两种2-细胞鼠胚体外培养方法比较

目的应用鼠胚质控中的小鼠胚胎体外培养模型,探讨两种胚胎培养方式（四孔皿与微滴法）在单胚观察时间上的差异以及对2-细胞鼠胚体外发育潜能的影响。方法取6-8周龄的昆明白雌性小鼠。采用HMG10IU促排卵,48 h后注射HCG 10IU促卵泡成熟,取形态正常的2-细胞鼠胚。每5-10个胚胎培养在含500μL培养基的四孔皿中（A组）,或单个胚胎接种在含50μL的培养微滴中（B组）。培养后,每隔24 h在倒置显微镜下观察一次,计算单胚观察时间,并检测24 h时的≥4细胞胚形成率、48 h的融合胚形成率7、2 h的囊胚与扩张囊胚形成率、96 h囊胚孵化率。结果两种培养方式于同一试验条件下分别试验5次,A组培养83个胚胎,B组培养69个2-细胞鼠胚。在每一个观察点上,微滴培养的单胚观察时间远超过四孔皿培养（P〈0.001）。但两组各时间点的胚胎发育率相似,无显著差异（P〉0.05）。结论尽管微滴单胚培养方式的胚胎暴露培养箱外时间长,但与四孔皿多胚培养方式比较,两者间2-细胞鼠胚的体外发育潜能相似。     

不同来源小鼠2-细胞胚胎体外发育情况的比较

目的比较小鼠配子体外授精法与2-细胞胚胎收集法所得鼠胚体外发育情况,探讨适合人类体外受精实验室的质量控制系统。方法采用雌雄小鼠配子体外授精和体内受精收集2-细胞胚胎,同时对2-细胞胚胎在相同条件下进行体外培养,观察胚胎发育情况。结果小鼠配子体外授精法的受精率为82.2%;对两种方法所获2-细胞胚胎进行培养,48 h卵裂率及72 h囊胚形成率均无显著差异。结论体内受精2-细胞胚胎收集法较小鼠配子体外授精法操作简便,是较理想的人类胚胎实验室质控方法。     

子宫内膜上皮细胞与小鼠胚胎共培养对小鼠胚胎早期发育的影响

目的:采用子宫内膜上皮细胞与小鼠胚胎共培养,观察其对早期胚胎体外发育的影响。方法:对小鼠子宫内膜上皮细胞进行分离、培养鉴定,然后与体外受精的小鼠胚胎进行共培养,观察共培养对小鼠胚胎卵裂率、孵化率以及囊胚期胚胎总细胞数的影响。结果:与无上皮细胞相比,共培养明显促进了小鼠桑椹胚率(71.3%和61.2%,P<0.05),囊胚率(50.0%和39.7%,P<0.05),囊胚孵化率(34.8%和24.3%,P<0.05)和胚胎总细胞数(44.1和35.6,P<0.05)。结论:子宫内膜上皮细胞能够促进小鼠胚胎的体外发育,对早期胚胎的体外发育环境具有优化作用。     

小鼠体外受精及其胚胎体外培养的比较研究

目的 通过比较不同品系小鼠体外受精情况以及不同培养液对C57BL/6J小鼠胚胎体外培养效果的实验,进一步完善小鼠体外受精和早期胚胎体外培养体系.方法 对C57BL/6J、DBA/2、FVB/NJ、BALB/c、KM、ICR及BARR Ⅱ小鼠进行超排和体外受精,并对C57BL/6J小鼠体外受精后的2-细胞胚胎用HTF、CZB、KSOM、M16、HECM五种培养液在相同条件下进行体外培养到囊胚,计算4-细胞～囊胚的发育率.结果 各品系小鼠平均排卵数为13.0～38.7个(P＜0.01),体外受精率为70.2%～92.8%(P＜0.05).不同培养液至4-细胞的发育率为60.3%～95.8%,其中KSOM的4-细胞发育率为95.8%,最适合2-细胞向4-细胞的发育.8-细胞发育率为52.8%～91.1%,桑椹胚发育率为40.6%～87.5%,囊胚发育率为5.1%～75.4%,各阶段胚胎发育率均差异显著.其中适合于金黄仓鼠桑椹胚、囊胚发育的HECM-2并不支持C57BL/6J囊胚的发育,其囊胚发育率只有5.1%,CZB最适合其囊胚的发育.结论 遗传背景是影响小鼠超排及体外受精效果的主要因素之一.葡萄糖的存在不利于克服2-细胞发育阻断,胚胎在8-细胞期以前,主要能源物质不是葡萄糖,直到桑椹胚后期,葡萄糖才是主要的能量物质.磷酸盐可引起胚胎发育阻断.氨基酸和EDTA有利于克服胚胎发育阻滞.     

