吡格列酮对高糖诱导大鼠腹膜间皮细胞合成细胞外基质的作用及机制

目的　观察过氧化物酶体增殖物活化受体γ配体吡格列酮对高糖作用下大鼠腹膜间皮细胞（RPMC）合成细胞外基质的作用以及调节机制。 方法 胰蛋白酶消化法分离培养RPMC。随机分为正常对照组、高糖组（2.5%葡萄糖）、吡格列酮干预组（10 μmol/L、20 μmol/L+2.5%葡萄糖）、二硫氨基甲酸吡咯烷干预组（PDTC,NF-κB抑制剂,25 μmol/L、50 μmol/L+2.5%葡萄糖）、姜黄素干预组[活化蛋白1（AP-1）抑制剂,15 μmol/L、30 μmol/L+2.5%葡萄糖]。RT-PCR方法检测纤连蛋白（FN）、Ⅰ型胶原（COLⅠ）、纤溶酶原激活抑制因子1（PAI-1）、c-fos、c-jun mRNA表达。ELISA方法检测细胞上清液中FN、COLⅠ和PAI-1蛋白水平。Western印迹方法检测IκBα、磷酸化IκBα（p-IκBα）、NF-κBp65、磷酸化NF-κBp65 （p-p65）蛋白表达。 结果 常规培养的腹膜间皮细胞表达基础量的FN、COLⅠ和PAI-1,高糖显著上调其蛋白及mRNA表达（P < 0.01）。吡格列酮预处理后,高糖诱导的FN、COLⅠ和PAI-1蛋白及mRNA表达显著低于高糖组（P < 0.01）。高糖作用后,磷酸化IκBα和NF-κBp65水平显著增高,c-fos、c-jun mRNA表达增加,与对照组差异有统计学意义（P < 0.01）。PDTC预处理后,高糖诱导RPMC的FN和PAI-1蛋白水平降低（P < 0.01）,COLⅠ蛋白表达无明显变化。AP-1抑制剂姜黄素预处理后,高糖诱导的RPMC FN、COLⅠ和PAI-1蛋白水平均显著降低,与对照组差异有统计学意义（P < 0.01）。吡格列酮抑制高糖条件下磷酸化IκBα和NF-κB p65水平,抑制c-fos、c-jun mRNA表达（P < 0.05或P < 0.01）。 结论 NF-κB和AP-1信号通路参与高糖条件下RPMC的FN、COLⅠ和PAI-1表达的调节。吡格列酮通过NF-κB 和AP-1途径下调高糖诱导的RPMC的FN、 COLⅠ和PAI-1的表达,从而发挥抗纤维化作用。     

PPARγ活化对TGF-β1诱导肾小管上皮细胞趋化因子表达的干预作用

目的：观察PPARγ活化对转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导的肾小管上皮细胞炎症相关趋化因子表达的影响,探讨其在肾脏纤维化中的干预作用。方法：体外培养肾小管上皮细胞HK-2,LDH法检测15d-PGJ2和TGL对HK-2的细胞毒性,应用不同浓度的15d-PGJ2和TGL作用于TGF-β1诱导下的HK-2细胞,应用实时荧光定量PCR技术和ELISA方法检测趋化因子单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、白细胞介素-8（IL-8）表达的变化。结果：5μmol/L15d-PGJ2和2.5μmol/LTGL不影响HK-2细胞MCP-1和IL-8mRNA基础表达和蛋白分泌。TGF-β1作用24h时,2.5μmol/L和5μmol/L15d-PGJ2及2.5μmol/LTGL均能有效干预TGF-β1诱导的MCP-1mRNA表达和蛋白的分泌（P〈0.05）。IL-8的表达与MCP-1相似,2.5μmol/L和5μmol/L15d-PGJ2能显著抑制TGF-β1诱导的IL-8表达,TGF-β1诱导24h时2.5μmol/LTGL能显著抑制IL-8mRNA表达（P〈0.05）。结论：PPARγ激动剂15d-PGJ2和TGL作用均能有效干预TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞趋化因子MCP-1和IL-8的表达,可能具有有效干预肾间质炎症作用。     

乌司他丁对高糖作用下大鼠腹膜间皮细胞白细胞介素15、结缔组织生长因子及丙二醛表达的影响

目的 研究乌司他丁（UTI）对高糖作用下大鼠腹膜间皮细胞（RPMC）白细胞介素15（IL-15）、结缔组织生长因子（CTGF）及丙二醛（MDA）表达的影响。 方法 胰蛋白酶消化法原代和传代培养RPMC,经鉴定后第3代用于实验。按数字随机表法分为 (1)正常对照组;(2)高糖组：不同浓度高糖（1.5%、2.5%、4.25%）作用6 h、12 h;2.5%高糖分别作用于RPMC 3、6、12、24 h;(3)UTI组：不同浓度的UTI（160、320、640 U/ml）作用30 min后分别加2.5%高糖作用12 h。实时定量PCR法测IL-15 mRNA的表达。ELISA法检测细胞培养上清液中IL-15和CTGF的含量。硫代巴比妥法测上清液中MDA的蛋白含量。 结果 与正常对照组相比,高糖可刺激RPMC IL-15 mRNA及蛋白的表达增高,且在12 h内呈时间、剂量依赖性（P < 0.05）;高糖诱导RPMC CTGF蛋白的表达增高,在12 h内呈时间、剂量依赖性（P < 0.05）;高糖诱导MDA的蛋白含量升高,且呈剂量依赖性（P < 0.05）。与高糖组相比,UTI能显著降低高糖所致的腹膜间皮细胞IL-15、CTGF和MDA的表达（均P < 0.05）。 结论 高糖可上调RPMC IL-15、CTGF及MDA的表达;UTI可抑制高糖所致的IL-15、CTGF和MDA的过度表达。     

