以逆转录病毒为载体的IL—2基因转染K562细胞的研究

目的：研究以逆转录病毒为载体将IL-2基因转入K562细胞及表达情况。方法：应用脂质体介导的基因转移法，将质粒PGEN/IL-2导入包装细胞PA317，将K562细胞与PA317/IL-2细胞共培养，检测IL-2cDNA整合，mRNA转录情况，以IL-2依赖性CTLL-2细胞测定培养细胞上清中IL——2产量，比较转染前后细胞的体外生长情况和致瘤性。结果；IL-2cDNA成功整合入K562细胞基因组中并稳定表达，K562/IL-2细胞培养24h上清中IL——2活性为100U/ml，体内外观察均见细胞生长减慢。结论：以脂质体介导的以双顺反子逆转录病毒为载体的基因转移方法。可成功地将人IL-2基因转入人白血病细胞株K562，并持续分泌高活性的IL-2，为下一步将IL-2基因转入CML造血细胞的研究打下基础。     

含人白细胞介素-2基因逆转录病毒载体系统的建立及转染人白血病细胞株的研究

应用逆转录病毒载体LNCIL－2介导人白细胞介素（IL）－2基因经包装细胞PA317包装成重组病毒后，转染人白血病细胞株K562、HL－60，经G418筛选获阳性克隆，阳性克隆上清表达IL－2活性。转染后细胞经Southern检测存在新霉素抗性基因（neoR）。转染IL－2基因的白血病细胞生长速度、克隆形成率均落后于转染空载体或未转染基因的细胞。表明含人IL－2基因逆转录病毒载体系统已成功建立，转染人IL－2基因的白血病细胞增殖活性下降。     

携带EGFP与rtTA双基因的逆转录病毒载体的构建及其在PA317细胞中的表达

目的 构建表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP-rtTA,并在PA317细胞中表达.方法 以质粒pEGFP-C1为模板进行PCR反应获得EGFP基因片段,定向插入逆转录病毒载体pLXSN,筛选出正确的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP.PCR方法从pTet-on质粒中扩增出rtTA基因,酶切纯化后克隆于逆转 录病毒载体pLXSN-EGFP中,限制性内切酶酶切分析及PCR鉴定筛选出正确的重组载体pLXSN-EGFP-rtTA,脂质体介导转染PA317细胞,PCR方法检测PA317细胞内EGFP、rtTA基因,RT-PCR方法检测PA317细胞内rtTA基因的mRNA表达,荧光显微镜观察EGFP基因的表达情况.以NIH3T3细胞为靶细胞测定重组逆转录病毒滴度.结果 成功构建了表达EGFP、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体,转染PA317细胞后,RT-PCR方法可检测到rtTA基因的mRNA表达,荧光显微镜下可观察到EGFP基因表达所产生的绿色荧光,说明连接有EGFP和rtTA双基因的逆转录病毒载体在PA317细胞中可正常表达,转染pLXSN-EGFP-rtTA载体的PA317细胞可产生4.8x 104 CFU/ml病毒滴度的重组病毒.结论 成功构建表达EGFP、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体,该载体可在PA317细胞内正常表达,获得较高滴度的病毒上清.     

iNOS基因重组逆转录病毒的包装及高滴度病毒液的制备

目的利用逆转录病毒载体PLXSN介导iNOS基因转染,为逆转录病毒介导的iNOS转基因防治血管移植术后再狭窄的研究奠定实验基础。方法采用QIAGEN plasmid Maxi Kit纯化PLXSN-iNOS;通过脂质体介导的DNA转染法将PLXSN-iNOS导入包装细胞PA317中;经G418筛选获得抗性克隆,命名为PA317/iNOS;提取抗性克隆细胞基因组DNA,用PCR进行鉴定;用NIH3T3细胞测定病毒上清滴度。结果PA317/iNOS细胞能稳定合成和分泌重组逆转录病毒颗粒,并在约142 bp处扩增出特异的片段;PLXSN-iNOS病毒上清的最高滴度为1.6×106CFU/mL。结论逆转录病毒载体PLXSN能有效介导iNOS基因的转染。     

