乳鼠心肌膜微血管内皮细胞的体外培养

目的 改进心肌膜微血管内皮细胞的体外培养方法,为进一步研究其结构和功能提供实验数据.方法 选取10～15d龄的SD大鼠,采用植块法培养原代心肌膜微血管内皮细胞,在继代培养中通过差速消化和差速贴壁方法、结合倒置显微镜下形态学的观察进行继代培养和纯化,利用免疫细胞化学方法检测第Ⅷ因子相关抗原对培养细胞进行了鉴定.结果 成功培养了大鼠心肌膜微血管内皮细胞,细胞呈多边形或鹅卵石状;免疫细胞化学染色第Ⅷ因子相关抗原显阳性.结论 改良了心肌膜微血管内皮细胞的体外培养方法,获得了较高纯度的心肌膜微血管内皮细胞,可用于进一步的科学研究.     

大鼠肠黏膜微血管内皮细胞的体外培养

目的培养大鼠肠黏膜微血管内皮细胞,为内皮细胞的体外研究提供实验材料。方法利用机械吹打法和酶消化法分别分离出肠绒毛固有层,采用植块培养法培养原代内皮细胞,依次以局部消化法和差速黏附法进行纯化,细胞鉴定采用第Ⅷ因子相关抗原免疫荧光检测和硝酸银染色。结果成功分离培养出大鼠的肠黏膜微血管内皮细胞,纯化后的细胞可传到18代以上。结论为肠黏膜微血管内皮细胞的体外培养建立了一种操作简单、成本低廉的方法。     

人胎盘微血管内皮细胞的分离培养及鉴定

背景:建立高纯度的人胎盘微血管内皮细胞体外培养体系对研究胎盘功能是十分必要的。目前,国内外研究多采用三步酶消化法结合免疫磁珠法分离胎盘微血管内皮细胞,然而步骤过于繁琐且对细胞损伤较大。因而,如何简化人胎盘微血管内皮细胞分离步骤,同时又能提高目标细胞纯度的体外培养方法成为研究热点。目的:探索一种简便高效的从早期绒毛组织中分离人胎盘微血管内皮细胞的体外培养方法,观察细胞生长状态并进行鉴定。方法:利用健康孕6-8周孕妇行人工流产后的绒毛组织,经两步酶消化法和非连续Percoll密度梯度离心得到人胎盘微血管内皮细胞,传代时利用胰酶消化法和反复贴壁法对细胞进行纯化。结果与结论:实验成功获取人胎盘微血管内皮细胞,原代培养的人胎盘微血管内皮细胞在培养24 h后基本完全贴壁,第10天进入对数生长期,第12至13天细胞浓度达80%,传代细胞较原代细胞生长活跃,培养5-7 d可长满培养瓶底,呈"铺路石样"排布。免疫荧光化学结果显示,培养的细胞中FⅧ因子与CD31相关抗原双荧光染色呈阳性,细胞阳性率达100%。MTT法测得培养第5代人胎盘微血管内皮细胞的生长曲线呈倒"S"形。结果证实,应用两步酶消化法、非连续Percoll密度梯度离心法分离细胞,并利用胰酶消化法和反复贴壁法纯化细胞,可获得大量高纯度的人胎盘微血管内皮细胞。     

小鼠脑微血管内皮细胞的原代培养与纯化

目的:探讨纯度较高的小鼠脑微血管内皮细胞的分离与原代培养。方法:取8～14周龄BALB/c或C57/BL6小鼠,无菌分离脑组织,采用改进的两种方法即2次酶消化和1次密度梯度离心法及1次酶消化和1次密度梯度离心法分离小鼠脑微血管段,接种于涂布有Ⅳ型胶原的培养皿上进行原代培养,相差显微镜下观察细胞形态,并以免疫荧光法鉴定Ⅷ因子相关抗原。结果:改进的两种方法均可见内皮细胞在接种后12～16 h从微血管段周围爬出,5～7 d时细胞呈"漩涡状"生长,并可见细胞汇合,90%以上培养的细胞Ⅷ因子相关抗原表达阳性。结论:改进后的两种方法均能进行较高纯度的小鼠腑微血管内皮细胞的分离和原代培养。     