PPARγ激动剂对腹膜透析相关性急性腹膜炎大鼠PPARγ、Toll样受体4表达及STAT1信号活化的影响

目的 观察过氧化物酶体增殖物活化受体γ(PPARγ)激动剂罗格列酮和15脱氧前列腺素J2（15d-PGJ2）对脂多糖（LPS）诱导大鼠腹膜透析相关性急性腹膜炎模型腹膜组织PPARγ、Toll样受体4（TLR4）表达、STAT1活化及腹腔局部炎性反应的影响。 方法 24只雄性SD大鼠随机分成4组，每组6只。对照组：腹腔注入4.25%葡萄糖乳酸盐腹膜透析液（简称腹透液，90 ml/kg）；LPS组：LPS 1 mg/kg腹腔注入4 h后，再注入腹透液；罗格列酮+ LPS组（罗格列酮组）：罗格列酮20 mg&#8226;kg-1&#8226;d-1灌胃预处理3 d，注入LPS及腹透液；15d-PGJ2 + LPS组（15d-PGJ2组）：15d-PGJ2 0.3 mg&#8226;kg-1&#8226;d-1腹腔注入预处理3 d，注入LPS及腹透液。注入腹透液4 h后处死大鼠，留取腹水、壁层及脏层腹膜组织。ELISA法检测腹水中IL-6浓度。常规行腹膜组织Masson染色和腹水白细胞计数。RT-PCR检测腹膜组织PPARγ、TLR4 mRNA的表达；Western印迹法检测腹膜组织PPARγ、TLR4、磷酸化（p）-STAT1、STAT1蛋白的表达。 结果 LPS组大鼠腹水IL-6浓度[268.53（201.87～335.19） ng/L]高于对照组[147.62（130.60～164.64） ng/L）]（P < 0.01）；罗格列酮组大鼠腹水IL-6浓度[110.20（77.60～142.80） ng/L]低于LPS组（P < 0.05）。与对照组比较，LPS组大鼠腹膜组织明显水肿，腹膜组织PPARγ、TLR4 mRNA及蛋白表达均显著增强（P < 0.05）。与LPS组相比，罗格列酮组大鼠腹膜组织水肿明显减轻，PPARγ、TLR4 mRNA表达显著增高（P < 0.05），但其蛋白表达显著减弱（P < 0.05）。15d-PGJ2组大鼠腹膜组织水肿明显减轻，PPARγ mRNA及其蛋白表达均显著减弱（均P < 0.05），TLR4 mRNA表达显著增强（P < 0.01），但其蛋白表达减弱（P < 0.05）。各组间腹水白细胞计数差异无统计学意义。罗格列酮、15d-PGJ2均明显上调LPS诱导的p-STAT1表达（P < 0.01）。 结论 罗格列酮和15d-PGJ2可负性调节LPS诱导的大鼠急性腹膜炎性反应，并对LPS信号通路中相关功能蛋白起一定的调控作用。     

过氧化物酶体增殖物激活受体γ激动剂拮抗人皮肤成纤维细胞转化生长因子β1机制研究

目的 了解过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)激动剂拈抗TGF-β1促皮肤瘢痕化的效应机制.方法 体外培养正常成人皮肤Fb,根据培养基中所加刺激物不同分为空白对照组(无血清DMEM培养基),TGF-β1组(DMEM培养基加入含终浓度10 ng/mL TGF-β1作用48 h),曲格列酮组(DMEM培养基加入含终浓度10μmol/L曲格列酮作用2 h,再加入10 ng/mL TGF-β1作用48h),15-脱氧前列腺素J2(15d-PGJ2)组(DMEM培养基加入含终浓度10 μmol/L 15d-PGJ2作用2 h,再加入10 ng/mL TGF-β1作用48 h).应用蛋白质印迹法检测结缔组织生长因子(CTGF)的表达,实时荧光RT-PCR检测CTGF、基质金属蛋白酶1(MMP-1)及血小板源性生长因子(PDGF)的mRNA水平变化.对数据进行单因素方差分析.结果 TGF-β1组的CTGF蛋白和mRNA表达水平均高于空白对照组,曲格列酮组和15d-PGJ2组的CTGF蛋白及mRNA表达水平低于TGF-β1组.空白对照组、TGF-β1组、曲格列酮组、15d-PGJ 2组MMP-1 mRNA表达水平分别为1.281±0.195、0.193±0.051、0.417±0.043、0.485±0.027,其中TGF-β1组低于空白对照组(F=12.811,P＜0.01),曲格列酮组、15d-PGJ2组高于TGF-β1组(F=12.811,P值均小于0.01).空白对照组、TGF-β1组、曲格列酮组、15d-PGJ2组PDGF mRNA表达水平分别为0.349±0.057、1.044±0.237、0.677±0.055、0.511±0.017,其中TGF-β1组高于空白对照组(F=16.848,P＜0.01),曲格列酮组、15d-PGJ2组低于TGF-β1组(F=16.848,P值均小于0.01).结论 激活后的PPARγ对TGF-β1下游反应因子CTGF的抑制作用,可能是其拮抗TGF-β1促皮肤瘢痕化的主要机制,而对细胞因子MMP-1、PDGF的影响可能也是其机制之一.     

