广州地区小儿无症状乙肝病毒携带者的基因型研究

目的扩增HBV DNA S基因,建立HBV DNA的分型方法,研究广州地区小儿无症状乙肝病毒携带者(AsC)的基因型. 方法利用PCR-RFLP基因分型方法,扩增HBV DNA S基因,以限制性内切酶AvaII、MboI酶切分型. 结果 60份AsC血清样本,B型37份(62.7%),C型20份(33.3%),B、C混合型2份(3.3%),未分型1份(1.7%),经序列分析证明为C型,C型共35%. 结论 PCR-RELP分型方法经济实用,分型率达98.3%,广州地区小儿乙肝病毒的基因型以B型和C型为主,其中携带者中B型占优势.     

广州地区小儿乙肝无症状携带者及其父母的HBV DNA基因型研究

目的扩增HBV DNA S基因,建立 HBV DNA的分型方法,研究家庭中小儿乙肝无症状携带者与其父母的基因型.方法利用PCR-RFLP基因分型方法,扩增HBV DNA S基因,以限制性内切酶AvaⅡ,MboⅠ酶切分型;结果 12个家庭共27例乙肝无症状携带者血清,其中两个家庭儿童与父母的基因型相同,均为B型;9个家庭儿童与母亲的基因型相同(7个B型,2个C型),父亲HBV DNA阴性;1个家庭儿童与母亲为B型,父亲为C型,结论本文利用的分型方法经济实用,分型率高,广州地区的基因型以B型,HBV DNA的传播具有家庭聚集性特点及母婴传播的特点.     

广州地区小儿无症状乙肝病毒携带者的基因型研究

目的：扩增HBV DNA S基因，建立HBV DNA的分型方法，研究广州地区小儿无症状乙肝病毒携带者（AsC）的基因型。方法：利用PCR－RFLP基因分型方法，扩增HBV DNA S基因，以限制性内切酶AvaⅡ、MboI酶切分型。结果：60份AsC血清样本，B型37份（62．7％），C型20份（33．3％），B、C混合型2份（3．3％），未分型1份（1．7％），经序列分析证明为C型，C型共35％。结论：PCR－RELP分型方法经济实用，分型率达98．3％，广州地区小儿乙肝病毒的基因型以B型和C型为主，其中携带者中B型占优势。     

乙型肝炎病毒B/C基因型重组新方式的探讨

目的 研究HBV B/C基因型重组方式.方法 采用聚合酶链反应扩增4例景洪僾伲族慢性乙型肝炎患者血清中的HBV全基因并与pMD18-T载体相连,转化入大肠杆菌E.coli JM109中,经限制性内切酶酶切鉴定,阳性克隆DNA序列测定后进行HBV基因分型及重组部位的鉴定.结果 4名患者16条HBV全基因均为有不同程度的C基因型毒株重组的B基因型,重组方式有两种:群1与C基因型毒株重组部位只有1个,位于HBV前C/C区nt1825～nt2320,共496 bp;群2与C基因型毒株重组部位有2个,位于P基因区nt822～nt1020和前C/C基因区nt1825～nt2320,共695 bp.结论 这种B/C重组方式尚未见报道,Bj亚型与C基因型毒株除了在前C/C基因区重组外,同时还伴有少部分P基因区重组.     

重组免疫毒素IL3-PE38KDEL真核表达载体的构建

目的:构建大肠杆菌·毕赤酵母表达载体Ppic9k-IL3-Linker-PE38KDEL.方法:用PCR的方法扩增所需要的目的片段IL3及PE38KDEL,再通过酶切和连接的方法定向克隆到载体Ppic9k-Linker中,得到融合基因Ppic9k-IL3-Linker-PE38KDEL.重组载体经酶切,菌落PCR鉴定,DNA序列分析插入片段完全正确.结果:经限制性内切酶酶切鉴定,菌落PCR及DNA序列分析表明重组表达载体Ppic9k-IL3-Lin-ker-PE38KDEL构建成功.结论:成功地构建融合基因IL3-PE38KDEL的毕赤酵母表达载体,为后续的蛋白质的表达、纯化及功能研究奠定基础.     

