK4a、CDK4、pRb蛋白表达。结果：10例正常胃黏膜中相应蛋白表达全部阳性．而肿瘤组织中p16^INK4a、pRb蛋白表达阳性率分着1为54％（44／81）和90％（73／81），p16^INK4a蛋白表达显著低于正常组织（P=0．005），26％（21／81）的肿瘤组织中CDK4过表达。p16^INK4a、pRb、CDK4蛋白表达与肿瘤组织学类型、淋巴结转移及性别、年龄均无相关性．结论：p16^INK4a、CDK4、pRb蛋白表达异常是胃癌细胞常见的分子事件p16^INK4a-CDK4-pRb细胞周期调控通路异常可能参与了胃癌的发生发展。     

原发性肝细胞癌中P16/CDKN2基因表达的研究

应用原位杂交技术检测了２８ 例原发性肝细胞癌（ＨＣＣ）中Ｐ１６／ＣＤＫＮ２ 基因ｍ ＲＮＡ的表达, 并用免疫组织化学法检测了Ｐ１６ 蛋白及细胞周期蛋白依赖性激酶４ （ｃｙｃｌｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｋｉｎａｓｅ ４, ＣＤＫ４） 蛋白的表达。结果显示： ７例ＨＣＣ的Ｐ１６基因ｍ ＲＮＡ为阴性, １３ 例为异质性减弱, ８ 例为保留表达。ｍ ＲＮＡ阳性的ＨＣＣ中, 均可见到Ｐ１６ 蛋白表达。Ｐ１６／ＣＤＫＮ２ 基因表达与ＨＣＣ的分级、分化及转移无关。２８ 例ＨＣＣ中共有６ 例出现ＣＤＫ４ 蛋白阳性,这６ 例ＨＣＣ均有不同程度的Ｐ１６ 蛋白表达, 提示ＣＤＫ４ 蛋白表达可能是灭活Ｐ１６ 蛋白的又一途径。     

宫颈癌中p16^INK4A蛋白表达的意义

目的探讨p16INK4A蛋白与宫颈癌发生发展以及临床病理指标的关系。方法采用免疫组化法检测宫颈鳞癌组织40例,宫颈上皮内瘤变（CIN）30例,宫颈癌旁正常宫颈组织25例中的p16INK4A表达。结果 p16INK4A在宫颈上皮内瘤变中阳性率为86.6%,宫颈鳞癌组织中阳性率均呈100%表达,正常宫颈组织中为阴性。结论 p16基因在宫颈癌组织中缺失和突变导致其表达降低,使p16抑癌功能丧失,造成宫颈上皮细胞异常增殖和分化失控,导致p16INK4A在子宫颈癌上皮组织全层表达。所以,p16INK4A作为一种免疫组织化学标志物应用于宫颈癌及其上皮内瘤变（CIN）的诊断有广阔的应用前景。     

宫颈癌及癌旁组织和上皮内瘤变及病变旁组织中P16^INK4A蛋白的表达意义

目的探讨P16INK4A蛋白在宫颈癌（cervical cancer CC）及癌旁组织、宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia, CIN）及病变旁组织中表达的意义。方法采用免疫组化PV－9000方法检测P16INK4A蛋白在23例宫颈癌及癌旁组织、71例宫颈上皮内瘤变及病变旁组织、20例正常宫颈组织中的表达。结果宫颈癌及宫颈上皮内瘤变中P16INK4A蛋白表达随着宫颈病变程度加深,阳性率逐渐增高,强度增加,差异有统计学意义（P〈0.05）;P16INK4A蛋白在宫颈癌癌旁正常组织、宫颈上皮内瘤变病变旁正常组织、正常宫颈组织中不表达;P16INK4A蛋白在宫颈癌组织中的表达强度与肿瘤直径、浸润深度及有无淋巴结转移有关（P〈0.05）,而与年龄、民族及病理分级无关（P〉0.05）。结论P16INK4A蛋白表达与宫颈病变程度有关,病变旁组织均不表达,P16INK4A蛋白可能参与了宫颈癌的发生。P16INK4A蛋白表达与肿瘤直径、浸润深度及有无淋巴结转移密切相关,可能作为新的评价宫颈癌患者预后的生物学指标。     