RhoA-Rock信号通路在转化生长因子β1诱导大鼠腹膜间皮细胞转分化中的作用

目的　探讨RhoA-Rock信号通路在转化生长因子β1（TGF-β1）诱导大鼠腹膜间皮细胞（RPMC）转分化中的作用。 方法　体外培养SD大鼠原代腹膜间皮细胞,静止24 h后,采用随机数字表法随机分为以下4组：正常对照组、TGF-β1（10 μg/L）刺激组、TGF-β1（10 μg/L）＋Y-27632（Rock特异性抑制剂,10 μmol/L）组（Y-27632预处理2 h）、Y-27632（10 μmol/L）组。用TGF-β1（10 μg/L）刺激RPMC不同时间,观察α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）,E钙黏素（E-cadherin）、Ⅰ型胶原（ColⅠ）的表达。RT-PCR法检测E-cadherin、α-SMA 和ColⅠmRNA表达。Western印迹法检测RhoA（包括总RhoA及活化的RhoA）、E-cadherin、α-SMA、ColⅠ和波形蛋白（vimentin）表达。活化的RhoA由膜蛋白提取试剂盒提取。 结果 （1）TGF-β1（10 μg/L）刺激RPMC能诱导RhoA活化,于10 min开始出现活性升高,为对照组的（2.57±0.52）倍（P < 0.05）;1 h达高峰,为对照组的（4.35±0.41）倍（P < 0.05）。（2）TGF-β1（10 μg/L）刺激RPMC能导致E-cadherin mRNA和蛋白表达下调,α-SMA、ColⅠmRNA和蛋白表达上调,呈时间依赖性。（3）Rock特异性抑制剂Y-27632能显著下调α-SMA、ColⅠmRNA的表达,较TGF-β1刺激组各降低了53.8%和55.7%（均P < 0.05）,并且能下调α-SMA、ColⅠ和vimentin蛋白的表达,较TGF-β1刺激组分别降低了42.6%、60.1%和58.1%（均P < 0.05）,但不能上调E-cadherin mRNA和蛋白的表达。 结论　TGF-β1可通过RhoA-Rock信号通路介导大鼠腹膜间皮细胞转分化,抑制该通路可作为防治腹膜纤维化的潜在靶点。     

15-脱氧-△12,14-前列腺素J2对胃癌细胞生长的抑制作用

目的 探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）的配体15-脱氧-△^12，14-前列腺素J2（15d-PGJ2）对人胃癌MGC803细胞生长的影响。方法 逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）及Survivin mRNA表达，Western blot检测PPART、Survivin蛋白的表达。噻唑蓝（MTT）比色法及流式细胞术检测增殖、凋亡。Hoechst33342染色观察凋亡的形态学变化。结果 PPARγ mRNA和蛋白在MGC803细胞均表达，15d-PGJ2（5、10、20、30和40μmol／L）抑制MGC803细胞增殖和诱导其凋亡，增殖抑制率和凋亡率随浓度的增加和时间的延长而升高。MGC803细胞Survivin mRNA和蛋白表达随15d-PGJ2作用浓度的升高而降低。结论 15d-PGJ2可能通过诱导凋亡抑制人胃癌MGC803细胞的生长，Survivin mRNA和蛋白表达变化在此过程中起重要作用，提示15d-PGJ2可能对治疗胃癌有效。     

白细胞介素1β对肾小管上皮细胞过氧化物酶体增殖蛋白激活性受体γ及辅调节因子表达的影响

目的 探讨白细胞介素1β（IL-1β）介导的炎性反应中过氧化物酶体增殖蛋白激活性受体γ（PPARγ）及其辅调节因子的表达变化,分析其相互作用机制。 方法 体外培养人肾小管上皮细胞（HK-2）,应用IL-1β作用于HK-2细胞,收集细胞总mRNA、胞核蛋白和细胞培养上清液。应用实时定量PCR、Western印迹法、ELISA法、凝胶电泳迁移率实验（EMSA）法分别从mRNA水平、蛋白质水平、DNA结合活性水平检测PPARγ及其辅调节因子（包括辅激活因子和辅抑制因子）和单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）的表达变化。 结果 不同浓度的IL-1β（0~20 μg/L）刺激24 h后,PPARγ、辅激活因子SRC-1、SRC-2和PGC-1 mRNA表达水平均呈总体下调趋势（P < 0.05）,同时辅抑制因子NCoR呈显著上调趋势（P < 0.05）。以10 μg/L作为IL-1β最佳刺激浓度,SRC-2和PGC-1的mRNA水平在刺激1 h后就分别显著下调了57％（P < 0.01）和48％（P < 0.01）;SRC-1的mRNA水平在刺激2 h后显著下调了43％（P < 0.05）,而PPARγ在刺激4 h时下调了55％（P < 0.01）;NCoR在刺激8 h后出现显著上调（为对照组的2.17倍,P < 0.05）,之后又缓慢下降,至24 h仍高于对照组,但差异无统计学意义。Western印迹结果显示,PPARγ的蛋白表达在IL-1β（10 μg/L）刺激4 h后出现显著下降。ELISA结果显示MCP-1的分泌水平呈持续增高,8 h后达到最高值[（160.56 ± 2.8） ng/L,P < 0.01],至24 h仍为（50.82± 1.25） ng/L（P < 0.01）。EMSA结果显示PPARγ的DNA结合活性呈总体减弱趋势,至24 h达到最低值,而NF-κB的DNA结合活性均呈总体增强趋势,至24 h达到高峰。 结论 在肾脏炎性反应进程中,IL-1β诱导的NF-κB炎性通路激活可引起PPARγ及辅激活因子的表达下调,MCP-1和辅抑制因子的表达上调。不仅PPARγ,其辅调节因子也积极参与肾脏炎性反应。     

