PCR法直接筛选重组阳性克隆

目的　建立一个简便、可靠的重组阳性克隆的筛选方法。方法　应用扩增小鼠生精细胞凋亡相关基因时使用的引物 ,以基因重组扩增后得到的菌落为模板 ,直接进行PCR扩增。结果　在筛选的阳性菌落中可扩增到与小鼠凋亡相关基因片段大小一致的阳性条带 ;以阳性克隆提取质粒进一步进行PCR和酶切鉴定及序列分析 ,证明结果正确。结论　菌落PCR是一种简便、快速、可靠、有效的筛选重组阳性克隆的方法。     

两种菌落聚合酶链反应在抗体库筛选中的应用比较

摘要：目的：探讨两种菌落PCR方法在抗体库筛选中的应用价值。方法：分别以5个阳性克隆细菌菌落直接悬浮于去离子水中及悬浮于含0．1％的TritonX-100后经水浴煮沸作为模板，进行PCR反应。同时提取质粒DNA，进行双酶切鉴定。结果：5个克隆的菌落PCR及酶切鉴定均检测到目的基因。结论：菌落PCR可用于筛选阳性重组克隆。菌落直接加入去离子水中作为模板进行PCR反应的方法可在大规模阳性重组DNA的筛选鉴定中推广应用。     

一种快速筛选和鉴定重组体的方法——改良菌落PCR

在对DNA片段进行亚克隆的实验中,阳性重组子的筛选是鉴定外源DNA是否插入载体的重要步骤。常用的方法有两种:一是在含抗生素的平皿上挑取转化生长的单菌落,经液体培养基扩大培养后,提取质粒,再经酶切或PCR扩增鉴定;另外,还可以用菌落原位杂交的方法进行初筛。这两种方法虽然可靠,但是步骤复杂繁琐,而且后一种方法还存在污染问题。我们在构建重组毒素表达载体时,摸索出了一种改良的菌落PCR扩增筛选法,既准确又简易,现介绍如下。     

结核分支杆菌Ag85A基因真核表达株的构建

目的 构建结核分支杆菌分泌蛋白Ag85A编码基因的DNA疫苗。方法 以结核分支杆菌H37Rv基因组为模板，PCR扩增Ag85A编码基因，用限制性内切酶消化后，插入真核表达载体pVAXl中，转化大肠杆菌DH5α，进行重组子筛选、鉴定。结果 以结核分支杆菌H37Rv基因组为模板，用Ag85A引物PER扩增出1041bp特异性片段，以重组子DNA为模板用Ag85A引物PCR扩增为阳性，重组子经限制性内切酶消化后可见目的片段，所测定序列与报道的Ag85A序列一致。结论 成功地构建了结核分支杆菌Ag85A基因真核表达株，该DNA疫苗的免疫效果有待进一步研究。     

人巨细胞病毒重组基因表达质粒的构建

目的 用基因工程技术克隆人巨细胞病毒（Human cycomegalovirus,HCMV)中抗原性较强的蛋白片段-gp52C末端和pp150C末端的DNA序列，插入pPIC9K质粒，构建适于酵母表达系统的重组表达质粒，方法 根据人巨细胞病毒糖蛋白gp52和磷酸蛋白pp150C末端的cDNA序列，设计出2对引物，利用PCR的方法，以病毒培养液上清为模板，进行二轮PCR扩增，把两个目的基因串联在一起，将所得的DNA片段经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后用T4连接酶与pPIC9K质粒进行连接，然后导入大肠杆菌DH5α筛选出阳性转化子，并用PCR和双酶切鉴定阳性重组子，结果 从人巨细胞病毒培养液上清中扩增出目的基因，PCR反应和双酶切鉴定结果与预期相符。结论 重组表达质粒成功地克隆了目的基因片段。     

弓形虫MIC3基因真核表达质粒的构建与鉴定

目的构建弓形虫微线体蛋白MIC3的真核表达质粒,为进一步研究MIC3蛋白功能奠定基础。方法PCR扩增弓形虫MIC3目的基因,将纯化的目的基因插入到真核表达质粒PCDNA3．0,并转入DH5ct宿主菌中,在含有青霉素的SOB平板上筛选阳性重组子,采用酶切和PCR扩增方法对重组质粒进行鉴定。结果重组质粒PCDNA—MIC3经单双酶切及PCR扩增都得到以原插入片段MIC3基因1120bp大小相同的片段。结论成功构建弓形虫MIC3基因真核表达质粒PCDNA—MIC3．     