COX-2、p53和c-myc在皮肤肿瘤中的表达及意义

目的利用组织芯片检测Cox-2、p53和c-myc在皮肤鳞状细胞癌、基底细胞癌和Bowen病中的表达,探讨它们在上述皮肤肿瘤发病中的意义。方法手工制作组织芯片,用免疫组织化学技术检测30例皮肤SCC,21例BCC,20例BD的石蜡包埋组织及10例正常皮肤组织中COX-2、p53和c-myc的表达。结果 COX-2蛋白在皮肤肿瘤组织中阳性率明显高于正常皮肤对照组,两者差异有统计学意义（P〈0.01）;p53蛋白在皮肤肿瘤组织中阳性率高于正常皮肤对照组,两者差异有统计学意义（P〈0.05）;c-myc蛋白在皮肤肿瘤组织中阳性率高于正常皮肤对照组,两者差异有统计学意义（P〈0.05）;COX-2、p53和c-myc相互之间在所检测皮肤肿瘤中的表达无相关性（P均〉0.05）。结论组织芯片适合于样本量较大的研究。COX-2在皮肤SCC、BCC、BD中呈高表达,其与皮肤SCC、BCC、BD的发生关系密切。p53在皮肤SCC、BCC、BD中呈高表达,其与皮肤SCC、BCC、BD的发生关系密切。c-myc在皮肤SCC、BCC中呈高表达,与皮肤BD的发生无明显关系。三者均可作为判定上皮源性皮肤肿瘤恶性程度的一种标志。COX-2、p53和c-myc相互之间在所检测皮肤肿瘤中的表达水平无相关性,具体机制尚不清楚。     

人参皂苷Rg1延缓造血干细胞衰老及其相关机制

目的 探讨人参皂苷Rg1调控造血干细胞(HSC)衰老的机制,为寻找延缓HSC衰老方法 提供理论指导和实验依据.方法 免疫磁性分选法分离纯化小鼠Sca-1+HSC后分5组:对照组、衰老组、Rg1组、Rg1治疗衰老组、Rg1延缓衰老组.β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色、细胞周期测定和造血祖细胞混合集落(CFU-Mix)培养观察Rg1延缓Sca-1+HSC衰老的生物学作用.反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测衰老相关基因p161NK4a、p19Arf、p53、p21Cipl/Wafl mRNA的表达.Western印迹检测p16INK4a、p21 Cipl/Wafl、细胞周期蛋白(cyclin)D1、cyclin E、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)4、CDK2蛋白表达.结果 Rg1治疗衰老组及Rg1延缓衰老组Sca-1+HSC的SA-β-Gal染色阳性率(30.1%±2.4%,21.5%±2.8%)低于衰老组(69.5%±5.0%);G1期细胞比例(81.4%±1.2%,78.2%±1.4%)低于衰老组(87.5%±4.0%);生成CFU-Mix数[(8.0±2.2)个/104Sca-1+HSC、(9.2±1.8)个/104 Sca-1+HSC]高于衰老组[(3.0±1.6)个/104Sca-1+HSC];Rg1治疗衰老组及Rg1延缓衰老组Sca-1+HSC的p16INK4a、p19Arf、p53、p21 Cipl/Wafl mRNA及p16INKa、p21 Cipl/Wafl、cyclinD1蛋白表达均下调(均P＜0.01),CDK4、CDK2、cyclinE蛋白表达均上调(均P＜0.01).Rg1延缓衰老组各检测指标均较Rg1治疗组变化明显.结论 Rg1具有延缓及治疗Sca-1+HSC衰老的作用,p16INK4a-Rb及p19Aarf-Mdm2-p53-p21Cipl/Wafl信号通路在其中可能发挥重要作用.     