ERK1/2信号通路在甲状旁腺激素致人近曲小管上皮细胞分泌纤溶酶原激活物抑制剂1中的作用

目的 从体外观察ERK信号通路在甲状旁腺激素（PTH）致人近曲小管上皮细胞（HK-2）合成纤溶酶原激活物抑制物1（PAI-1）中的作用。 方法 以HK-2细胞株为研究对象,用不同浓度PTH（10-8、10-9、10-10、10-11、10-12 mol/L）作用细胞48 h,以及10-10 mol/L PTH作用细胞不同时间（12、24、36、48、72 h）,分别用RT-PCR法检测PAI-1 mRNA表达,Western印迹法检测PAI-1蛋白表达。以10-10 mol/L PTH作用细胞48 h,分别观察细胞ERK1/2抑制剂预处理前后磷酸化（p）ERK1/2、PAI-1mRNA及蛋白的变化情况。 结果 10-12 mol/L PTH可促进细胞在基因及蛋白水平合成PAI-1,随着PTH浓度逐渐上升,PAI-1mRNA及蛋白浓度均相应增加,以10-10 mol/L PTH组刺激作用最显著,分别为对照组的4.01倍和3.81倍（均P < 0.01）。但随着PTH浓度进一步增加,PAI-1mRNA及蛋白浓度却随之下降。10-10 mol/L PTH作用细胞,12 h时有少量PAI-1表达,72 h时达峰值,并呈时间依赖性,分别为0 h组的4.06倍和4.03倍（均P < 0.01）。10-10 mol/L PTH作用细胞48 h,有大量的p-ERK1/2合成（P < 0.01）,经ERK1/2抑制剂预处理后,PAI-1及ERK均显著下降（均P < 0.01）,但仍高于对照组（均P < 0.05）。 结论 ERK信号通路部分参与PTH致HK-2细胞合成PAI-1的作用。     

过氧化物酶增殖物激活受体γ减少血管紧张素Ⅱ诱导的系膜细胞外基质的积聚及其作用机制

目的 探讨过氧化物酶增殖物激活受体(PPAR)γ1对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的系膜细胞外基质积聚的抑制作用及其机制。方法 脂质体转染质粒pIRES2-EGFP-PPARγ1/WT(野生型)于系膜细胞，给予AngⅡ(10-7 mol/L)刺激48 h。采用RT-PCR检测TGF-β1、PAI-1、c-fos、c-jun mRNA表达水平。采用ELISA法检测细胞上清液中TGF-β1和FN浓度。Western印迹观察胞浆中I-κB、NF-κB及胞核中NF-κB、pERK蛋白表达水平。利用PPARγ与PPRE结合活性测定PPARγ1在系膜细胞中的活性。同时以PPARγ激动剂吡格列酮(6 μmol/L)、不具有目的基因PPARγ1的空白质粒pIRES2-EGFP和表达功能缺陷-突变型(DN)PPARγ1的质粒pIRES2-EGFP-mPPARγ1/DN作为对照。结果 PPARγ1过表达能显著性抑制AngⅡ诱导的系膜细胞TGF-β1、PAI-1的mRNA高表达(P < 0.05)，同时下调c-fos和c-jun mRNA高表达(P < 0.05)。转染PPARγ1/WT能显著降低AngⅡ 48 h刺激下细胞上清液中FN和TGF-β1浓度(P < 0.05)。在AngⅡ作用下系膜细胞AT1表达增加(P < 0.05)， PPARγ1可显著性减少AT1的高表达(P < 0.05)。AngⅡ诱导的系膜细胞pERK表达明显升高， PPARγ1可显著性减少pERK表达(P < 0.05)。转染PPARγ1/WT能上调AngⅡ刺激下系膜细胞胞浆中I-κB低表达，同时下调NF-κB由胞浆向细胞核的转移(P < 0.05)。转染PPARγ1/DN并无上述作用。吡咯列酮具有与PPARγ1相同的显著性效应。PPARγ1/WT转染组PPARγ1的活性明显高于其他组(P < 0.05)。结论 PPARγ1过表达能够抑制AngⅡ刺激下系膜细胞外基质的聚积，降低AT1受体蛋白表达，具有直接抗硬化的非代谢性效应，其机制可能是通过抑制ERK/AP-1及NF-κB等信号分子的传递。     