葡萄糖激酶基因逆转录病毒表达载体及包装细胞系的构建及鉴定

目的构建葡萄糖激酶(glucokinase,GK)基因逆转录病毒表达载体及稳定的产毒细胞系,为将GK基因应用于糖尿病的基因治疗打下基础.方法质粒pCMV4-GKZ1经EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切后亚克隆至逆转录病毒载体PLXSN,构建成重组逆转录病毒表达载体PLX-GK,采用酶切及测序对重组体进行鉴定.而后脂质体转染PLX-GK至包装细胞PA317,检测培养上清病毒滴度,挑选滴度较高的稳定产毒细胞系并对其行PCR及免疫组化鉴定.结果构建了GK基因逆转录病毒表达载体PLX-GK,经酶切及序列分析证实目的基因插入位点和读码框架正确、无突变;建立了稳定产毒细胞系PA317/GK,其培养上清平均病毒滴度为6.8×105cfu/ml,最高为1.8×106cfu/ml,PCR及免疫组化证实GK基因整合入PA317/GK细胞基因组并有GK的表达.结论成功构建了携GK基因的逆转录病毒表达载体及高滴度的稳定产毒细胞系.     

含HSVtk基因重组逆转录病毒包装细胞PA317/TK的建立

目的 :研究肿瘤的自杀基因疗法 ,建立含单纯疱疹病毒胸苷激酶 (HSVtk)基因重组逆转录病毒包装细胞PA317/TK。　方法 :应用脂质体转移方法将逆转录病毒载体GINaTK导入PA317,经G4 18筛选阳性克隆细胞后分别用PCR和扫描电镜检测HSVtk基因整合和病毒颗粒分泌情况。　结果 :逆转录病毒载体GINaTK导入PA317,G4 18后筛选得到阳性克隆细胞 ,命名为PA317/TK。PCR检测PA317/TK细胞出现一特异性 4 0 4bp阳性条带 ,而PA317细胞没有扩增出相应条带。PA317/TK细胞经扫描电镜检测见其表面有颗粒状突起 ,其周围有许多呈团状的病毒颗粒。证实含HSVtk基因重组逆转录病毒存在于包装细胞中。　结论 :成功建立含HSVtk基因重组逆转录病毒包装细胞     

野生型p53基因对白血病K562细胞的增殖抑制作用

目的:建立携野生型p53基因的K562细胞株,研究该细胞内野生型p53基因的表达并观察其生物学特性。方法:构建重组人p53逆转录病毒载体,导入PA317细胞中进行包装,经过病毒滴度测定,筛选高滴度的产病毒细胞克隆。收集培养上清液中的重组人p53逆转录病毒颗粒,感染K562靶细胞,建立携野生型p53基因的K562细胞株。观察该细胞株的生长方式、形态学和生长速度。SP免疫组化染色法检测p53蛋白表达。进一步用流式细胞仪检测p53蛋白表达率和细胞周期变化;双层软琼脂培养实验检测细胞的增殖潜能改变。以pBabe空载体同时实验,作为各阶段的对照。结果:成功地构建了重组逆转录病毒载体pBabe/p53;获得逆转录病毒生产PA317/p53细胞系,最高病毒滴度为4.64×105CFU/m l;获稳定表达p53基因的K562/p53靶细胞,免疫组化结果证实该细胞内有野生型P53蛋白表达,流式细胞仪检测到野生型P53蛋白表达率为1.32%;与对照K562/pBabe细胞比较,K562/p53靶细胞的生长速度下降;软琼脂集落生成的下降率为27.14±4.49%(P<0.05);增殖指数下降,S期比例下降(P均<0.01)。结论:制备了携p53基因的高滴度逆转录病毒,建立携野生型p53基因的K562/p53细胞株,证实表达的野生型p53蛋白对该细胞有抑制作用。     

入 IL-2转基因表达及对小鼠黑色素瘤生长的影响

临床应用重组IL-2联合LAK或TIL细胞治疗黑色素瘤、肾细胞癌等恶性肿瘤虽有一定疗效,但毒副作用较大。若将IL-2基因转入到某种基因运载细胞中稳定表达后输入体内,通过其在肿瘤局部持续分泌一定量的IL-2激活机体抗肿瘤免疫反应,则有可能避免输入大量IL-2引起的毒副作用。本实验用逆转录病毒载体介导转移人IL-2基因在小鼠黑色素瘤细胞中稳定表达,并观察其体内的抗肿瘤作用。将人IL-2cDNA插入连接到逆转录病毒载体上,所构建的重组病毒载体经序列分析表明,所插入的人IL-2cDNA全长774bp。用磷酸钙法将重组病毒载体转染病毒包装细胞PA317,经G418抗性选择,获得滴度     

