人心房组织膜蛋白SK2的提取方法

目的：优化人心房组织膜蛋白提取方法。方法：分步离心法提取心肌膜蛋白,SK2膜蛋白用western-blot检测。结果：BCA检测出蛋白浓度,western-blot检测出蛋白条带。结论：此方法能够提取人心房组织的膜蛋白SK2,该方法简单,稳定,可靠,提取的膜蛋白质量好,浓度高,并能进行下一步的western-blot的实验,以便将来检测SK2膜蛋白在窦性和房颤患者心房组织之间表达的差异。     

不同组织裂解液对细胞因子ELISA检测的影响

目的研究不同组织裂解液对ELISA检测细胞因子浓度的影响。方法 RIPA、PBS及ELISA试剂盒自带的稀释液分别用于稀释IFNγ,IL-10,IL-6,TNFα细胞因子的标准品,并对标准品进行检测。结果 RIPA稀释液显著抑制IFNγ标准品检测结果。结论 ELISA检测细胞因子时需要根据检测的细胞因子的不同,选择相应的裂解液对样本进行处理。     

不同细胞裂解液提取总蛋白在免疫印迹中的效果分析

目的：寻找一种适合乳腺癌细胞MCF-7蛋白提取的裂解液配方用于免疫印迹分析。方法：配制两种不同的细胞裂解液A与B,分别对培养的密度相当的人乳腺癌细胞MCF-7进行总蛋白的提取,Bradford法测蛋白含量,聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）对蛋白进行分离,免疫印迹法检测β-actin和Twist的表达,比较2种裂解液裂解效果。结果：2种细胞裂解液均可满足免疫印迹分析的要求,B液提取的蛋白含量虽比A液高,但A液用于免疫印迹检测β-actin和Twist的效果更佳。结论：免疫印迹分析结果显示：A细胞裂解液（50 mM pH 7.4 Tris-HCl,150 mM NaCl,0.1%SDS,1%NP-40,1 mM EDTA,临用前加入PMSF使终浓度为1mM）可作为提取乳腺癌细胞MCF-7中蛋白的一种理想配方。     

改良裂解法提取微量组织DNA的研究

为了探讨微量组织核酸的冷静 效的提取方法,采用改良裂解法提取２５例微量胃粘膜组织村本的核酸,同时与经典的饱和酚抽提法和简便的消化煮沸法进行比较,用１％琼脂糖电泳观察结果,并用分光光度法检测提取核酸的量。结果显示该法的提取纯度接近酚抽提法,所获核酸的量较多,而所需的时间最短;     

流式细胞仪全血红细胞裂解液研究

目的 研制流式细胞仪全血红细胞裂解液,并与进口试剂比对效果,以期大大降低试剂的成本,使其在中国广泛应用。方法 采用流式细胞术,分别用进口试剂和自制试剂制备全血样品,比较两种试剂对30例健康体检者白细胞分群的影响、淋巴细胞亚群比例的影响、淋巴细胞亚群的平均荧光强度的影响。结果 自制试剂制备的样品中淋巴细胞、单核细胞和粒细胞的分布与进口试剂一致;自制试剂制备的样品,T淋巴细胞（CD3^＋）、B淋巴细胞（CD19^＋／CD3^-）、辅助／诱导T淋巴细胞（CD3^＋CIM^＋CD8^-）、抑制／细胞毒T淋巴细胞（CD3^＋CD4^-1CD8^＋）、NK细胞（CD16^＋56^＋／CD3^-1）的百分率与进口试剂无明显差异（P〉0．05）;自制试剂制备的样品,T淋巴细胞、B淋巴细胞、辅助／诱导T淋巴细胞和抑制／细胞毒T淋巴细胞的平均荧光强度与进口试剂无明显差异（P〉0．05）,但NK细胞的平均荧光强度弱于进口制剂（P〈0．05）。结论　与进口试剂比对的结果表明,自制试剂对白细胞的分群、淋巴细胞亚群的百分率、淋巴细胞表面分子CD3、CD4、CD8、CDl9的表达量,均达到了进口试剂的效果,而成本大大降低。     