大鼠心肌微血管内皮细胞的体外原代培养

目的 体外原代培养大鼠心肌微血管内皮细胞(MMVECs)，并观察其生长特性。方法采用酶蛋白消化法培养大鼠MMVECs，用差速贴壁法和亚细胞克隆法纯化细胞，用第Ⅷ因子相关抗原和CD31相关抗原鉴定细胞，倒置相差显微镜下观察细胞生长状态。结果 成功培养出纯度很高的MMVECs，可用于MMVECs相关实验研究。结论 此原代培养MMVECs的方案具有较好的可操作性和可重复性。     

原代大鼠脑微血管内皮细胞的培养及鉴定

建立一种纯度较高的原代大鼠脑微血管内皮细胞的分离培养方法。取7～10日龄SD大鼠脑组织,经匀浆,牛血清白蛋白密度梯度离心,Ⅱ型胶原酶消化获得脑微血管段后,置于CO_2培养箱中进行原代培养。通过细胞形态学观察、第Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学染色鉴定所培养的细胞。在倒置显微镜下,体外培养24～48 h后,细胞从贴壁的脑微血管段周围爬出,单个细胞为短梭形或多角形,呈团簇状单层贴壁生长,待细胞密集融合后,则成典型的"铺路石样"涡旋状排列;Ⅷ因子免疫细胞化学染色检测,相关抗原表达为阳性,细胞胞质显棕黄色,阳性细胞率达99%以上。该方法能够成功分离培养出原代大鼠脑微血管内皮细胞。     

大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养

目的分离、培养原代脑微血管内皮细胞,建立体外血脑屏障模型。同时探索高纯度、活性好的脑微血管内皮细胞的分离培养方法。方法取3周大鼠大脑,分离皮质,经过匀浆、葡聚糖离心以及消化后,取纯度较高的脑微血管段种植于胶原蛋白包被过的塑料培养瓶中进行培养。显微镜观察及检测Ⅷ因子相关抗原。结果镜下细胞呈长梭形。7d左右细胞可融合,Ⅷ因子相关抗原免疫组化检测为阳性．且阳性细胞占绝大部分。结论本实验成功分离大鼠脑微血管内皮细胞,并进行原代培养,为脑微血管内皮细胞的进一步研究提供了模型．也为构建更高级的大鼠体外血脑屏障奠定基础。     

大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养及其生物学行为初步探讨

本文旨在探讨建立稳定的大鼠原代脑微血管内皮细胞的培养方法,并对其血脑屏障特性进行初步研究。通过匀浆、葡聚糖高速梯度离心提取大鼠脑皮层微血管段,用胶原酶消化后,在37℃,5%CO2孵箱中进行原代及传代细胞培养,以跨内皮阻抗值分析其血脑屏障特性随传代次数的改变。结果证明:原代培养后7～10d沿微血管段生成单层"铺路石"样细胞,经VIII因子证实95%以上的培养细胞是血管内皮细胞,通过传代可以进一步纯化,得到稳定的脑微血管内皮细胞系,原代培养的脑微血管内皮细胞表现出很强的屏障特性,与内皮细胞株之间有显著差异,随着传代次数的增加脑微血管内皮细胞的跨内皮阻抗减弱。以上结果表明,采用匀浆、梯度离心、胶原酶消化是获取大鼠脑微血管内皮细胞稳定的方法,原代培养的脑微血管内皮细胞是研究血脑屏障的最佳技术手段。     

大鼠脑皮质微血管内皮细胞的分离和培养

目的： 本研究旨在探索1种有效分离、培养和获取较高纯度大鼠脑微血管内皮细胞（BMECs）的方法。方法: 自12 d SD大鼠脑分离出皮质，采用二次酶消化、BSA和Percoll非连续梯度离心获得较纯的脑微血管段后，接种于涂布有明胶的培养皿进行原代培养；相差显微镜观察细胞的形态学特性，进行血管内皮细胞特异性标志物Ⅷ因子相关抗原免疫组化检测。结果: 培养24 h即可见细胞从贴壁的脑微血管段周围爬出，细胞呈短梭形，集落呈典型的“鹅卵石样”，区域性单层生长，6-7 d内皮细胞开始融合，血管内皮细胞特异性标志物Ⅷ因子相关抗原表达阳性，纯度达92.6%。结论: 成功地自大鼠脑皮质分离并培养出纯度较高的BMECs，为进一步开展脑微血管内皮细胞的生物学特性的相关研究提供有用的方法。     