转化生长因子β1在大鼠腹膜间皮细胞中的促炎作用

目的 探讨转化生长因子β1（TGF-β1）在大鼠腹膜间皮细胞（RPMC）中的促炎作用及机制。 方法 用TGF-β1（10 μg/L）刺激体外培养的RPMC,观察其对RPMC中单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）表达的影响。体外转染Smad7和pcDNA3空载体至RPMC后,观察 TGF-β1（10 μg/L）对RPMC MCP-1和p38表达的影响。用p38抑制剂SB203580（10 μmol/L）预处理RPMC后,加入TGF-β1（10 μg/L）,观察阻断p38信号通路对MCP-1表达的影响。 结果RT-PCR结果显示,3 h、6 h、12 h、24 h TGF-β1刺激组腹膜间皮细胞MCP-1表达均显著高于0 h对照组（P < 0.05）,6 h刺激组MCP-1表达达高峰（P < 0.01）。ELISA结果显示,6 h、12 h、24 h、48 h TGF-β1刺激组MCP-1表达增多（P < 0.05）,48 h表达达高峰（P < 0.01）。上调表达Smad7和p38抑制剂SB203580都能明显抑制TGF-β1刺激RPMC产生和分泌MCP-1的作用,与pcDNA3空载体组比较,Smad7治疗组MCP-1的表达显著下调（P < 0.05）;与TGF-β1刺激组比较,SB203580治疗组MCP-1的表达显著下调（P < 0.01）。TGF-β1能活化p38磷酸化的过程,上调Smad7可抑制TGF-β1对它们的激活反应;与正常对照组比较,TGF-β1刺激组磷酸化（p）-p38的表达显著上调（P < 0.05）;与TGF-β1刺激组比较,Smad7治疗组p-p38的表达显著下调（P < 0.05）。 结论 TGF-β1能促进RPMC MCP-1的表达,其促炎作用可能是通过激活p38MAPK信号通路介导的。     

腹膜透析患者肾素血管紧张素Ⅱ水平变化及其在腹膜纤维化中的意义

目的 探讨持续性非卧床腹膜透析（CAPD）患者血浆及腹腔局部肾素血管紧张素系统（RAS）的变化及其在腹膜纤维化中的意义。 方法 选取腹透感染组和非感染组CAPD患者25例，非感染患者根据透析龄分为≥6月组和＜6月组。应用放射免疫法检测CAPD患者腹透透出液和血浆中肾素及血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）的浓度。以不同浓度D-葡萄糖（0.3%、1.5%、2.5%）、甘露醇（1.5%、2.5%）及AngⅡ（0、1、10、100、1000 nmol/L）刺激大鼠腹膜间皮细胞（RPMC），放射免疫法检测细胞上清液AngⅡ浓度变化；实时定量PCR方法观察AngⅡ 1型受体（AT1）、血管紧张素转化酶（ACE）、转化生长因子β1（TGF-β1）、结缔组织生长因子（CTGF）mRNA的表达； Western印迹法检测TGF-β1及CTGF蛋白的表达；ELISA法检测上清液中TGF-β1的变化。 结果 CAPD患者腹透透出液中未检测到肾素。感染及≥6月组的CAPD患者透出液中AngⅡ的浓度分别为（151.99±114） pmol/L和（14.17±41.5） pmol/L，分别为非感染[（7.98±12.69） pmol/L]及＜6月组[（2.18±5.62） pmol/L]的19倍及6.5倍（P < 0.01或P < 0.05）。高糖腹透液（2.5％）注入4 h后，CAPD患者循环中肾素及AngⅡ浓度分别为[（4.30±8.48）和（54.19±34.43） pmol/L]，是基础水平的4.06倍和1.21倍（P < 0.01）。高糖组（2.5％）RPMC AT1、ACE mRNA和上清液AngⅡ浓度分别为低糖组（0.3％）的2.61、2.62和2.01倍（P <0.05）。AngⅡ可在mRNA和蛋白水平上调RPMC表达TGF-β1与CTGF，呈剂量依赖性，100 nmol/L组TGF-β1 mRNA及蛋白水平分别为对照组的2.8和2.19倍（P < 0.05）；1000 nmol/L组CTGF mRNA及蛋白水平分别为对照组的4.48倍和2.82倍（P < 0.05）。AngⅡ促进RPMC分泌TGF-β1，呈时间依赖性，刺激24 h组TGF-β1的表达量为基础值的3.65倍（P < 0.05）。 结论 CAPD尤其是腹透感染或长期腹透患者存在RAS活化状态。RAS的主要效应因子AngⅡ可通过上调间皮细胞表达和分泌致纤维化细胞因子参与腹膜纤维化。阻断RAS可能成为预防和治疗腹膜纤维化的新靶点。     