煮沸裂解法快速提取大鲵DNA

目的建立大鲵基因组DNA快速简便高效的提取方法。方法借鉴煮沸裂解法制备质粒DNA方法,改进后用于提取大鲵基因组DNA。结果本方法提取DNA纯度高（A260/A28介于1.7~2.1之间）,耗时短（2h）,毒性小,分子大小约为23kb,适用于PCR扩增及后续分析。结论本方法提取基因组DNA纯度高、耗时短、提取所用试剂毒性小、成本低,值得在大鲵基因组DNA提取中使用,也可为其他动物的相关研究提供参考。     

红细胞裂解液对CD34+细胞相对计数的影响及其原因初步探讨

目的：研究红细胞（red blood cell,RBC）裂解液对CD34+细胞相对计数的影响。方法：收集101份外周血干细胞采集物,CD34-PE及CD45-FITC双色免疫荧光染色后,分别用FACS裂解液（FACSTM lysing solution,FACS）、Optilyse C裂解液（optilyse C lysing solution,Optilyse C）及自配裂解液溶解红细胞,采用洗涤程序和运用ISHAGE设门策略,检测CD34+细胞、淋巴、粒、单核细胞相对数,CD45+ 细胞占全部收集信号百分比及各类细胞前向散射光（forward scatter,FSC）及侧向散射光（side scatter,SSC）信号。结果：比较3种裂解液处理后样本的CD34+ 细胞百分比,FACS裂解液处理的样本CD34+ 细胞百分比最低,自配裂解液最高（FACS vs. Optilyse C vs. 自配=0.49±0.43 vs. 0.67±0.50 vs. 0.73±0.66,P=0.000）。FACS裂解后样本CD45+细胞百分比远高于Optilyse C及自配裂解液（t=142.500,P=0.000）。3种裂解液对淋巴细胞百分比结果（F=35.340,P=0.000）具有统计学差异;而粒细胞百分比（F=0.610,P=0.540）、单核细胞百分比（F=1.590,P=0.210）差异无统计学意义。FACS裂解液处理后,CD34+ 细胞、淋巴细胞的FSC和SSC信号强度均弱于Optilyse C裂解液及自配的裂解液;而粒、单核细胞的SSC信号,FACS裂解液处理后最强,Optilyse C裂解液处理后最弱。另外,动员后的白细胞数多少与CD34+ 细胞百分比不存在相关性（r=0.108,P=0.312）。结论：红细胞裂解液导致CD34+细胞相对计数差异的原因可能与CD45+细胞比例有关,即获取的有效细胞数;裂解液对细胞形态的影响与造成淋巴细胞比例有显著性差异有关。鉴于不同红细胞裂解液对CD34等抗原阳性细胞的相对计数确实有不良影响,因此在应用流式细胞术检测或计数时应慎重选择。     

单克隆抗体SZ—39识别的人脑胶质瘤细胞SHG—44膜蛋白的提取

目的：提取ＭｃＡｂ ＳＺ－３９识别的人脑胶质瘤细胞ＳＨＧ－４４膜抗原蛋白,为其进一步研究作准备。方法：分别以两组去污剂（１）２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１１４;（２）１％ＳＤＳ、１％去氧胆酸钠、１％ＮＰ－４０、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ裂解ＳＨＧ－４４细胞,提取细胞蛋白,再以ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法分离蛋白,并以Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ法分析鉴定。结果：ＭｃＡｂ ＳＺ－３９识别的蛋白呈一条区带,分子量为６０ｋＤ     

颗粒溶素融合蛋白的克隆表达和免疫学鉴定

目的采用基因工程方法重组并表达颗粒溶素融合蛋白。方法采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)克隆颗粒溶素多肽分子的cDNA,经测序证实后定向插入表达载体pET28a( ),并经双酶切电泳鉴定。进而导入大肠杆菌BL21(DE3)plyS中,经异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导后表达重组融合蛋白。结果经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、Western印迹法鉴定,在相对分子质量为9000处有明显的条带。结论经重组表达获得颗粒溶素融合蛋白,有助于进一步探讨颗粒溶素与临床疾病的相关性。     