大鼠脑动脉内皮细胞培养

目的:探讨获取高纯度的原代SD大鼠脑动脉内皮细胞(cerebral artery endothelial cell,CAEC)的培养方法。方法:选取5~6周SD雄性大鼠6只,体重110~140 g,取大脑,取脑动脉,剪碎,接种于明胶包被的直径35 mm培养皿中,内皮细胞培养基培养;采用倒置显微镜观察内皮细胞生长状况及其形态;免疫荧光法检测动脉内皮标志物Ⅷ因子相关抗原的表达。结果:培养60 h后可见细胞从贴壁的血管片段周围长出,细胞呈梭形;培养7 d后细胞可融合成片,融合后的脑动脉细胞呈典型的"鹅卵石"样外观;免疫荧光法检测显示动脉内皮标志物Ⅷ因子相关抗原表达阳性,内皮细胞纯度90%以上。结论:该方法能够成功获得纯度较高的原代SD大鼠脑动脉内皮细胞。     

Ephrin‐A3 and Ephrin‐A4 Contribute to Microglia‐Induced Angiogenesis in Brain Endothelial Cells

The association of microglia with brain vasculature during development and the reduced brain vascular complexity in microglia‐deficient mice suggest the role of microglia in cerebrovascular angiogenesis. However, the underlying molecular mechanism remains unclear. Here, using an in vitro angiogenesis model, we found the culture supernatant of BV2 microglial cells significantly enhanced capillary‐like tube formation and migration of brain microvascular endothelial cells (BMECs). The expression of angiogenic factors, ephrin‐A3 and ephrin‐A4, were specifically upregulated in BMECs exposed to BV2‐derived culture supernatant. Knockdown of ephrin‐A3 and ephrin‐A4 in BMECs by siRNA significantly attenuated the enhanced angiogenesis and migration of BMECs induced by BV2 supernatant. Our further results indicated that the ability of BV2 supernatant to promote endothelial angiogenesis was caused by the soluble tumor necrosis factor α (TNF‐α) released from BV2 microglial cells. Moreover, the upregulations of ephrin‐A3 and ephrin‐A4 in BMECs in response to BV2 supernatant were effectively abolished by neutralization antibody against TNF‐α and TNF receptor 1, respectively. The present study provides evidence that microglia upregulates endothelial ephrin‐A3 and ephrin‐A4 to facilitate in vitro angiogenesis of brain endothelial cells, which is mediated by microglia‐released TNF‐α. Anat Rec, 297:1908–1918, 2014. © 2014 Wiley Periodicals, Inc.     

缺氧条件下间充质干细胞以旁分泌方式影响脑微血管内皮细胞的功能

目的：探讨缺氧条件下间充质干细胞（MSCs）以旁分泌方式对脑微血管内皮细胞（BMECs）的增殖、迁移和细胞单层通透性的影响。 方法:分离、培养并鉴定人MSCs和大鼠BMECs，ELISA检测细胞条件培养基中VEGF和MMP-9的含量，跨内皮电阻（TEER）检测反映脑BMECs单层通透性的变化，观察不同条件培养基对缺氧BMECs增殖、迁移和通透性的影响。结果:VEGF和MMP-9在MSCs条件培养基中的含量显著高于BMECs条件培养基，缺氧处理的MSCs条件培养基中VEGF和MMP-9含量比正常MSCs条件培养基显著增高；MSCs条件培养基能明显促进BMECs在缺氧条件下的增殖和迁移，但也使BMECs的TEER显著降低（50.5％±2.6％，P<0.05），这些作用在不同程度上能被VEGF抗体和MMP-9抑制剂所抑制。结论:缺氧条件下MSCs可通过旁分泌方式促进BMECs增殖和迁移，但同时也增加了BMECs单层的通透性。     

