骨髓间质干细胞定向分化的实验研究

为了探讨体外定向诱导人骨髓间质干细胞(MSC)分化为神经元样细胞的机制,本研究将分离的人MSC进行体外扩增培养,并观察脑心舒定向诱导MSC分化为类神经元样细胞的效应。在光镜下观察细胞形态,用免疫细胞化学法检测神经细胞特异性抗原标志。结果显示人MSC可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。脑心舒诱导120min后大部分MSC转变为神经元样细胞,出现胞体和突起,免疫细胞化学染色NSE、nestin呈阳性和GFAP阴性。上述结果提示人骨髓间质干细胞可在体外诱导分化为神经元样细胞。     

黄连素诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞

目的:黄连素体外定向诱导SD大鼠骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞。方法:用全骨髓细胞悬液体外扩增和纯化骨髓间质干细胞。选用第5代以后骨髓间质干细胞进行诱导分化,用含10 μg/L碱性细胞生长因子(bFGF)的完全培养液预诱导24 h,后更换含黄连素的无血清DMEM诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞。免疫组化鉴定神经元烯醇酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果:大鼠骨髓间质干细胞体外扩增第5代后细胞形态达到均一,成梭形。加黄连素诱导1h-8 h,间质干细胞胞体逐渐增大并伸出细长突起,形似神经细胞。免疫组化显示诱导的神经元样细胞NSE、NF表达阳性,GFAP阴性。结论:黄连素可诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞。     

丹参酮ⅡA定向诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞的研究

目的:丹参酮ⅡA体外定向诱导成人骨髓间质干细胞(MSC)分化为神经元样细胞。方法:采用Ficoll-Paque液离心和贴壁法分离成人MSC,体外扩增,流式细胞仪检测MSC表面抗原表达,FGF-2对MSC增殖和分化的影响。采用含丹参酮ⅡA的无血清达乐伯克改良必需基本培养基(DMEM)诱导MSC分化为神经元样细胞,免疫组化鉴定神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF-M)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、巢蛋白(nestin)的表达。结果:成人骨髓间质干细胞在体外扩增原代可获得0.5×10⁶,15代可获得(2-3)×10¹²个细胞,流式细胞仪检测结果显示CD29、CD44、CD90、CD105、CD166表达阳性,CD11a、CD14、CD34、CD38、CD45、CD80、CD86为阴性。FGF-2促进hMSC生长,并且对MSC的分化能力基本没有影响。丹参酮ⅡA诱导后,MSC胞体收缩,突起伸出;免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF-M、nestin表达阳性,GFAP阴性。结论:丹参酮ⅡA可以在体外诱导成人骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞。     

成人骨髓间质干细胞定向诱导为神经元样细胞的研究

目的：体外定向诱导成人骨髓间质干细胞(MSC)分化为神经元样细胞。方法：采用Ficoll-Paque液（1.077×10³ g/L）离心分离成人MSC,体外扩增,分别采用含巯基乙醇和硫代甘油等试剂的无血清DMEM诱导MSC分化为神经元。免疫组化鉴定神经元烯醇化酶（NSE）、神经丝蛋白（NF）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。结果：成人骨髓间质干细胞在体外扩增5代可获5×10⁷个细胞。加入巯基乙醇等或硫代甘油等诱导剂诱导后,MSC胞体收缩,突起伸出;免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF表达阳性,GFAP阴性。结论：成人骨髓间质干细胞在体外可以分化为神经元样细胞。     

黄芪诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞的研究

目的研究大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外分离和培养方法,并用黄芪体外诱导骨髓间充质干细胞分化为神经细胞样细胞。方法利用梯度离心从大鼠骨髓中分离单核细胞进行培养,去除不贴壁的细胞,分离纯化,对其生长特性进行分析。采用含黄芪的无血清L-DMEM诱导分化为神经细胞样细胞,观察细胞形态变化,用免疫组织化学方法检测分化细胞中巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果用含10%胎牛血清(FCS)的培养基培养,原代细胞贴壁生长,细胞形态均一,为纺锤形,有克隆团形成。传代培养时,形态变为成纤维细胞样,有较强的增殖能力。经黄芪诱导后,骨髓间充质干细胞形态发生改变,nestin、NSE和GFAP阳性,分化为神经元或胶质细胞样细胞。结论骨髓间充质干细胞可以体外分离、培养,在一定条件下向神经样细胞分化。     

胞内cAMP浓度的增加可诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞

目的:探讨胞内cAMP浓度的增加与骨髓间质干细胞 (MSC)分化为神经元样细胞的关系。方法:采用Ficoll-Paque液 (1077g/L)离心分离成人MSC,体外扩增,采用含腺苷酸环化酶激动剂Forskolin及磷脂酶抑制剂 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 (IBMX)的无血清DMEM诱导MSC分化为神经元。免疫组化鉴定神经元烯醇化酶 (NSE)、神经丝蛋白 (NF)、胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)的表达。结果:成人骨髓间质干细胞在体外扩增原代可获得 5×10⁵,10代可获得 2×10¹⁰ 个细胞。加入Forskolin、IBMX以及两者联用诱导后,MSC胞体收缩,突起伸出,呈典型神经元样形态;免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF-M表达阳性,GFAP阴性。结论:胞内cAMP浓度的增加可诱导成人骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞.     