动静态小鼠胚胎培养方法的囊胚获得率的对比

目的比较动静态小鼠胚胎培养方法的囊胚获得率。方法对20只雌性昆明小鼠行超促排卵后,进行体外受精。将获得的胚胎分为静态培养组(110个)和动态培养组(120个),分别使用静态培养和胚胎微脉冲震动仪动态培养。比较不同培养模式下卵裂的胚胎数和囊胚形成情况。结果动态培养组的囊胚率为92.5%,高于静态培养组的80.9%(P<0.05)。结论采用胚胎微脉冲震动仪进行体外胚胎培养可以提高囊胚率。     

剩余胚胎继续培养囊胚的潜在价值

目的:探讨在新鲜周期中,经ⅣF/ICSI-ET、冷冻后的剩余胚胎在体外继续培养至囊胚的意义。方法:在新鲜周期中,将D3天发育的胚胎选择评分较高的进行移植,部分胚胎玻璃化冷冻保存后,所剩余的胚胎通过序贯微滴培养法在体外继续培养至囊胚阶段,将优质囊胚进行玻璃化冷冻。在未妊娠患者下一周期将其解冻、移植,比较同时期D3通过玻璃化冷冻解冻移植后的卵裂期胚胎与囊胚期胚胎的植入率、妊娠率、单胎率和多胎率。结果:422例不孕症患者D3天移植冷冻后剩余的胚胎1842枚形成囊胚437枚(23.72%),优质囊胚315枚(17.10%);将优质囊胚行玻璃化冷冻;其中42例患者的62枚囊胚在下一周期解冻后移植,其植入率(41.94%)极显著高于243例患者的536枚卵裂期胚胎解冻后移植的植入率(20.90%)(P<0.01);而妊娠率(54.76%)显著高于解冻后卵裂期胚胎的妊娠率(36.63%)(P<0.05);但是单胎率(71.26%vs 85.71%)和多胎率(28.74%vs 13.64%)无显著差异(P>0.05)。结论:囊胚体外培养可以筛选出具有发育潜能的剩余胚胎,最大限度地利用胚胎,从而提高可用胚胎数和临床妊娠率。     

囊胚培养的相关因素分析

目的探讨体外培养囊胚形成的影响因素。方法将来自体外受精/单精子显微注射的第3天胚胎进行体外延长培养,观察囊胚形成情况。受精后早期胚胎培养采用G1,囊胚培养采用G2。结果 87例患者平均取卵（10.52±5.09）个,平均受精（7.02±4.02）个,形成胚胎（6.98±4.12）个;其中310个做进一步胚胎培养,取卵后第5天形成囊胚100个,囊胚形成率为32.26%。原核为Z1的囊胚形成率高于原核Z2、Z3和Z4,但差异无统计学意义（〉0.05）。胚胎细胞数≥10个或≤6个的囊胚形成率均低于胚胎细胞数为7～9的囊胚形成率,且差异有统计学意义（〈0.05）。I～II级第3天胚胎的胚胎囊胚形成率高于III～IV级的胚胎,但差异无统计学意义（〉0.05）。结论体外延长培养能有效筛选具有发育潜力的胚胎,第3天胚胎形态评分不能完全预测其发育潜力。     

胰岛素样生长因子-Ⅱ对小鼠早期胚胎体外发育的影响

目的 探讨胰岛素样生长因子-Ⅱ(IGF-Ⅱ)对小鼠早期胚胎的影响,为人类胚胎培养系统的优化提供依据.方法 在mKSOM培养基中加入不同浓度的IGF-Ⅱ,Xgd,鼠1-细胞胚胎进行体外培养,观察囊胚发育率、孵化率及胚胎细胞数的变化.结果 小鼠1-细胞胚胎体外培养120 h后,IGF-Ⅱ添加组囊胚发育率、孵化率显著高于对照组,但囊胚细胞计数与对照组无明显差别.结论 添加IGF-Ⅱ对小鼠胚胎发育具有一定的促进作用.     