HBsAg真核表达质粒的构建和鉴定

目的 构建HBsAg真核表达质粒。方法 用PCR的方法从质粒pEcob6中扩增出HBsAg基因，并定向克隆到真核表达质粒pcDNA3．1( )，构建成重组质粒pcDNA3.1—S；然后用限制性内切酶消化和DNA序列测定鉴定结果经酶切和DNA序列测定鉴定，证实重组质粒构建正确。结论 真核表达质粒pcDNA3．1—S构建成功。     

人骨形成蛋白2在昆虫杆状病毒表达系统中的表达及初步鉴定

目的:研究hBMP2在昆虫杆状病毒系统中的表达规律。方法:将编码hBMP2的全长cDNA克隆入转移载体PK8中,重组后的载体与线性化的病毒DNA经脂质体包裹转染昆虫细胞。重组病毒经蓝白筛选后,提取病毒DNA进行PCR扩增,鉴定目的基因。收集重组病毒感染4d的细胞,进行免疫荧光及电子显微镜观察。结果:含有目的基因的重组载体经酶切可切下相应大小的目的基因片段。PCR产物的电泳结果表明,有目的基因片段的扩增。免疫荧光染色呈阳性的颗粒分布在昆虫细胞的胞浆及胞膜。结论:初步证实,hBMP2在此套表达系统中获得了表达。     

乙肝母婴阻断"成功"儿童外周血中检出HBV DNA

目的 检测乙型肝炎母婴阻断成功儿童血清HBV DNA,提出应该完善母婴阻断效果评价指标的建议.方法 采集乙肝疫苗母婴阻断后HBsAg阴性的儿童血清标本,经试剂盒提取HBVDNA,采用巢式PCR方法 扩增HBV DNA S区基因片段后纯化测序.结果 140例儿童血标本中,12例HBV DNA阳性,阳性率8.6%;S基因测序检测未发现突变株.结论 鉴于血清学检测方法 敏感性低于PCR扩增方法 .在评价乙型肝炎母婴阻断效果时,加入HBV DNA指标,可使其更完善.     

真核表达载体pIRES2-EGFP-hFasL的构建及鉴定

背景：FasL通过与靶细胞上Fas结合诱导程序性细胞死亡,可维持机体内稳态,诱导同种异基因移植免疫耐受,促进肿瘤细胞凋亡。 目的：构建带有增强型绿色荧光蛋白报告基因EGFP及目的基因hFasL的真核表达载体pIRES2-EGFP-hFasL。 方法：通过实时聚合酶链反应RT-PCR方法从人外周血淋巴细胞中扩增出hFasL基因,与真核空载体 plRES2-EGFP一起,经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切,T4 DNA连接酶连接,从而构建pIRES2-EGFP-hFasL。用紫外分光光度计测定质粒浓度及纯度,经酶切、PCR技术、基因测序等方法进行鉴定。 结果与结论：扩增出的hFasL条带大小约846 bp,构建的plRES2-EGFP-hFasL经酶切后在846 bp和2 000 bp处有特异性条带,DNA测序证实hFasL与Genebank上的序列完全一致。提示成功构建了含有hFasL及EGFP的真核表达载体plRES2-EGFP-hFasL。     

血管生成素1基因真核表达质粒的构建及测序

目的:构建血管生成素1(Ang1)的真核表达质粒psecTagBk-Ang1。方法:用PCR方法从人心脏文库中扩增Ang1基因全外显子片段, 并定向插入真核表达载体psecTagBk中, 用限制性内切酶酶切和测序鉴定克隆的Ang1基因。结果:扩增出人Ang1cDNA片段, 测序结果显示扩增的Ang1cDNA包括长为1497bp、1494bp的2种剪切体, 分别编码498和497个氨基酸残基。限制性内切酶酶切和DNA测序证实获得正确的重组质粒psecTagBk-Ang1。结论:发现2种共存的Ang1cDNA剪切体, 并成功构建真核表达质粒psecTagBk-Ang1。     