pPICZα-synBPI_(m600)酵母表达载体的构建和鉴定

为使rBPIm2 3 重组抗菌蛋白在毕赤酵母表达系统中分泌表达 ,拟构建synBPIm60 0 酵母表达载体。以pUC18 synBPI41 4 质粒为模板扩增synBPI2 0 0 基因片段 ,经XhoI/EcoRI双酶切获得synBPI1 85bp基因片段 ;EcoRI/SalI双酶切PBV2 2 0 BPIm60 0 质粒获得BPIm42 0 基因片段 ;将上述 2个基因片段连接后定向克隆到pPICZα酵母表达载体上。连接产物转化E .coliTOP 10F′ ,在含Zeocin的低盐LB固体培养基上筛选阳性转化子。阳性克隆菌经菌落PCR法鉴定、酶切分析和测序鉴定 ,结果与预期相符。提示 :成功构建了pPICZα synBPIm60 0 酵母表达载体     

结核分支杆菌Ag85B基因真核表达株的构建

目的 构建结核分支杆菌分泌蛋白Ag85B编码基因的DNA疫苗。方法 以结核分支杆菌H37Rv基因组为模板，PCR扩增Ag85B编码基因，用限制性内切酶消化后，插入真核表达载体pVaxl中，转化大肠杆菌DH5a，进行重组子筛选、鉴定。结果 以结核分支杆菌PCR扩增为阳性，经限制性内切酶消化后可见目的条带，所测定序列与报道的Ag85B序列一致。结论 成功地构建了结核分支杆菌Ag85B基因真核表达株。     

对嗜T淋巴细胞病毒Ⅰ型重组env的研究

目的探讨人类嗜T淋巴细胞病毒（Human T-cell Lymphotropic Virus,HTLV）I型重组env抗原的表达。方法分析和选择HTLV-I env目的基因,将目的基因片段分别克隆入原核表达载体pQE80L,PCR和酶切鉴定重组子,诱导并亲和层析纯化表达重组env蛋白抗原,Western-blot检测重组env蛋白抗原活性,ELISA方法测试重组env蛋白抗原的特异性。结果 PCR扩增和酶切筛选得到阳性重组子pQE80L-env。SDS-PAGE显示重组蛋白相对分子质量约为25KDa,与预期分子量相符。免疫印迹在约25KDa有一明显特异印迹条带。转染细胞培养48h,SDS-PAGE分析,有相对分子质量约为27KDa目的重组蛋白表达,与预期的融合蛋白大小相符。ELISA检测到正常人、HIV阳性和HTLV-II阳性的参考血清均为阴性;HTLV-I阳性的参考血清为强阳性。结论 HTLV-I env基因5915nt-6545nt区,可以利用原核系统表达得到特异性HTLV-I重组抗原,重组抗原无显著性差异,有望成为检测试剂的抗原。     

A型流感病毒核蛋白原核表达载体的构建与表达

目的:构建A型流感病毒核蛋白(NP)的原核表达质粒,分析其在大肠杆菌中的表达状况.方法:采用逆转录聚合酶链式反应技术从A型流感病毒基因组中扩增出编码核蛋白的基因片段,克隆至pGEM-T Easy载体,PCR筛选阳性克隆并测序.经酶切后将目的片段亚克隆至表达载体pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL2(CDE3),PCR和酶切鉴定转化菌落.将阳性菌落经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹分析目的蛋白的表达.结果:RT-PCR扩增出NP基因序列,将其亚克隆至表达载体pGEX-4T-1构建成重组表达质粒,并在BL2(CDE3)中表达了NP融合蛋白.结论:成功构建A型流感病毒NP的重组表达质粒,并在大肠杆菌中表达了NP融合蛋白.     

菌落PCR快速鉴定Bcl-2基因及测序分析

目的 克隆大鼠Bcl-2基因（B cell lymphoma）全长cDNA,快速筛选重组pMD18-T-Bcl-2阳性克隆。方法 采用RT-PCR的方法从大鼠脾脏组织中扩增全长Bcl-2cDNA,将扩增产物克隆至pMD18-T载体中,用单菌活PCR扩增快速鉴定DNA片段后酶切进一步鉴定及序列分析。结果在筛选的阳性克隆中扩增到大鼠Bcl-2基因,经菌落PCR、酶切鉴定及DNA序列分析证实该序列正确。结论 用单菌落PCR扩增快速鉴定克隆在pMD18-T载体上的Bcl-2基因是一种简便、经济的方法。成功克隆了Bcl-2基因,为进一步研究Bcl-2 cDNA的基因功能及进行基因治疗奠定了基础。     