腹膜间皮细胞过氧化物酶体增殖物活化受体γ的表达及其配体对CD40和细胞间黏附分子1的影响

目的观察过氧化物酶体增殖物活化受体γ（PPAR-γ）在大鼠腹膜间皮细胞（RPMCs）中的表达以及脂多糖（LPS）的调节作用，并探讨PPAR-γ天然配体15d-PGJ2及人工合成配体ciglitazone对RPMCs表达CD40和ICAM-1的影响。方法分离及培养RPMCs，常规传代及鉴定，取第2代细胞用于实验研究。LPS不同浓度（0．1、1．0、10、50及100μg／ml）、LPS（1μg／ml）处理后不同时间点及15d-PGJ2（3μmol／L）、ciglitazone（10μmol／L）作用细胞36h后收集细胞。RT-PCR检测PPAR-γ、CD40以及ICAM-1 mRNA表达。免疫细胞化学检测PPAR-γ在RPMCs中的分布。Western印迹检测PPAR-γ及ICAM-1蛋白表达。结果（1）常规培养的RPMCs表达一定量PPAR-γ，表达部位主要分布于RPMCs细胞核内，在细胞浆微弱表达。（2）随着LPS浓度逐渐增大，PPAR-γ蛋白表达水平呈逐渐增高的趋势，LPS浓度为10μg／ml时其表达为最高峰。LPS（1μg／ml）作用12h时PPAR-γ蛋白表达最强，PPAR-γ1表达高于PPAR-γ2；之后显著降低，持续至72h。（3）LPS刺激后RPMCs CD40mRNA表达显著增强；15d-PGJ2、ciglitazone显著降低CD40 mRNA表达（P均〈0．01）。（4）LPS刺激后RPMCs ICAM-1蛋白表达显著增加：15d-PGJ2增加LPS介导的ICAM-1 mRNA表达（P〈0.01），但显著抑制ICAM-1蛋白表达（P〈0．05）。ciglitazone对LPS介导的ICAM-1 mRNA和蛋白表达均有显著抑制作用（P均〈0．05）。结论RPMCs结构性表达PPAR-γ。LPS调节PPAR-γ表达呈现先增强后抑制趋势。PPAR-γ配体可显著抑制LPS介导的CD40mRNA和ICAM-1蛋白的表达。提示RPMCs功能性表达PPAR-γ．可能通过负性调节炎症介质分泌而参与腹腔局部防御。     

1，25（OH）2D3对脂多糖作用下大鼠腹膜间皮细胞维生素D受体及肿瘤坏死因子α、转化生长因子β1表达的影响

目的 研究脂多糖（LPS）对大鼠腹膜间皮细胞（RPMC）维生素D受体(VDR)及肿瘤坏死因子α（TNF-α）、转化生长因子β1（TGF-β1）表达的影响,从而为1,25（OH）2D3在腹膜透析相关腹膜炎中的应用提供理论依据。 方法 胰蛋白酶消化法原代培养腹膜间皮细胞、传代、经鉴定后分组：(1)正常对照组;(2)脂多糖组：不同浓度的脂多糖（1、10、100 mg/L）分别作用6 h;10 mg/L脂多糖分别作用2、6、12 h;(3)1,25（OH）2D3作用组：10 mg/L脂多糖预孵育2 h后,加1,25（OH）2D3(10－8 mol/L、10－7 mol/L、10－6 mol/L)再作用6 h。RT-PCR法检测VDR mRNA的表达;Western印迹法检测VDR蛋白表达;ELISA法检测上清液TNF-α、TGF-β1的表达。 结果 与对照组相比,LPS组RPMC VDR mRNA和蛋白表达均显著下调（均P < 0.05）。与LPS组相比,1,25（OH）2D3组VDR mRNA和蛋白表达均显著上调（均P < 0.01）。LPS组上清液中TNF-α、TGF-β1浓度均显著高于对照组（均P < 0.01）;1,25（OH）2D3组上清液中TNF-α、TGF-β1浓度均显著低于LPS组（均P < 0.01）。 结论 LPS能下调RPMC VDR mRNA和蛋白的表达,上调TNF-α、TGF-β1表达。1,25（OH）2D3可逆转LPS的作用,上调RPMC VDR mRNA和蛋白的表达,并下调TNF-α、TGF-β1表达。VDR对腹膜透析相关腹膜炎具有一定的保护作用,并具有抑制腹膜纤维化的作用。     