含大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因的假型逆转录病毒的构建及包装

研究将大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（CD）基因应用于基因治疗。构建、包装含CD基因的假型逆转录病毒。构建含CD基因的逆转录病毒重组表达载体pLCDSN基础上，以重组表达载体pLCDSN转染包装细胞PA317，pLCDSN整合入PA317染色体中。结果：CD基因获得表达且包装出具有感染能力的假型逆转录病毒。以该假型逆转录病毒感染NIH／3T3细胞，逆转录病毒重组表达载体pLCDSN整合入NIH／3T3细胞染色体中，CD基因获得表达。5－FC对有CD基因表达的包装细胞PA317（pLCDSN）和NIH／3T3（pLCDSN）产生杀伤毒性。结论：我们已成功地构建、包装了含重组逆转录病毒载体pLCDSN且具有感染能力的假型逆转录病毒。该工作为以逆转录病毒介导的CD基因应用于肿瘤基因治疗奠定了基础。     

TH基因逆转录病毒表达载体的构建及产病毒细胞系的建立

目的　构建含有鼠酪氨酸羟化酶 (TH)基因的重组逆转录病毒表达载体 p N2 ATH,建立 PA317产病毒细胞系。方法　将质粒 p GEM- 2上酶切下的 THc DNA片段与线性化的逆转录病毒表达载体 N2 A连接 ,克隆出重组逆转录病毒表达载体 p N2 ATH。把 p N2 ATH质粒转入 PA317包装细胞 ,通过 G4 18抗性筛选 ,NIH3T3细胞测定病毒滴度 ,得到高滴度产毒 PA317/p N2 ATH细胞株 ,免疫组化测定细胞 TH表达。结果　重组质粒 p N2 ATH经酶切鉴定证明 THc DNA正向插入 N2 A表达载体中 ,PA317/p N2 ATH产毒细胞高效表达 TH。结论　成功地构建了重组逆转录病毒表达载体p N2 ATH,建立了 PA317/p N2 A产毒细胞株     

人胰岛素原基因的包装及增殖

目的:用PA317包装细胞包装突变人胰岛素基因原质粒,并检测其增殖情况.方法:用脂质体转染法将PLXSN-MPINS质粒转染至PA317包装细胞,用G418筛选出阳性PA317包装细胞克隆并测定胰岛素原基因浓度,用TRIZOL法提取未转染和转染后PA317细胞的基因组DNA,PCR检测突变人胰岛素基因的整合情况.结果:(1)用脂质体转染法获得G418阳性PA317包装细胞克隆;(2)该细胞克隆获高滴度的胰岛素原基因浓度;(3)PCR方法在转染后PA317基因组中检测到突变人胰岛素原基因.结论:脂质体转染法是一种操作简便且行之有效的转染方法.PA317包装细胞系可成功包装突变人胰岛素原基因质粒并可获得高滴度表达,为1型糖尿病基因治疗的进一步实验研究奠定了基础.     

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因对肺腺癌细胞杀伤作用探讨

目的：探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因转染联合抗病毒药物更昔洛韦（GCV）对人肺腺癌细胞系的杀伤作用。方法：应用基因工程技术构建了携带单纯疮疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）基因的逆转录病毒重组体pLXSN-tk，通过脂质体法转染PA317细胞，G418筛选出产重组病毒颗粒的生产细胞PA317-tk细胞。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测HSV-tk/GCV系统对人肺腺部细胞系GLC-82的生长抑制率。结果：重组逆转录病毒载体能有效地将HSV-tk基因导入GLC-82细胞系内并使其获得对GCV的敏感性。结论：肺腺癌细胞转染HSV-tk基因后，能有效地被GCV杀死。     

逆转录病毒介导癌基因疗法体外安全实验

从逆转录病毒ｐＬＸＳＮ与人ＩＬ－２ｃＤＮＡ基因进行重组，包括ＰＡ３１７细胞，建立逆转录病毒包装体系细胞ＰＡ３１７／ｐＬＩＬ－２ＳＮ。用病毒上清液转导人淋巴细胞（ＴＩＬ，ＰＢＬ）和３株人腺癌细胞株（ＳＰＣ－Ａ１，ＭＫＮ－ＨｅｐＧ２）对转ＩＬ－２基因的淋巴细胞（ＴＩＬ／ＩＬ－２，ＰＢＬ／ＩＬ－２）和转ＩＬ－２基因的人癌细胞（ＳＰＣ－Ａ２／ＩＬ－２，ＭＫＮ－４５／ＩＬ－２，ＨｅｐＧ２／ＩＬ２）进行体外安     

Inhibiting effect of murine double minute-2 oncogene on apoptosis induced by retroviral-mediated wild-type p53

OBJECTIVE To investigate the effects of wild-type p53 (wtp53) on inducing apoptosis by restoring wtp53 expression in pancreatic adenocarcinoma cell line (PC-2) which contains mutant p53, and the interaction between murine double minute-2 (MDM2) and wtp53 in pancreatic adenocarcinoma.