实时定量聚合酶链反应检测心血管活性多肽apelin方法的建立

目的：建立实时定量聚合酶链反应(RQ-PCR)检测心血管活性多肽的方法，为快速、准确地分析心脏组织中apelin基因表达奠定基础。方法：根据心血管活性多肽apelin基因序列，设计并合成引物和荧光标记TaqMan探针。将逆转录.聚合酶链式反应扩增的apeLin基因片段克隆至pGEM-Teasy载体，重组质粒经蓝自筛选、酶切、测序鉴定后，作为阳性克隆标准品，用于标准曲线的制定，由此可定量检测出每一样品模板的起始拷贝数。结果：阳性克隆标准品制作的标准曲线可显示循环阈值与模板浓度具有良好的线性关系(r=0.970)，可用于apelin基因表达的起始拷贝数定量测定。结论：RQ-PCR方法较常规PCR技术更为简便、准确、特异、灵敏，对定量检测及研究心血管活性多肽有积极意义。     

小片段DNA阳性重组子的快速筛选

PCR扩增的小片段DNA用T载体连接,转化受体菌后观察不到典型的蓝/白斑。用插入片段的特异性引物对菌落进行PCR来筛选阳性重组子,测序鉴定结果吻合率达100％,说明当利用颜色特性挑选阳性克隆成为困难时,菌落PCR技术是一种简便、快速、可靠的筛选方法。     

视网膜发育基因Six3表达载体的构建

目的:Six3在视网膜发育中起着关键性的调节作用,然而商品化的Six3 表达载体尚鲜见,本研究拟以 pBaBb-puro为骨架,构建Six3真核表达载体.方法:以新生乳鼠眼 cDNA 为模板,通过 PCR扩增出Six3 编码序列,经酶切后,用T4 DNA连接酶将其与pBaBb-puro进行连接,经过转化、筛选后,进行酶...     

PCR在消减文库构建中的应用

目的 :消减文库构建过程中 ,用PCR技术快速筛选重组阳性克隆。方法 :将白色单菌落加入氨苄抗性LB培养液中 ,37℃摇振培养过夜 ,取细菌悬液作PCR模板。结果和结论 :以PCR方法筛查重组阳性克隆 ,可以简便快速鉴定重组阳性克隆 ,不需提取质粒。筛选重组阳性克隆可直接用细菌悬液作PCR模板 ,在消减文库构建时 ,能大大提高工作效率。     

结核分枝杆菌fbpB基因植物表达载体的构建及鉴定

目的:构建结核分枝杆菌fbpB基因的植物表达载体,为在植物中表达该基因奠定基础。方法:以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,通过PCR扩增fbpB编码基因,然后将其克隆到植物表达载体pBI121上,并进行鉴定。结果:重组载体经菌液PCR鉴定为阳性克隆后再经双酶切鉴定可见约13kb和1kb的2条特异性条带,与预期大小相一致,测序结果表明克隆的fbpB基因序列与Genbank上公布的相一致。结论:成功构建了fbpB基因的植物表达载体,为研制和开发新型的结核疫苗打下坚实的基础。     

一种方便酶切鉴定的shRNA表达载体改建方法

目的 建立一种用单限制性内切酶酶切来快速筛选重组小发夹RNA(shRNA)表达载体的方法.方法 制备包含单一限制性内切酶Cta Ⅰ识别序列的双链DNA插入片段(Cla Ⅰ位点两侧碱基序列不互补).与BamH Ⅰ和Hind Ⅲ线性化的shRNA表达载体pSilencer-4.1(不含Cla Ⅰ识别序列)构建载体pSilencer-4.1-Cla Ⅰ.用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切pSilencer-4.1-Cla Ⅰ,将酶切产物与表达绿色荧光蛋白(GFP)shRNA的DNA模板(不含Cla Ⅰ识别序列)做连接反应.构建GFP shRNA表达质粒.提取阳性克隆质粒DNA,行Cla Ⅰ单酶切鉴定,对未被Cla Ⅰ线性化的质粒行DNA测序鉴定.结果 DNA测序表明正确构建了shRNA表达载体pSilencer-4.1-Cla Ⅰ,以pSilencer-4.1-Cla Ⅰ为载体构建的GFPshRNA候选重组子中,不能被Cla Ⅰ线性化的均为GFP shRNA表达质粒.结论 构建了可用于制备shRNA表达质粒的通用载体pSilencer-4.1-Cla Ⅰ,所引入的单一的Cla Ⅰ识别位点可以用来快速地筛选重组shRNA表达质粒.