发酵液中重组水蛭素的分离纯化

目的：建立毕赤酵母(pichia)高密度表达的重组水蛭素(recombinant hirudin-2,rHV2)分离纯化工艺。方法：高密度培养重组毕赤酵母并诱导表达水蛭素至胞外，发酵液经超滤、透析、离子交换层析。分离纯化rHV2目的蛋白；采用SDS-PAGE和抗凝血酶活力分别检测目的蛋白纯度和活性。结果：纯化样品经SDS-PAGE电泳检测为单一条带，重组水蛭素比活性为6000ATU／mg，纯化收率达38．6％。结论：超滤、透析和离子交换层析可用于发酵液中大规模分离纯化重组水蛭素。     

溶栓素的纯化研究

目的：研究溶栓素的纯化工艺。方法：采用超滤法截留分离,强阴离子交换层析去除核酸,弱阴／阳离子交换层析和疏水层析组合法精细分离溶栓素。结果：聚丙烯酰胺凝胶电泳考马斯亮蓝染色法结合显示最终纯化产物为一条染色带,纯化倍数为144．83,回收率为38．66％。结论：溶栓素的纯化工艺基本体现了工业生产工艺的特点,具有一定的实用性。     

大肠杆菌表达的rhIL—8的分离纯化

目的：探索人重组白细胞介素－８（ｒｈＩＬ－８）的分离纯化的路线。方法：用Ｓｅｐｈａｃｒｙ１－Ｓ－２００凝胶过滤和ＷＱｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ．Ｑ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｂｉｇ ｂｅａｄｓ两步连续阴郭交换层析纯化，结果：两种方法纯化的ｒｈＩＬ－８纯度分别达９５．６％、９８．６％。氨基酸组份分析推算值基本与理论值相符。纯化的ｒｈＩＬ－８对小 人中性粒细胞具有明显的体内体外趋势     

重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的分离纯化工艺建立

目的 建立大肠杆菌高密度表达的重组葡激酶-水蛭素融合蛋白(STH)分离纯化工艺.方法 高密度培养重组大肠杆菌并诱导表达STH,离心收集菌体,反复冻融后收集上清液经超滤、两步阴离子交换层析,分离纯化STH目的 蛋白.结果 纯化后的STH纯度为98%以上,纤溶比活性2.6×104IU/mg,活性回收率56%.结论 建立了STH的纯化工艺,该纯化工艺简便,时程短,重复性好,适合于大规模生产.     

大肠杆菌表达的rhIL－8的分离纯化

目的：探索人重组白细胞介素－８（ｒｈＩＬ－８）的分离纯化的路线。方法：用Ｓｅｐｈａｃｒｙ１－Ｓ－２００凝胶过滤和Ｑｓｅｐｈａｒｏｓｅｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｑｓｅｐｈａｒｏｓｅｂｉｇｈｅａｄｘ两步连续阴离子交换层析纯化。结果：两种方法纯化的ｒｈＩＬ－８纯度分别达９５．６％、９８．６％。氨基酸组份分析推算值基本与理论值相符。纯化的ｒｈＩＬ－８对小鼠和人中性粒细胞具有明显的体内体外趋化作用。结论：本法为ｒｈｌＬ－８提供了快速高效的纯化路线。     

溶栓素的纯化研究

目的 :研究溶栓素的纯化工艺。方法 :采用超滤法截留分离 ,强阴离子交换层析去除核酸 ,弱阴/阳离子交换层析和疏水层析组合法精细分离溶栓素。结果 :聚丙烯酰胺凝胶电泳考马斯亮蓝染色法结合显示最终纯化产物为一条染色带 ,纯化倍数为 144 .83,回收率为 38.6 6 %。结论 :溶栓素的纯化工艺基本体现了工业生产工艺的特点 ,具有一定的实用性。     

甘油对毕赤酵母高密度发酵表达重组水蛭素Ⅱ的影响

目的：考察甘油对毕赤酵母生长和重组水蛭素Ⅱ表达的影响。方法：在摇瓶和IOL发酵罐中用含有不同浓度甘油的培养基培养毕赤酵母，测定毕赤酵母的生长和重组水蛭素Ⅱ的表达。结果：发酵培养基中初始甘油浓度为5g／L时，毕赤酵母生长速度明显加快；补料过程中甘油浓度大于70g／L时，毕赤酵母生长受到抑制。与不加甘油相比较，诱导表达期维持培养基中甘油浓度在5g/L以下，重组水蛭素表达可提前4h，诱导30h其活性达13000 ATU／ml，比仅用甲醇诱导时效价提高了7．7％。结论：降低初始培养基中甘油浓度有利于毕赤酵母生长，补料过程中培养基甘油浓度应维持在押制毕赤酵母生长的浓度之下，诱导阶段培养基中少量的甘油有利于水蛭素的表达.     

广东菲牛蛭水蛭素基因的克隆和序列测定

目的：研究地理因素对水蛭素基因结构变异的影响。方法：抽提广东菲牛蛭基因组DNA，根据已发表的水蛭素基因设计一对引物，从基因组DNA扩增出一特异性的大约700bp片段，再回收，克隆和测序。结果：广东菲牛蛭水蛭素基因全长为642bp，基因有4个外显子，被三个内含子隔开，与马尼拉菲牛蛭水蛭素基因Hm1,Hm2的同源性分别为90％与88．6％，结论：地理因素会影响菲至蛭水蛭素基因结构的变异。     

水蛭素的分离与纯化

水蛭是一种名贵的中药材，它的涎液中有一种抗凝血物质，称为水蛭素(Hirudin)，水蛭素是至今为止世界上最强的凝血酶特效抑制剂。天然水蛭素产生于医用水蛭的唾液腺，大多数制取方法是以整个水蛭为原料，水蛭躯体中有较大量的结构与水蛭素类似，但无生物活性的“伪水蛭素”组分存在，它们将增加水蛭素分离的难度，本实验将水蛭分为三个部分，分别提取水蛭的口部，头部和身体的其他部位，这样就可以省去分离伪水蛭素而产生的不必要的麻烦，大大的提高生产效率，从而为水蛭素的药用提供了可能，现将研究结果报告如下。     

大鼠胰岛的分离和钙化

目的：改进分离与纯化方法，以获得较高纯度和活力的大鼠胰岛。方法：用改良的酶法分离、Ｄｅｘｔｒａｎ梯度法纯化大鼠胰岛。用ＤＴＺ法判定胰岛纯度；用ＡＯ／ＰＩ法判定胰腺存活率；用大鼠胰岛移植于ＳＴＺ糖尿病小鼠法判定其功能。结果：雌、雄性ＳＤ和Ｗｉｓｔａｒ大鼠间胰岛形态无明显差异。Ⅴ型和Ⅵ型胶原酶对大鼠胰岛分离效果相似；分离以０．１％胶原酶分次消化、作用３０ｍｉｎ为宜，细胞存活率达９０％。纯化用２２％－１