METHODS A recombinant retroviral vector expressing wild-type p53 was constructed and packaged by packaging cell line PA317 cells using calcium phosphate coprecipitation method. The supernatant of the packaged cells PA317 was used to transfect the pancreatic carcinoma cell line (PC-2), then a transformed cell line PC-2/swtp53 was established. The recombinant vector pCMV-MDM2 was transduced into PC-2/swtp53 cell line by lipofectin-mediated method, a double transfected cell line (PC-2/swtp53/pCMV-MDM2) was formed. To determine the integration and expression of exogenous wtp53 gene in the transfected cells, polymerase chain reaction (PCR), Western blot and immunoprecipitation analyses were performed. Apoptosis was analyzed by means of flow cytometry, in situ terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) analysis and DNA agarose gel electrophoresis.

RESULTS Transduction with the retroviral vector resulted in integration and expression of wtp53 gene in host cells. The apoptotic cells in PC-2/swtp53 and PC-2/swtp53/pCMV-neo cell lines were 12.1%-12.9%, while the double transfected cell line, PC-2/swtp53/pCMV-MDM2, showed less (3.2%) apoptotic cells than its parent cell lines.

CONCLUSIONS Restoration of expression of wild-type p53 with a retroviral vector can increase programmed cell death of pancreatic adenocarcinoma cells (PC-2) containing mutant p53. The overexpression of MDM2 protein has a negative regulating role in wtp53-induced apoptosis in PC-2 cell.

     

转染bcl-2基因对心肌细胞缺氧耐受性的影响

目的 探讨转染ｂｃｌ－２基因能否提高心肌细胞对缺氧的耐受性。方法 ①重组真核细胞表达载体。将含编码人ｂｃｌ－２ｃＤＮＡ寒带开放阅读框的ｂｃｌ－２ｃＤＮＡ重组至逆转录病毒载体－ｐＬＸＳＮ的ＥｃｏＲⅠ位点上,用脂质体包裹重度组质粒导入ＰＡ３１７细胞株,并经Ｇ４１８筛选阳性克隆;②用含高滴度重组病毒的上清感染心肌细胞,原位杂交鉴定其转染是否成功;③观察转染心肌细胞在缺氧环境下的生存率。结果 ①重组了含ｂ     

HyTK基因转导联合丙氧鸟苷对鼠膀胱癌细胞的体外杀伤作用

目的　探索HyTK基因转导丙氧鸟苷 (ganciclovir,GCV)对鼠膀胱癌细胞的影响。方法　脂质体介导法将PL(HyTK)SN质粒转染PA3 17细胞 ,潮霉素B筛选 ,直到出现抗性克隆 ,扩增培养 ,NIH3T3细胞测定病毒滴度 ,用逆转录病毒上清液感染T73 9细胞 ,潮霉素B筛选 ,直到出现抗性克隆 ,扩增培养 ,命名为T73 9 TK。RT PCR对T73 9 TK细胞进行鉴定。然后观察其在体外膀胱癌细胞的杀伤作用。结果　RT PCR证实HyTK基因已插入T73 9细胞并有其mRNA的表达 ,经不同浓度GCV处理后的T73 9 TK细胞均表现出有杀伤作用 ,而T73 9细胞在各个剂量的GCV作用下生长均良好。结论　GCV对转导了HyTK基因的T73 9细胞有显著杀伤作用     

TH基因修饰的中脑星形胶质细胞的建立

目的 体外构建酪氨酸羟化酶(TH)基因修饰的中脑星形胶质细胞,为进行帕金森病(PD)的转基因细胞治疗奠定基础。方法 应用逆转录病毒表达载体将鼠TH基因转入逆转录病毒包装细胞PA317,通过G418抗性筛选,获取高滴度产毒PA317／pN2ATH细胞株,以其产生的病毒上清感染鼠中脑星形胶质细胞,继续培养7～9d后,免疫组化检测细胞TH表达。结果获得了高滴度产毒PA317／pN2ATH细胞,并且转染pN2ATH的中脑星形胶质细胞成功表达TH。结论转染pN2ATH的中脑星形胶质细胞可以有效表达TH,为将其应用于PD基因治疗实验研究提供了基础。