实时荧光定量PCR检测原发性肝癌中CDK4基因的表达

目的：应用实时荧光定量PCR法检测原发性肝细胞癌中CDK4基因的表达。方法：提取手术切除人肝癌和癌旁组织总RNA并逆转录为cDNA。应用实时荧光定量PCR法观察人肝细胞癌组织及癌旁组织中cDK4的表达水平。结果：20例肝细胞癌标本中有18例肿瘤组织中CDK4基因表达明显高于癌旁肝组织，其中7例高出4倍以上。结论：实时荧光定量PCR可以准确定量测定基因的表达；CDK4基因在肝细胞癌的发生、发展中可能起重要作用。     

Mutations and altered expression of p16~(INK4a) in human pancreatic carcinoma cell lines with different potential of metastasis

Objective:To analyze the p16INK4a genomic alteration and expression status in 3 human pancreatic carcinoma cell lines with different potential of metastasis. Methods:Using PCR-SSCP, Dot-blot and immunohistochemistry, the p16INK4a genomic mutation and expression were analyzed on DNA, mRNA and protein levels in 3 human pancreatic carcinoma cell lines Patu8902, Patu8988 and SW1990, which had different potential of metastasis. Results: (1) On DNA level: there was no deletion of p16INK4a Exon Ⅰ in 3cell lines; p16INK4a Exon Ⅱ was only deleted in Patu8902 while no deletion in Patu8988 and SW1990. No insertion, microdeletion and point mutation were found in the 3 cell lines. (2) On RNA level: the expression of p16INK4a protein was negative in Patu8902, low expressed in SW1990, but highly expressed in Patu8988.(3) On protein level: P16 protein was strongly stained in Patu8988, much lower in SW1990, but not stained in Patu8902. Conclusion:The genomic type and expression of p16INK4a are quite different in 3 pancreatic carcinoma cell lines which have different potential of metastasis. It is suggested that genomic homozygous deletion and low expression of mRNA might relate to the potential of metastasis of pancreatic cell lines. In other words, dysfunction of p16INK4a might be an important mechanism in the metastasis of pancreatic carcinoma.     

外源性p16基因与放疗联合治疗喉鳞癌的实验研究

目的　探讨外源性 p16基因对人喉鳞状细胞癌的抑制作用及与放射治疗联合应用的协同增敏作用。方法　应用携带 p16基因的复制缺陷型腺病毒 (Ad- p16 )转染人喉鳞癌细胞株 ,用 Western Blot方法检测 p16基因在喉鳞癌细胞中的表达 ,体外、体内实验观察 p16基因治疗和放射治疗对喉癌细胞的生长抑制作用。结果　复制缺陷型腺病毒载体可有效地将外源性 p16基因转染入人喉鳞癌细胞株中并使其表达 P16蛋白 ;体外、体内抑瘤实验表明 :Ad- p16基因治疗组、单纯放疗组和 Ad- p16基因与放疗联合治疗组肿瘤生长均明显受抑制 ,疗效显著优于携带 L ac Z基因的重组腺病毒 (Ad- L ac Z)组和 PBS对照组 (P<0 .0 5 ) ,其中联合治疗组肿瘤生长最为缓慢 ,与 Ad- p16基因治疗组和单纯放疗组比较均有显著性差异 (P<0 .0 5 )。结论　 p16基因可有效地抑制人喉鳞癌细胞生长 ,与放射治疗联合应用具有相加和协同效应     

Relationship between alterations of p16INK4a and p14ARF genes of CDKN2A locus and gastric carcinogenesis