Smad2/3/4真核表达质粒的构建及重组蛋白表达

目的:构建pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4真核表达质粒,证实融合蛋白在细胞内表达。方法:以pcDNA3.1-Smad2/3和pGEX2T-Smad4质粒为模板,设计特异性引物,PCR扩增Smad2/3/4全长编码基因,亚克隆至含有pcDNA3.1myc-HisA 标签的真核表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到人胚胎肾细胞HEK293 中,提取细胞蛋白进行 Western blotting 检测。结果：Smad2/3/4 全长基因序列克隆到真核表达载体pcDNA3.1myc-HisA中,酶切鉴定片段为1 401、1 275和1 656 bp。Western blotting检测到融合蛋白pcDNA3.1myc-HisA- Smad2/3/4的表达。结论:成功构建pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4真核表达质粒,同时鉴定其融合蛋白的表达。     

胰腺组织总蛋白分步提取法的建立

目的:通过对提取狗胰腺组织总蛋白不同方法的研究,建立提取胰腺组织总蛋白的标准方法.方法:用常规的总蛋白一步提取法和三步提取法,以三种溶解性能不同的裂解液分步提取胰腺组织中的总蛋白,测量蛋白浓度并分别用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight-mass spectra,MALDI-TOF-MS)做蛋白全谱.结果:一步法和分步法总蛋白提取量分别为(18.8±1.2) mg和(23.3±0.9) mg,MALDI-TOF-MS蛋白全谱的谱峰数分别为(22.2±4.5)个和(32.8±3.8)个.结论:分步法与常规的一步法相比具有蛋白提取率高、蛋白溶解性好等优点.     

不同切肝量对大鼠肝脏HSP 70表达的影响

目的探讨大鼠肝脏HSP70在评价手术创伤程度中的意义。方法建立不同肝切量的大鼠创伤模型,160只健康雄性SD大鼠随机分成正常对照组及轻度、中度、重度创伤组,采用western blotting方法,动态观察各创伤组术后2、8、12、24、48 h肝组织中HSP70的表达情况。结果各创伤组伤后HSP70的表达迅速增加,8 h达到峰值后逐渐下降,48 h降至正常水平,随着肝切量的增多这种变化更加明显。结论手术创伤后肝组织HSP70表达升高,于8 h达到峰值,提示HSP70可能是创伤后早期参与肝细胞损伤机制启动的一个重要因素。随着肝切量的增加,HSP70的表达增高,提示HSP70的表达可作为判断肝脏手术创伤程度的一个指标。     

去整合素kistrin对晶状体摘除术后兔晶状体上皮细胞MMP-2蛋白表达的影响

目的研究去整合素kistrin对晶状体摘除术后兔晶状体上皮细胞(LECs)中基质金属蛋白酶2(MMP-2)蛋白表达的影响。方法对40只新西兰大白兔右眼行透明晶状体摘除术(ECLE),术毕随机分为实验组及对照组,实验组囊袋内注入0.2 mL浓度为80 ng/mL的kistrin,对照组注入等量林格液,随机取10只左眼为空白组。分别于术后14 d(实验组A组、对照组B组)及3个月(实验组C组、对照组D组)取后囊膜,以肺癌组织为阳性对照组。应用Western blotting检测兔后囊膜组织及肺癌组织中的蛋白表达量。结果空白组后囊膜MMP-2无蛋白表达,A、B、C、D组均有蛋白表达。B组MMP-2的相对灰度值为0.769±0.011,A组为0.378±0.019;D组为1.015±0.020,C组为0.361±0.013,低于D组(P=0.000);D组相对灰度值较B组升高(P=0.000);A组、C组相对灰度值差异无统计学意义(P=0.217)。结论整合素kistrin可能在晶状体摘除术后MMP-2的表达中发挥重要的作用,这可能与Ⅳ型胶原的分泌减少密切相关。     