HBV preS2S-rhGM-CSF融合基因表达质粒的构建和表达

目的：研究GM-CSF和preS2对乙肝DNA疫苗的免疫增强作用。方法：采用PCR方法，扩增HBV preS2 S基因约846 bp的片段和rhGM-CSF(包括甘氨酸接头)基因450bp的片段。通过T-A克隆技术和基因定向克隆，构建融合基因的真核表达质粒pcDNA3．1-S2S-rhGM-CSF，并在HepG2细胞中表达。结果：经酶切、PCR及DNA测序鉴定，融合基因表达质粒HBV preS2S-rhGM-CSF成功地构建。将其转染HepG2细胞后，目的基因的转录通过RT-PCR得到证实，而且表达的融合蛋白能与抗-HBs、抗-preS2和抗-GM-CSF单克隆抗体(mAb)均产生特异性反应。结论：融合基因表达载体pcDNA3．1-S2S-rhGM-CSF的成功构建并表达，为进一步研究乙肝DNA疫苗奠定了实验基础。     

HBV与HCV融合DNA疫苗的构建及其体液免疫应答

目的 构建含乙型肝炎病毒（HBV）表面抗原基因（S区基因）与丙型肝炎病毒（HCV）核心抗原基因（C区基因）的嵌合真核表达载体,观察preS1和preS2基因对HBV表面抗原及HCV核心抗原体液免疫的影响。方法 用PCR方法,分别扩增HBV S区基因和HCV C区基因。将S区基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1,酶切鉴定后,大量提取质粒并免疫Balb/c小鼠,用ELISA法检测抗HBs和抗HCV抗体。结果 成功地扩增出目的基因片段,克隆后酶切鉴定结果正确,序列分析与文献报告相一致。免疫后检测到抗HBs和抗HCV抗体。preS1与preS2基因对构建的融合DNA疫苗的体液免疫应答有一定的抑制作用。抗HBs抗体的产生低于只含S基因的真核表达载体;preS1基因对抗HCV抗体的产生具有抑制作用,而preS2无影响。结论 不同长度的HBV S区基因可影响抗HBs和抗HCV抗体的产生。     

鼠β-防御素2(mBD2)真核表达质粒的构建及稳定表达株的鉴定

目的：对小鼠β防御素-2（mBD2）基因进行克隆,构建其真核表达载体,筛选出稳定表达细胞株,并研究mBD2的生物学特性及其抗肿瘤机制。方法：通过向BALB/c小鼠腹腔注射内毒素（LPS）,建立小鼠急性时相反应,取其肺组织提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增小鼠mBD2基因,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后插入相同酶切的pcDNA3.1（＋）真核表达载体,对其进行酶切和测序鉴定。将构建好的真核表达质粒pcDNA3.1（＋）/mBD2转染SiHa细胞,采用G418进行稳定表达株的筛选,用免疫荧光染色和RT-PCR鉴定细胞内mBD2蛋白表达情况。结果：提取小鼠肺组织总RNA,采用RT-PCR方法扩增了250bp左右的产物,通过EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切,构建了真核表达质粒pcDNA3.1（＋）/mBD2。SiHa被该质粒转染后,在100mg/LG418浓度下筛选20d,得到了稳定表达mBD2的细胞株,用免疫荧光染色显示mBD2蛋白在胞质中有大量表达,RT-PCR反应扩增到了mBD2的mRNA。结论：成功地构建了pcDNA3.1（＋）/mBD2真核表达质粒,mBD2蛋白在SiHa细胞中能稳定表达,这些结果为进一步深入研究mBD2的生物学特性及其抗肿瘤的作用奠定了基础。     