新建辅助生殖实验室的鼠胚实验报告

目的 探讨用鼠胚实验对新建辅助生殖实验室的培养体系进行评估的可行性.方法 对昆明系小鼠进行体内、体外受精实验,观察常规培养条件下不同受精方式来源小鼠胚胎的发育情况以及不同培养环境对小鼠体外受精胚胎发育的影响,并计算受精率、卵裂率及囊胚率.结果 常规培养条件下,体内受精组的受精率和卵裂率均显著高于体外受精组(P＜0.05),两组囊胚率比较差异无统计学意义(P＞0.05).在体外受精中,三气培养组的卵裂率和囊胚率显著高于两气培养箱组(P＜0.05),两组受精率比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 小鼠体内、体外受精获得的受精卵均有较高的成胚率,鼠胚培养可对新建辅助生殖实验室的培养体系进行评估.常规培养条件下体内受精胚胎的发育潜能优于体外受精,而体外受精胚胎在三气培养环境下的发育潜能优于两气培养环境.     

基于体外鼠胚实验评估辅助生殖实验室质量

目的 通过监测体外鼠胚胎培养实验中卵裂率和囊胚率,评估本院新建的生殖胚胎实验室是否符合人类胚胎体外培养要求。方法 采用SPF级昆明系小鼠行体内和体外受精实验,雌鼠通过腹腔注射PMSG 10 U/只,48 h后腹腔注射hCG 10 U/只进行促排卵,促排卵后,体外受精组经手术获得精子和卵子行体外受精培养;体内受精组在雌鼠促排卵后,将雌鼠和雄鼠合笼饲养过夜,第二天清晨处死可见阴栓的雌鼠,手术获取受精原核胚进行培养,观察两组胚胎培养过程中的发育情况。结果 体外受精实验进行20个周期,共获卵946枚,受精率、囊胚率分别为（79.02±4.05）%、（80.12±5.27）%。体内受精实验进行14个周期,共获卵618枚,其受精率、囊胚率分别为（80.65±4.22）%、（81.35±3.06）%,两组间受精率和囊胚率比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 通过监测体外鼠胚培养实验中卵裂率和囊胚率评估我院生殖胚胎实验室环境,结果表明符合各项指标质控标准。     

序贯培养对小白鼠胚胎体外发育的影响

目的:探索序贯培养技术对小白鼠胚胎体外发育的影响。方法:将 2 -细胞期的小鼠胚胎随机分为序贯培养组与传统培养组进行培养 ,观察分析两组的 8-细胞期胚胎形成率、桑椹期胚胎形成率及囊胚形成率。结果:序贯培养组 8-细胞期胚胎形成率、桑椹期胚胎形成率及囊胚形成率分别为 70 .5 %、6 8.2 %、6 5 .9% ,传统培养组分别为 4 5 .7%、4 5 .7%、34.3%。两组比较 ,序贯培养组高于传统培养组 ,差异有统计学意义 (P <0 .0 5 )。结论 :采用适当的培养液进行序贯培养 ,更适合小白鼠胚胎的体外发育     

鼠胚实验在新建IVF胚胎培养室中的质控研究

目的:利用昆明系小白鼠行体、内外受精技术,对新建IVF胚胎培养室及技术员操作水平进行评估。方法:①手术获得昆明小白鼠雌雄配子,行体外受精;②手术获得昆明小白鼠体内受精胚(原核胚);培养观察两组鼠胚的受精率、卵裂率、囊胚率。结果:共进行24个周期的体外受精实验,取卵938枚,受精率89.87%、卵裂率96.32%、囊胚率95.39%;共进行24个周期的体内受精实验,取卵916枚(包括原核胚),受精率96.29%、卵裂率97.21%、囊胚率93.57%。结论:两组鼠胚实验结果表明,体内受精胚在体外发育更稳定,其对新建IVF胚胎培养室能够进行很好的质量控制;体外受精胚随小鼠批次及饲养环境等不同,在体外培养时其受精率、2-细胞率等会发生波动,但其对技术人员的操作水平能进行更好的评估;两者结果均能对新建胚胎培养室进行各项质控的监测。     