高内涵分析及Western blotting法在蛋白质核质分布研究中的应用及比较研究

目的 使用不同方法对蛋白质的核质分布进行检测并比较差异。方法 细胞经免疫荧光染色后使用高内涵分析（high content analysis,HCA）对蛋白质的细胞质或细胞核总荧光强度进行分析;分别提取胞质及胞核蛋白,使用Western blotting法对核质组分中的蛋白质含量进行鉴定。结果 两种方法均可检测到蛋白质的出核转运;经定量分析,HCA法检测到的HuR蛋白质/核比升高倍数小于Western blotting法。结论 使用HCA法检测蛋白质核质定位具有准确、客观、成本低、快捷、多参数等特点,不失为Western blotting的有效补充及替代方法。     

凋亡抑制蛋白survivin在乳腺癌中的表达及意义

目的：检测凋亡抑制蛋白survivin在人乳腺癌中的表达,进一步探讨其在乳腺癌发生发展中的作用。 方法：采用免疫组织化学和蛋白印迹技术,研究54例乳腺癌组织(其中有腋窝淋巴结转移的33例)及15例乳腺纤维腺瘤组织中survivin蛋白的表达。 结果：54例乳腺癌组织中survivin蛋白的阳性表达率为72.5%,明显高于癌旁正常组织及乳腺纤腺瘤组织,（P<0.05）;有腋窝淋巴结转移组的乳腺癌中其表达率明显高于无腋窝淋巴结转移组（P<0.05）;乳腺癌组织中survivin蛋白的表达与组织学分级、临床病理分期及淋巴结转移密切相关（P<0.05）。在癌旁组织及乳腺纤维腺瘤中未检测到survivin蛋白。 结论：乳腺癌组织中survivin表达上调,并参与乳腺癌的发生发展,是诊断乳腺癌和判断其预后的重要参考指标。     

两种西洋参人参皂苷不同提取方法的比较

目的 选择最优的西洋参人参皂苷的提取方法。方法 采用甲醇超声提取法和正丁醇回流加热提取法提取西洋参根中的人参皂苷,利用高效液相色谱法(HPLC)测定人参皂苷Rg₁、Re、Rb₁、Rc、Rd 含量差异,比较两种提取方法的优劣。结果 两种提取方法提取的人参皂苷Rg₁、Re、Rb₁、Rc、Rd在测定范围内具有良好的线性关系。甲醇超声提取的Rg₁、Re 平均含量均高于正丁醇加热回流提取法(P<0.05),Rb₁平均含量低于正丁醇加热回流提取法(P<0.05),Rc、Rd 平均含量与正丁醇加热回流提取法无显著差异(P>0.05)。方法学考察结果显示人参皂苷Rg₁、Re、Rb₁、Rc、Rd日内精密度RSD良好、平均加样回收率良好。结论 甲醇超声提取的Rg₁、Re含量显著高于正丁醇提取,正丁醇加热回流提取法Rb₁显著高于甲醇超声提取。依据不同的人参皂苷成分选择最佳的提取方法。     

人精子膜抗原的提取及分析

目的:用两种酶裂解法提取精子膜抗原并对其进行蛋白浓度测定和成分分析。方法:分别用尿素裂解液和表面活性剂Triton X-100﹑脱氧胆酸钠(DOC)的TDOC裂解液裂解液提取精子膜抗原,借助BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度,并通过SDS-PAGE法比较分析蛋白成分。结果:两种方法提取的精子膜抗原经SDS-PAGE,考马斯亮蓝染色后均有条带显示,TDOC裂解液提取的样本中显示仅有一条蛋白带,分子质量集中在100ku左右,尿素裂解液提取的样本中有多条蛋白条带,分子质量集中在130～35ku。结论:尿素裂解液提取法提取精子膜抗原的效果优于TDOC裂解液提取法,为抗精子相关抗体的研究提供了条件。