胎儿骨髓间质干细胞体外诱导为神经细胞的初步实验研究

目的：体外定向诱导胎儿骨髓问质干细胞(MSC)分化为神经细胞。方法：采用Ficoll淋巴细胞分离液分离MSC，体外扩增、传代，采用β-巯基乙醇等诱导剂诱导MSC分化为神经细胞，免疫组化鉴定神经丝蛋白(NF200)、神经元烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)，并且用RT-PCR鉴定NF200、NSE和GFAP的mRNA表达情况。结果：胎儿骨髓MSC在体外扩增第5代以后，经诱导后，形态学上可呈现神经细胞形态特征；免疫组化显示诱导出的神经细胞NF200、NSE和GFAP均有阳性表达；RT-PCR也显示诱导后表达量明显增加。结论：胎儿骨髓MSC在体外可以分化为神经细胞。     

川芎嗪诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞的研究

目的用川芎嗪(ligustrazin hydrochloride)在体外定向诱导SD青年鼠骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells，rMSCs)分化为神经元样细胞。方法用低糖DMEM冲洗骨髓腔，收集骨髓细胞悬液，接种在塑料培养瓶中。经体外扩增、纯化，选用第5代后的骨髓间质干细胞进行诱导分化。用10μg／LbFcF预诱导24h，更换成含川芎嗪的无血清培养基DMEM诱导间质干细胞分化为神经元样细胞。用免疫组织化学SABC法鉴定神经丝蛋白(NF—M)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、巢蛋白(nestin)、微管联合蛋白-2(MAP-2)、生长相关蛋白-43(GAP-43)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果第5代间质干细胞形态达到均一，呈梭形。用川芎嗪诱导15min到3h，间质干细胞胞体逐渐增大，并伸出细长突起形似神经元样细胞。免疫组织化学显示NF-M、NSE、nestin、MAP-2和GAP-43表达阳性，而GFAP阴性。对照组上述染色均为阴性。结论川芎嗪可诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞。     

麝香多肽体外诱导成年大鼠和人骨髓间充质干细胞定向分化为神经元的研究

目的:观察麝香多肽体外定向诱导成年大鼠和人骨髓间质干细胞(Bonemarrowmesenchymalstemcells,BMMSCs)分化为神经元的能力。方法:采用含100-150mg/L麝香多肽的无血清L-DMEM培养基诱导成年大鼠和人BMMSCs分化为神经元,免疫组化鉴定神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、神经巢蛋白(nestin)的表达。结果:成年大鼠和人BMMSCs在加入含麝香多肽的无血清L-DMEM培养基诱导后,BMMSC胞体收缩,突起伸出,形似神经元;免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF、nestin表达阳性,GFAP阴性。结论:麝香多肽可以在体外诱导成年大鼠和人BMMSCs定向分化为神经元。     

三七总皂甙和维甲酸联合诱导大鼠MSCs分化为神经元样细胞

目的： 体外探讨三七总皂甙、维甲酸对大鼠骨髓间质干细胞（MSCs）分化为神经元样细胞的影响。 方法： 以三七总皂甙和维甲酸为诱导条件诱导大鼠MSCs分化，免疫细胞化学检测分化细胞的神经元特异性烯醇化酶（NSE）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、乙酰胆碱酯酶（AchE）、γ-氨基丁酸（GABA）、酪氨酸羟化酶（TH）的表达情况。 结果： 免疫细胞化学显示MSCs诱导后具有神经细胞的形态， NSE、AchE、GABA、TH有阳性表达，GFAP表达为阴性。 结论： 三七总皂甙和维甲酸联合应用对大鼠骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞及在提高其分化率中起着重要作用。     

丹参诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化

目的:探讨骨髓间充质干细胞(marrow stromal stem cells,MSCs)向神经细胞分化中神经蛋白分子及相关基因的表达情况。方法:分离提取大鼠的MSCs,体外培养扩增。用含丹参的无血清的L-DMEM培养基进行诱导,并以不含丹参的无血清L-DMEM培养基作为对照。提取两组的MSCs总RNA,RT-PCR检测ngn-1、mash-1的表达。结果:丹参诱导90 min后,细胞发生了明显的形态学变化,大多数细胞转变为类似双极或多极神经元样形态,伸出轴突或树突样突起。免疫细胞化学显示诱导后的MSCs表现为nestin、NSE、GFAP染色阳性,对照组为阴性。未经诱导的MSCs ngn-1,mash-1 mRNA为阴性,诱导后有表达。结论:丹参可诱导大鼠MSCs向神经前体细胞和神经细胞分化。MSCs向神经元样的分化可能与ngn-1,mash-1有关。     