SIRT1及其突变体T200I、E420K真核表达载体的构建及鉴定

目的 克隆沉默信息调节因子1（SIRTl）基因的全长cDNA,构建含有SIRT1基因及其突变体T200I、E420K的重组真核表达载体,为进一步研究SIRT1基因功能奠定基础.方法 采用RT-PCR方法扩增SIRT1基因的全长cDNA,扩增产物通过双酶切将全长cDNA克隆到真核表达载体pcDNA3.1（＋）,得到pcDNA3.1 （＋）-SIRT1重组质粒;同时采用定点突变法构建其突变体pcDNA3.1 （＋）-T200I和pcDNA3.1（＋）-E420K表达载体.重组质粒经酶切鉴定和DNA序列测定,筛选出重组成功的真核表达载体.结果 成功克隆了SIRT1基因全长cDNA,并成功构建了pcDNA3.1 （＋）-SIRT1及其突变体的真核表达载体;阳性重组质粒酶切后经测序比对鉴定,与预期序列完全相符,转染293T细胞后可以表达带有HIS标签的SIRT1蛋白.结论 此方法可成功构建重组质粒pcDNA3.1（＋）-SIRT1及其突变体pcDNA3.1（＋）-T200I、pcDNA3.1（＋）-E420K真核表达载体,为SIRT1基因及其突变体T200I、E420K的生物学功能研究提供了基因材料.     

IL—2／HBV PreS融合基因的克隆及序列测定

目的：获得ＩＬ－２／ＨＢＶｐｒｅＳ融合基因克隆，为表达ＩＬ－２／ＨＢＶｐｒｅＳ融合蛋白奠定基础，方法：用ＰＣＲ方法从乙肝全序列中扩增ＨＢＶｐｒｅＳ基因片段，并克隆入带ＩＬ－２基因的ｐｌｙ５质粒中，挑出的阳性克隆再亚克隆到ｐＵＣ１８中进行序列测定。结果：基因全长９３０ｂｐ，编码３１０个氨基酸，序列内有起始码和终止码。结论：所克隆的基因为ＩＬ－２与ＨＢＶｐｒｅＳ的融合基因。     

过表达HSPC238对Bel7402细胞周期的影响

目的:构建pcDNA3.1(-)/HSPC238真核表达载体,研究过表达HSPC238基因对人肝癌细胞株Bel7402细胞周期的影响。方法:采用PCR法从pET28b/HSPC238重组质粒中克隆得到HSPC238 cDNA全长序列,并将该片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中,构建pcDNA3.1(-)/HSPC238真核表达质粒。经酶切和测序鉴定后,采用脂质体法将该重组质粒转染Bel7402细胞,随后经G418筛选4周,得到阳性克隆细胞株。用RT-PCR和Western blot技术分别检测HSPC238基因在Bel7402中的mRNA和蛋白水平的表达。随后用饥饿法使各组细胞周期同步化,再用流式细胞仪分析HSPC238过表达对细胞周期的影响。结果:pcDNA3.1(-)/HSPC238经酶切鉴定及DNA测序证实,目的基因HSPC238的序列完全正确;RT-PCR和Western blot检测显示,与转染pcDNA3.1(-)组和未转染组相比较,转染pcDNA3.1(-)/HSPC238组的mRNA和蛋白表达水平均明显增高,但前两者间没有差异。用饥饿法同步化后,流式细胞仪检测显示过表达HSPC238可延缓Bel7402细胞株从G1期进入S期。结论:成功构建了pcDNA3.1(-)/HSPC238真核表达载体,并在Bel7402中表达。初步发现过表达HSPC238可延缓肝癌细胞的细胞周期,为更进一步研究HSPC238蛋白的功能奠定了基础。     

赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体的构建及表达的初步研究

目的:构建赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体并在COS-7细胞中表达,为钩端螺旋体DNA疫苗的研究和开发奠定基础.方法:从赖型钩端螺旋体017株全基因组中PCR扩增出目的基因,双酶切构建重组质粒pcDNA3.1-LipL32.脂质体转染法将重组质粒转染COS-7细胞,通过RT-PCR、Western blot检测目的基因的表达.结果:成功构建了LipL32基因的真核表达载体,并在COS-7细胞中获得瞬时和稳定表达.结论:赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体能在哺乳动物细胞内表达,为钩端螺旋体DNA疫苗的应用提供了实验依据.     