Objective To investigate the relationship between alterations of p16INK4a and p14ARF genes and gastric carcinogenesis. Methods The tumors and neighboring gastric tissues from 48 patients with gastric cancer were studied. The homozygous deletion, mutation, methylation of the CpG islands, and mRNA expression of p16INK4a and p14ARF genes were assessed by PCR, PCR-SSCP, PCR based methylation assay, and RT-PCR. Results ① The homozygous deletion rate of p16INK4a and p14ARF was 35.4% （17/48）, and no homozygous deletion was examined in any gastric tissue neighboring the tumor. ② There was no point mutation of p16INK4a and p14ARF in 31 gastric cancers without homozygous deletion or in the matched gastric tissues adjacent to the tumor. ③ Methylation of the CpG islands of p16INK4a and p14ARF was detected in 47.9% (23/48) of gastric cancers, while methylation was observed only in 2 of 48 gastric tissues neighboring the cancer with a significant difference (P&lt;0.01). ④ The loss rate of p16INK4a mRNA was 47.9% (23/48) in gastric cancer, and the patients of the combined methylation of exons 1α and 2 had a higher loss rate (100%, 6/6) of p16INK4a mRNA than those of the methylation of the other exons (11.8%, 2/17, P&lt;0.01); the loss rate of p14ARF mRNA was 45.8%(22/48) in gastric cancer, and patients with the combined methylation of exons 1β and 2 had a higher loss rate (100%, 3/3) of p14ARF mRNA than those of the methylation of the other exons (15%, 3/20, P&lt;0.05). ⑤ The combined loss of p16INK4a and p14ARF mRNAs was examined in 1 (5.6%) of 18 patients of well and moderately-differentiated carcinomas, and 11 (36.7%) of 30 patients of poorly and not-differentiated carcinomas with a significant difference (P&lt;0.05). Conclusion p16INK4a and p14ARF genes are frequently inactivated by homozygous deletion and methylation of the 5’CpG islands in gastric cancer, which may play an important role in the carcinogenesis of gastric cancer.     

人脑胶质瘤组织P~(16INK4)蛋白的表达及其基因突变SSCP分析

目的 :探讨人脑胶质瘤组织 P16INK4蛋白低表达水平与胶质瘤恶性程度的关系及其基因突变的情况。方法 :采用免疫组化方法测定人脑胶质瘤标本 41例 ,同时采用新鲜胶质瘤组织标本1 5例进行 p1 6m RNA表达逆转录 PCR检测 ,并进行基因突变单链构象多态性分析 ( SSCP)。结果 :P1 6蛋白阳性表达 30例 ,阴性表达 1 1例 ,胶质瘤组织 p1 6m RNA表达水平相对低于对照组 ,p1 6基因外显子 2未发生基因突变 ,也未发生外显子 2的纯合缺失。结论 :胶质瘤组织p1 6m RNA和蛋白表达水平降低 ,并与其分级相关 ,提示 P1 6蛋白及其 m RNA异常是影响胶质瘤发生发展的重要因素 ,胶质瘤组织 p1 6基因突变率较低     

人结肠癌细胞中组蛋白乙酰化对细胞周期调节基因表达的影响

目的 研究组蛋白乙酰化对Colo-320和SW1116人结肠癌细胞系p21^WAF1和p16^INKRA基因表达的影响。方法 培养人结肠癌细胞系SW1116和Colo-320,分别以去甲基化制剂5-氮脱氧胞苷(5-aza-dC)和／或组蛋白脱乙酰化酶(HDAC)抑制剂曲古抑菌素(TSA)及丁酸钠(NaBu)干预细胞。运用流式细胞术检测细胞周期变化;以定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法研究控制细胞周期的基因p21^WAF1和p16^INKRA的表达;染色质免疫沉淀技术分析基因相关染色质乙酰化组蛋白的水平。结果 TSA或NaBu使人结肠癌细胞阻滞于G1期,而5-aza-dC并不能改变细胞周期。正常情况下,SW1116和Colo-320细胞中均有较弱的p16^INKRA表达;两种结肠癌细胞系p21^WAF1表达缺如。5-aza-dC干预后,p16^INKRA表达增强,相反p21^WAF1仍无明显表达。当该两个细胞系经TSA或NaBu处理后,p21^WAF1转录水平明显上调,并诱导p21^WAF1基因相关染色质乙酰化组蛋白H3和H4的积聚。结论 两种人结肠癌细胞系中,HDAC抑制剂通过选择性增加p21^WAF1基因相关染色质乙酰化水平,上调p21^WAF1基因的转录,并相应地导致结肠癌细胞生长停滞;而p16^INKRA基因表达主要受甲基化调节。     