骨髓间充质干细胞向神经细胞分化后免疫原性研究

目的:通过体外天麻诱导人骨髓间充质干细胞(Human mesenchymal stem cells,hMSCs)向神经元样细胞分化,验证其多能分化特性,检测分化后细胞的免疫原性.方法:通过贴壁法分离hMSCs,体外扩增培养.天麻定向诱导分化为神经元样细胞.光镜下观察细胞形态,免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志物神经元烯醇化酶(NSE)、巢蛋白(Nestin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.流式细胞术(FCM)检测分化后细胞HLA-DR表达,用单向混合淋巴细胞反应(MLR)的方法检测神经细胞分化的hMSCs是否引起人外周血淋巴细胞增殖反应(Human peripheral blood lymphocytes,hPBLs).结果:hMSCs可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增.天麻诱导3小时后大部分hMSCs转变为神经元样细胞,出现胞体和突起.免疫细胞化学染色NSE及Nestin呈阳性,GFAP阴性.流式细胞术显示hMSCs向神经细胞分化后HLA-DR表达阴性,混合培养结果也显示分化hMSCs不引起hPBLs增殖反应.结论:天麻可在体外诱导hMSCs分化为神经元样细胞,分化hMSCs不引起人淋巴细胞增殖反应,具有低免疫原性.     

Wnt3a促进大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化

目的:寻找促进骨髓间充质干细胞(MSCs)向神经元样细胞分化的Wnt信号分子。方法:首先体外分离培养大鼠MSCs并传代,形态学观察和流式细胞学检测细胞表型CD44、CD9、CD34和CD45。采用bFGF分别联合Wnt3a或Wnt5a的方案诱导分化。免疫组化和RT-PCR的方法比较Wnt3a和Wnt5a对MSCs向神经元样细胞分化的影响。结果:MSCs为长梭形,CD9、CD44高表达,CD34、CD45低表达。Wnt3a诱导组的Nestin和NSE呈阳性,而GFAP无明显表达,诱导后细胞的活力良好。Wnt5a诱导组Nestin呈弱阳性表达,而NSE及GFAP阴性。RT-PCR结果显示Wnt3a诱导组Nestin在诱导前后均有表达,NSE在诱导后5d可见明显的扩增条带,10d后更加明显。GFAP在诱导10d后出现较弱的扩增条带。Wnt5a组、对照组MSCs在诱导后10dNestin有微弱表达,NSE和GFAP几乎无表达。结论:Wnt3a分子能够促进体外培养的MSCs向神经元样细胞分化。     

黄芩甙体外诱导大鼠骨髓基质细胞成为神经细胞

目的:探讨黄芩甙体外诱导成年大鼠骨髓基质细胞(MSCs)分化为神经细胞的条件。方法:采用黄芩甙诱导6h后,继续维持诱导6d。免疫细胞化学染色评价神经细胞特异性烯醇化酶(NSE)、神经微丝(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和波形蛋白(vimentin)的表达率;Hoechst33258染色评价细胞存活率。结果:诱导6d后MSCs形态改变,胞体成锥形,突起交织成网。免疫细胞化学染色NSE、NF、GFAP和vimentin表达率分别为70.5%±11.6%,68.3%±13.4%,＜1%,＜1%,细胞存活率为88.4%±5.0%。结论:黄芩甙可以诱导成年大鼠MSCs在体外分化成为神经细胞,该方法将为神经系统细胞移植和基因治疗提供新的思路。     

天然脑活素定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的实验研究

目的： 探讨天然脑活素（NC）诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)向神经元样细胞分化的作用。方法: 取6-8周龄SD大鼠,无菌获取胫骨和股骨骨髓,全骨髓贴壁筛选法分离培养并纯化大鼠MSCs,应用天然脑活素诱导MSCs向神经元分化。倒置相差显微镜追踪比较观察分化过程中细胞形态的变化,免疫细胞化学和逆转录-聚合酶链反应 (RT-PCR)方法检测神经元特异性标志物：巢蛋白（nestin）、神经元特异性烯醇化酶(NSE) 、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达情况。免疫细胞化学检测细胞微管相关蛋白-2(MAP-2)的表达。结果：经全骨髓贴壁筛选法获得了纯度较高（90%以上）的大鼠MSCs,天然脑活素含药血清诱导分化后的细胞呈现双极、多极和锥形的典型神经元细胞的形态,分别从mRNA和蛋白水平上证实诱导分化后的细胞表达神经元标记物NSE和nestin,不表达神经胶质细胞标记物GFAP。诱导分化后细胞MAP-2的表达明显。结论：天然脑活素可诱导MSCs向神经元样细胞的定向分化。