人α-防御素-1(α-HNP-1)基因真核表达载体的构建及在大鼠骨髓间充质干细胞中的转染表达

目的构建人α-防御素-1(α-HNP-1)基因的真核表达载体,并且转染大鼠骨髓间充质干细胞。方法提取人外周血粒细胞中的总RNA,反转录为cDNA作为模板,采用PCR的方法扩增得到人α-防御素-1(α-HNP-1)的基因片断。将扩增产物连接入pGEM-T载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,蓝白筛选,对PCR及酶切鉴定含有目的片断的克隆进行测序。经测序证实无误后,将获得的pGEM-T-HNP-1重组质粒上的α-HNP-1基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)上,构建HNP-1的真核表达载体pcDNA3.1-HNP-1。将真核表达载体pcDNA3.1-HNP-1用脂质体法转染原代大鼠骨髓间充质干细胞,用免疫组化法检测α-HNP-1的表达。结果获得预期大小为303bp的RT-PCR产物;经PCR、酶切鉴定和DNA测序分析证实重组质粒载体pcDNA3.1-HNP-1构建正确;免疫组化法显示转染细胞呈阳性反应。结论成功构建HNP-1基因的真核表达载体,并且在大鼠骨髓间充质干细胞中能成功表达。     

mOX40-Ig的表达及其生物学活性的初步研究

目的:构建pcDNA3.1-mOX40-Ig真核表达载体,转染CHO细胞进行稳定表达,获得有生物学活性的mOX40-Ig融合蛋白.方法:RT-PCR法扩增获得hIgG1Fc段基因,构建pcDNA3.1-hIgG1Fc重组质粒并经测序证实.从本室保存的pIRES2-EGFP-mOX40重组质粒中PCR扩增mOX40胞外段,将其插入pcDNA3.1-hIgG1Fc重组质粒中构建pcDNA3.1-mOX40-Ig真核表达载体.脂质体法转染CHO细胞获得稳定表达,用RT-PCR与ELISA法检测其表达,蛋白A亲和纯化后,SDS-PAGE进行鉴定.3H-TdR掺入法研究OX40信号对B细胞的体外促增殖作用.结果:测序证实hIgG1Fc段、mOX40胞外段及mOX40-Ig基因序列正确,RT-PCR与ELISA证实mOX40-Ig的表达,SDS-PAGE证实其为mOX40-Ig融合蛋白,3H-TdR掺入法显示mOX40-Ig在体外能有效地促进B细胞增殖.结论:成功地构建pcDNA3.1-mOX40-Ig真核表达载体,并获得有生物学活性的mOX40-Ig融合蛋白的稳定表达,为进一步开展OX40相关领域的横向应用研究奠定了基础.     

人呼吸道合胞病毒F基因的克隆、真核表达与鉴定

目的 克隆人呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial virus,HRSV）F基因,构建F基因的真核表达载体pcDNA3．1（＋）/F,并进行表达和鉴定。方法根据编码F蛋白的基因序列设计引物,通过RT-PCR从感染HRSV的HEp-2细胞中扩增获得F蛋白的基因,然后克隆到pGEM-3zf载体中,序列测定正确后,将其亚克隆到真核表达载体pcDNA3．1（＋）,行酶切鉴定,脂质体法转染COS-7细胞,应用Western blotting方法分析F基因表达情况。结果测序证实得到HRSVF基因序列,序列分析显示没有发生无义突变。转染COS-7细胞后,利用Western blotting方法检测到了F蛋白的特异性条带。结论成功克隆HRSVF基因,并在真核细胞中获得表达。