辛伐他汀对不同氧供条件下大鼠脑微血管内皮细胞跨内皮电阻及MMP-9表达的影响

目的:观察在常氧、短暂缺氧、持续缺氧及复氧条件下,辛伐他汀对大鼠脑微血管内皮细胞(BMECs)跨内皮细胞电阻(TEER)及基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达的影响。方法:原代分离培养SD大鼠BMECs,随机分为常氧组、短暂缺氧组、持续缺氧组、复氧组,各组均实施辛伐他汀0.1μmol/L、1.0μmol/L、10μmol/L3种浓度预处理。观察各组细胞形态学及增殖活性变化;采用TEER评估各组通透性;免疫细胞荧光化学法测定MMP-9蛋白表达。结果:短暂缺氧、持续缺氧及复氧条件下大鼠BMECs细胞受损逐渐加重,MMP-9表达逐渐增加,TEER及细胞增殖活性逐渐下降。辛伐他汀干预能不同程度提高TEER并抑制MMP-9蛋白的表达,使细胞增殖活性提高。但这种抑制MMP-9的作用对短暂缺氧大鼠BMECs的TEER值及细胞增殖活性无显著改善。结论:辛伐他汀能通过抑制MMP-9蛋白的表达来提高持续缺氧及复氧条件下大鼠BMECs的TEER,而对短暂缺氧后TEER的改善作用不明显。     

瑞舒伐他汀改善缺氧/复氧引起的脑微血管内皮细胞损伤的作用

目的:探讨瑞舒伐他汀改善缺氧/复氧引起的小鼠脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells,BMECs)损伤的作用及其可能机制。方法:原代分离培养BALB/c小鼠BMECs,利用氧糖剥夺/复氧模拟体外缺血再灌注损伤,以瑞舒伐他汀处理干预。观察细胞形态,通过MTT实验测定BMECs细胞的活力,荧光染料羧基荧光素二乙酸酯琥珀酰亚胺脂(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester,CFDA-SE)细胞增殖检测试剂盒观察造模及用药后细胞数目百分比的变化;免疫荧光染色检测细胞凋亡相关蛋白cleaved caspase-3的水平; Western blot法检测Bcl-2、Bax、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP) 2、MMP9、磷酸化核因子κB(phosphorylated nuclear factor kappa B,p-NF-κB)、磷酸化P38丝裂原活化蛋白激酶(phosphorylated P38 mitogen-activated protein kinase,p-P38)和磷酸化c-Jun氨基末端激酶(phosphorylated c-Jun N-terminal kinase,p-JNK)的蛋白水平。结果:浓度为10μmol/L的瑞舒伐他汀可抑制氧糖剥夺/复氧诱导的BMECs存活率减低现象,同时维持BMECs结构。此外,瑞舒伐他汀能够显著抑制cleaved caspase-3、MMP2、MMP9、p-NF-κB、p-P38及p-JNK的蛋白水平(P 0. 05),上调氧糖剥夺/复氧导致的Bcl-2/Bax降低(P 0. 05)。结论:瑞舒伐他汀可通过降低凋亡相关蛋白及基质金属蛋白酶的表达,对抗缺氧/复氧引起的BMECs损伤,提示其在缺血再灌注损伤时维持血脑屏障完整性方面具有潜在应用价值。     

缓激肽对胶质瘤血瘤屏障体外模型中钙激活钾电流的作用

目的建立胶质瘤血瘤屏障体外模型,研究缓激肽(BK)对胶质瘤血瘤屏障钙激活钾电流(Ikca)的作用,探讨BK开通血瘤屏障的机制。方法条件培养和共培养,膜片钳全细胞记录。结果条件培养的脑微血管内皮细胞(BMECs)形态无明显变化,胶质瘤C6细胞之间相互接触紧密。共培养的BMECs和C6细胞各自聚集,之间形成界面,1μmol.L-1缓激肽使BMECs和C6细胞界面内钙激活钾电流下降。结论1μmol.L-1的缓激肽抑制部分血瘤屏障体外模型BMECs和C6细胞的钙激活钾电流。     