血管紧张素Ⅱ诱导Toll样受体4在腹膜间皮细胞的表达及其对脂多糖诱导CD40表达的影响

目的 观察血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）对原代培养大鼠腹膜间皮细胞（RPMC）Toll样受体4（TLR4）表达的影响及其在脂多糖（LPS）诱导的核转录因子κB （NF-κB）活化及CD40表达中的作用。 方法 分离及培养RPMC。用不同浓度AngⅡ（10－9、10－8、10－7、10－6 mol/L）刺激细胞及用10-7 mol/L AngⅡ刺激细胞不同时间（mRNA为1、2、4、8、12、24、48 h和蛋白为6、12、24、36、48 h），观察血管紧张素1型受体（AT1R）阻滞剂洛沙坦（10－5 mol/L）和血管紧张素2型受体（AT2R）阻滞剂PD123177（10-5 mol/L）对AngⅡ诱导TLR4表达的影响。将细胞随机分为下列4组：对照组、AngⅡ (10－7 mol/L)组、LPS(1 mg/L)组、AngⅡ (10－7 mol/L)+LPS(1 mg/L)组，观察AngⅡ对LPS诱导的NF-κB激活和CD40表达的影响。RT-PCR检测TLR4、CD40 mRNA表达；Western印迹检测TLR4、IκBα、磷酸化IκBα（p-IκBα）、NF-κB p65、磷酸化NF-κB（p-p65）蛋白表达；免疫荧光检测细胞NF-κB p65亚单位的表达及分布。 结果 (1)10－9、10－8、10－7、10－6 mol/L AngⅡ作用RPMC 12 h，TLR4 mRNA表达分别增加70.5%、89.5%、102.9%和121.9%；作用24 h TLR4蛋白表达分别增加12.1%、27.7%、51.2%和41.6%。AngⅡ（10－7 mol/L）作用RPMC不同时间，TLR4 mRNA表达高峰为8 h和12 h（P < 0.01），蛋白表达高峰为12 h和24 h（P < 0.01）。(2)洛沙坦阻断后，AngⅡ诱导的TLR4表达与未阻断组比较，下调33.5%（P < 0.05）。PD123177对AngⅡ诱导的TLR4表达无显著影响（P > 0.05）。(3) 与正常对照组比较，LPS作用60 min p-IκBα/IκBα、p-p65/p65表达分别上调362.6%（P < 0.01）和67.4%（P < 0.05）；作用4 h CD40 mRNA表达上调299.9%（P < 0.01）；与LPS组比较，AngⅡ预刺激24 h加LPS作用60 min，p-IκBα/IκBα、p-p65/p65表达分别上调49.1%（P < 0.01）和29.3%（P < 0.05）；作用4 h CD40 mRNA表达上调56.8%（P < 0.01）。(4)免疫荧光结果显示正常对照组与AngⅡ组细胞中，p65信号定位于细胞胞质；LPS作用60 min，p65信号从胞质进入胞核；AngⅡ+LPS组NF-κB p65胞核信号显著增强。 结论 AngⅡ呈浓度、时间依赖性诱导RPMC TLR4表达，并显著增强LPS诱导NF-κB激活及CD40的表达。提示腹膜组织局部产生的AngⅡ可能对LPS诱导的腹膜组织炎性反应具有放大作用。     

罗格列酮抑制环孢素诱导的大鼠肾脏成纤维细胞基质金属蛋白酶9和金属蛋白酶1组织抑制剂表达

目的 观察罗格列酮(RGZ)对环孢素A(CsA)作用下大鼠肾脏成纤维细胞(NRK)过氧化物酶体增生物激活受体γ(PPARγ)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达的影响,探讨罗格列酮对环孢素A肾毒性保护作用的分子机制.方法 构建、筛选和扩增PPARγ基因的siRNA载体,并将载体转染至体外培养的NRK细胞.体外培养NRK细胞,随机分组.(1)对照组:不加处理;(2)RGZ组:加RGZ( 10 μmol/L);(3)CsA组:加CsA( 1.0 mg/L);(4)CsA+RGZ 组:同时加CsA( 1.0 mg/L)及RGZ(10 μmol/L);(5)CsA+RGZ+siRNA组:质粒pRNAT- U6.2/LentiPPARγ-236转染NRK细胞,然后同时加入CsA( 1.0 mg/L)及RGZ(10 μmol/L).培养24 h后,用实时荧光定量和RT-PCR法检测各组细胞中PPARγ、MMP-9、金属蛋白酶1组织抑制剂(TIMP-1) mRNA表达,用Western印迹法检测纤连蛋白(FN)的蛋白表达.结果 CsA明显上调PPARγ、MMP-9和TIMP-1 mRNA的表达(均P＜0.05);RGZ与CsA合用后,PPARγ、MMP-9和TIMP-1 mRNA表达下降(均P＜0.05);应用PPARγ siRNA后,与RGZ+ CsA组相比,PPARγ mRNA表达显著下降(P＜0.05),MMP-9 mRNA和TIMP-1 mRNA表达有所增加(均P＜ 0.05).CsA明显上调FN蛋白表达(P＜0.05);RGZ与CsA合用后,FN蛋白表达下降(P＜0.05);应用含PPARγ siRNA后,FN蛋白表达有所增加(P＜0.05).结论 罗格列酮可以显著减轻CsA诱导NRK细胞分泌的FN蛋白及MMP-9、TIMP-1 mRNA的表达,构建的siRNA质粒转染NRK细胞,能够有效地阻断NRK中PPARγ mRNA的表达,部分阻断罗格列酮对CsA毒性的改善作用.     

PPARγ激动剂对成人正常皮肤成纤维细胞转分化的作用

目的：观察过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）激动剂对转化生长因子β1（TGF-β1）诱导成纤维细胞转分化的影响,探讨其抗瘢痕纤维化的潜在作用。方法：体外培养成人正常皮肤成纤维细胞,利用免疫荧光细胞化学法观察、分析PPARγ配体15-脱氧前列腺素J2（15d-PGJ2）及其激动剂曲格列酮对TGF-β1诱导的α平滑肌动蛋白（α-SMA）表达的影响,利用Western blot、实时荧光RT-PCR技术检测PPARγ激动剂对TGF-β1诱导的α-SMA蛋白及mRNA水平的影响。结果：TGF-β1能显著增加成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞;与TGF-β1诱导组相比,10μM曲格列酮、15d-PGJ2预处理组的α-SMA表达量显著减少（P〈0.01）,抑制效应分别为31%、57%;预处理组的α-SMA mRNA水平显著下降（P〈0.01）。结论：PPARγ激动剂能抑制TGF-β1诱导的成人正常皮肤成纤维细胞的转分化的效应,具有抗皮肤瘢痕化、挛缩的潜在作用。     