p16INK4a在睾酮干预心肌细胞衰老中的作用及其机制

目的：探讨不同剂量睾酮对小鼠心肌细胞衰老的干预作用及可能机制。方法：用1μM、 100nM、10nM三种剂量睾酮干预自然衰老的小鼠心肌细胞,检测各组衰老相关β-半乳糖甘酶染色阳性细胞率,细胞周期分布,p16INK4a和雄激素受体(AR)mRNA及蛋白表达。结果：与衰老心肌细胞相比,1μM、100nM、10nM睾酮可剂量依赖性的降低衰老相关β-半乳糖甘酶染色阳性细胞率及细胞G0/G1期比例(P<0.05)。睾酮干预亦可剂量依赖性的下调p16INK4a mRNA及蛋白表达,这一作用可被雄激素受体阻断剂所阻断(P<0.05)。AR mRNA及蛋白表达与睾酮剂量呈负相关(P<0.05)。结论：1μM、100nM、10nM睾酮可剂量依赖性的抑制小鼠心肌细胞衰老,这一作用部分是由睾酮通过AR降低p16INK4a表达来实现的。     

胃癌组织中p16基因mRNA和p16蛋白的表达及临床病理意义

目的 探讨ｐ１６基因在胃癌发生发展及预后判断上的意义。方法 应用原位杂交和免疫组化方法检测６１例胃癌组织和４９例癌旁正常胃粘膜的ｐ１６ｍＲＮＡ和ｐ１６蛋白的表达。结果 （１）胃癌组织中ｐ１６ ｍＲＮＡ和ｐ１６蛋白的阳性率分别为５０．８％（３１／６１）,７０．５％（４３／６１）,而癌旁正常胃粘原阳性率均为１００％（４９／４９）,１０例早期胃癌均有ｐ１６ ｍＲＮＡ的蛋白,而分化较差、浸润深层的癌细胞则     

CDK2-AP1基因过表达对乳腺癌MCF-7细胞增殖及周期的影响

目的:通过过表达手段上调细胞周期调节蛋白依赖性激酶2- 关联蛋白1(CDK2-AP1) 基因在乳腺癌细胞MCF-7 中的表达, 并观察其对MCF-7 细胞生长和细胞周期调控的作用。方法:将CDK2-AP1 基因的编码框构建于慢病毒表达载体, 导入MCF-7 细胞, 应用实时定量PCR 和Western 印迹验证CDK2-AP1 基因mRNA 和蛋白的表达效率。利用M 法绘制生长曲线、克隆形成实验观察CDK2-AP1 基因过表达后MCF-7 细胞生长的变化, PI 染色流式细胞仪检测MCF-7 细胞周期的改变。通过Western 印迹检测CDK2-AP1 过表达后, 细胞周期相关蛋白(CDK2, CDK4, P16^Ink4A, P21^Cip1/Waf1) 的表达。结果:过表达CDK2-AP1 基因的慢病毒感染MCF-7 细胞可上调其mRNA 表达6.94 倍, 蛋白表达也十分显著地增高, 两者相一致。生长曲线显示MCF-7 细胞过表达CDK2-AP1 基因后, 增殖能力显著降低(P<0.05);克隆形成实验表明, 其形成的克隆数目同样显著减少(P<0.05);流式细胞仪检测证实MCF-7 细胞过表达CDK2-AP1 能够使细胞周期出现G₁期阻滞, 并且出现凋亡峰;CDK2-AP1 基因表达上调导致P21^Cip1/Waf1和P16^Ink4A蛋白表达上调, CDK2 和CDK4 蛋白表达下调。结论:CDK2-AP1 基因具有抑癌基因的功能, 在乳腺癌MCF-7 细胞过表达该基因能够抑制细胞的生长和克隆形成能力, 并且使细胞阻滞于G₁期。