内皮-单核细胞激活多肽酶Ⅱ增强血肿瘤屏障通透性的机制

目的研究内皮-单核细胞激活多肽II(endothelial monocyte activating polypeptide-II,EMAP-II)选择性开放血肿瘤屏障(blood-tumor barrier,BTB)的作用机制。方法荷瘤大鼠被随机分成4组(每组12只):对照组,EMAP-II组,寡霉素组和寡霉素+EMAP-II组。采用伊文思蓝(Evans blue,EB)渗透性实验评估各组BTB通透性变化情况;Western Blot法检测脑微血管内皮细胞上紧密连接相关蛋白ZO-1的表达水平变化;双重免疫荧光法检测EMAP-II和α-ATP合成酶在脑微血管内皮细胞上的分布。结果 EMAP-II组BTB通透性显著高于对照组和寡霉素组(<0.01),紧密连接相关蛋白ZO-1的表达水平显著降低(<0.01),其作用受到ATP合成酶抑制剂寡霉素(Oligomycin)的显著抑制(<0.05);EMAP-II与α-ATP合成酶在胶质瘤微血管内皮细胞上共定位。结论 EMAP-II可能通过开放紧密连接增强BTB的通透性,脑微血管内皮细胞上的α-ATP合成酶是其可能的作用位点。     

脑皮质微血管内皮细胞刺激神经干细胞增殖并增强向神经元分化的潜能

目的体外观察脑皮质微血管内皮细胞(CMECs)对来自大鼠海马神经干细胞(NSCs)增殖和分化的影响响。方法采用Transwell建立神经干细胞与脑微血管内皮细胞共培养模型,通过相差显微镜形态学观察及共培养早期nestin和NF,及后期NF免疫组化检测鉴定,计算各阳性细胞数、总细胞数和阳性细胞率。结果在共培养第7天,共培养组NSCs的nestin阳性率为(64.04±9.40)%,对照组仅(9.41±4.80)%(P<0.01);NF阳性细胞率为(13.72±3.92)%,对照组仅(39.79±5.20)%(P<0.01);撤除CMECs后第4天,共培养组NSCs分化成神经元的比例为(55.42±4.75)%,对照组仅(27.18±2.62)%(P<0.01)。结论本结果提示CMECs能促进NSCs的自我更新,抑制其分化,并有增强其向神经元方向分化的潜能。     

Production of stromal cell-derived factor-1 (SDF-1)and expression of CXCR4 in human bone marrow endothelial cells

This study investigated the production of stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) and the expression of CXCR4 in human bone marrow endothelial cells (BMECs). Human BMEC cell line BMEC-1 cells expressed SDF-1 mRNA, and conditioned medium induced chemoattraction of CD34+ cells. Migration was not inhibited by pretreating the input cells with pertussis toxin, indicating that the chemoattractive activity was not dependent on SDF-1. Three-day culture of BMEC-1 and primary human BMEC cells produced 1,710+/-204 and 1,050+/-153 pg/mL SDF-1alpha, respectively, which was much less than primary human BM stromal cells (29,536+/-532 pg/ mL). By immuno-histochemistry, CXCR4 was detected in the endothelial cells lining sinusoids, arterioles, and venules in the bone marrow. However, cultured BMECs and BMEC-1 cells did not express CXCR4 on their surfaces. These results indicate that BMECs produce and release small amounts of SDF-1 and express CXCR4 in vivo only.     

血脑屏障氧糖剥夺体外模型大鼠脑微血管内皮细胞miRNA表达变化

目的 研究体外血脑屏障氧糖剥夺模型大鼠脑微血管内皮细胞miRNA表达变化.方法 提取纯化大鼠脑微血管内皮细胞,建立血脑屏障氧糖剥夺模型,模拟在体缺血,在氧糖剥夺60 min,应用基因芯片技术检测氧糖剥夺前后miRNA表达谱.利用靶基因软件对部分高表达的miRNA进行靶基因预测.结果 共有278个miRNA表达,与正常对...