虫草菌液对高糖作用下大鼠腹膜间皮细胞转化生长因子β_1和纤维连接蛋白表达的影响

目的：研究虫草菌液（HS）对高糖作用下体外培养的大鼠腹膜间皮细胞（RPMCs）转化生长因子β1（TGF-β1）和纤维连接蛋白（FN）表达的影响。方法：将原代培养的第3代RPMCs随机分为6组：对照组、1.5%葡萄糖组、2.5%葡萄糖组、单纯虫草组（10mg/ml）、1.5%葡萄糖＋10mg/ml虫草组、2.5%葡萄糖＋10mg/ml虫草组。同步培养72h后,以RTPCR法检测各组细胞TGF-β1和FN mRNA表达情况;ELISA法检测细胞上清液中TGF-β1和FN的蛋白质水平。结果：高糖作用下RPMC的TGF-β1、FN mRNA和蛋白表达水平均明显高于对照组（P〈0.05）,且增高的程度与葡萄糖浓度呈依赖关系。与相应浓度的高糖组相比,经虫草菌液干预后RPMC的TGF-β1、FN mRNA和蛋白表达水平均显著降低（P〈0.05）。结论：虫草菌液可下调高糖作用下RPMCs的TGF-β1和FN的表达,具有抗腹膜纤维化的作用。     

不同浓度15d-PGJ2对骨髓细胞PPARγ2及骨代谢相关基因表达的影响

目的观察不同浓度15d-PGJ2对大鼠骨髓细胞过氧化物酶体增殖物激活受体γ2(PPARγ2)及骨代谢相关基因核因子-κB活化受体配体(RANKL)、碱性磷酸酶(ALP)、骨保护素(OPG)、核因子-κB活化受体(RANK)及抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)mRNA表达水平的变化,探讨PPARγ2内源性配体15d-PGJ2对骨髓细胞PPARγ2及骨代谢相关基因表达的影响。方法体外培养大鼠骨髓细胞,加入不同浓度15d-PGJ2(0、10、20、30μmol/L)干预24h后,采用半定量逆转录PCR(RT-PCR)检测骨髓细胞PPARγ2、RANKL、ALP、OPG、RANK、TRAPmRNA表达水平,比较不同浓度15d-PGJ2对骨髓细胞PPARγ2及骨代谢相关基因表达的影响。结果不同浓度15d-PGJ2呈剂量依赖性下调RANKL、ALP、OPGmRNA的表达水平,同时呈剂量依赖性上调PPARγ2、RANK、TRAPmRNA的表达水平,组间比较差异均有统计学意义(P0.05,P0.01)。结论 15d-PGJ2可能通过激活PPARγ2转录活性抑制骨髓细胞成骨细胞标记物基因的表达,促进破骨细胞标记物基因的表达,这可能是15d-PGJ2参与增龄相关的骨质疏松发生的原因之一。     

罗格列酮对脂多糖诱导肾小管上皮细胞趋化因子分泌的影响及可能机制

目的 探讨罗格列酮（RGL）对脂多糖（LPS）诱导人近端肾小管上皮细胞（HK-2）趋化因子分泌的影响及可能机制。 方法 用RGL（10 μmol/L）预处理HK-2细胞2 h后加入LPS（1 mg/L）,与单纯LPS组、单纯RGL组及未加任何刺激（CON）组进行比较。用实时定量PCR方法检测细胞中白细胞介素8（IL-8）和单核细胞趋化蛋白1（MCP-1） mRNA表达水平;用ELISA法检测细胞培养上清中IL-8和MCP-1蛋白水平。通过RNAi技术沉默肾小管上皮细胞过氧化物酶体增殖蛋白激活性受体γ（PPARγ）,观察RGL的作用是否依赖于PPARγ。用Western印迹法检测细胞核中NF-κB蛋白水平;用EMSA方法检测NF-κB DNA结合活性。 结果 在HK-2细胞中,与CON组相比,单纯LPS刺激使IL-8、MCP-1 mRNA分别升高（4.30±0.45）倍和（4.80±1.29）倍（均P < 0.05）,使培养上清中IL-8、MCP-1分别升高（1.39±0.18）和（2.11±0.47）倍（均P < 0.05）;与LPS组相比,RGL预处理组IL-8和MCP-1在mRNA水平分别下降66.37%和71.88%（均P < 0.05）,在蛋白水平分别下降41.68%和47.87%（均P < 0.05）。在PPARγ沉默的HK-2细胞中,RGL预处理2 h后再加LPS刺激,IL-8和MCP-1 mRNA仅分别下降18.16%、16.83%,培养上清中IL-8和MCP-1仅分别下降11.39%、11.86%,与单纯LPS组相比差异无统计学意义。RGL预处理2 h不能抑制LPS诱导的NF-κB核易位,但可显著降低NF-κB DNA结合活性。 结论 RGL以PPARγ依赖的方式抑制LPS诱导HK-2细胞分泌IL-8和MCP-1,其机制可能与降低NF-κB DNA结合活性有关。