不同来源小鼠胚胎培养在辅助生殖实验室质量控制中的应用

目的:利用小鼠胚胎体外培养技术对新建人类辅助生殖实验室进行质量控制,以保证培养体系的可靠性,并比较两种小鼠胚胎培养方法在实验室质量控制中的作用。方法:采用小鼠配子体外授精法和2-细胞胚胎收集法对胚胎进行培养,观察胚胎发育情况。结果:小鼠配子体外授精法的受精率为80.98%,受精卵的卵裂率、优质胚胎率及囊胚形成率分别为90.60%、68.15%、85.93%与收集的体内2-细胞卵胚胎的88.98%、70.33%、83.89%比较无显著性差异,P>0.05。结论:两种不同来源鼠胚培养方法均可作为实验室培养体系检测的评价指标。对于新建的胚胎培养实验室,小鼠配子体外授精法可对IVF的全过程进行检测,更能反映培养体系对胚胎的影响,同时还可熟练IVF的操作技能。     

解脲支原体血清3型对小鼠早期胚胎发育的影响

目的：观察不同浓度的解脲支原体（ureaplasma urealyticum,UU）血清3型（简称3型UU）对小鼠早期胚胎发育的影响,以探讨UU对早期胚胎发育的致病作用。方法：取小鼠2-细胞期胚胎随机分为实验组与对照组,对照组（组1）：2-细胞期鼠胚在不含3型UU的HTF培养液中培养;实验组（组2、组3、组4、组5）：2-细胞期鼠胚分别在含103～106 CCU/mL浓度的3型UU的HTF培养液中培养,在37℃、5%CO2的培养箱中培养72 h,每24 h在Nikon倒置显微镜下观察记录,通过统计各组的D2评分、4-细胞期胚胎形成率、桑椹期胚胎形成率、囊胚形成率,评价早期胚胎的发育情况。结果：3型UU在培养液中的终浓度分别为103、104、105 CCU/mL时,2-细胞胚胎以后的D2评分、4-细胞期胚胎形成率、桑椹期胚胎形成率、囊胚形成率等各阶段的胚胎发育指标与对照组比较差异均无统计学意义（P〉0.05）。而UU终浓度为106CCU/mL组各项胚胎发育指标与对照组比较差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论：UU能够影响小鼠早期胚胎的发育,3型UU≥106 CCU/mL时可阻碍小鼠早期胚胎的发育。     

瘦素对小鼠着床前胚胎发育影响的体外研究

目的　探讨瘦素在体外对小鼠着床前胚胎发育的影响。方法　 1收集小鼠 2 -细胞胚胎 ,在不同剂量瘦素的 CZB培养液中进行体外培养 ,观察胚胎发育情况 ,并进行胚胎移植 ,观察着床率 ;2收集小鼠 2 -细胞胚胎在空白 CZB培养液中体外培养至桑葚胚期 ,再分别置入不同剂量瘦素的 CZB培养液中进行体外培养 ,观察胚胎进一步发育情况。结果　瘦素能提高 2 -细胞胚胎体外发育的质量、发育率和胚胎着床率。当瘦素剂量为 10 ng/ ml时平均胚胎形态学评分 (AES)为 16 .0 8± 0 .37,剂量为 5 0 ng/ ml时 AES为 17.5 7± 0 .4 2 ,两者间差别有统计学意义(P<0 .0 5 )。但剂量进一步增加 ,促进作用不再递增。瘦素对桑葚胚体外进一步发育无显著影响。结论　瘦素参与了小鼠着床前胚胎的发育 ,能提高胚胎发育质量、发育率 ,有利于胚胎的进一步着床。     

胰岛素对ICR小鼠胚胎体外发育的影响

目的研究ICR小鼠胚胎体外培养时,添加胰岛素的作用、浓度及所需阶段．方法用添加不同浓度胰岛素的mKSOM培养基对小鼠胚胎进行体外培养及选择最适浓度对不同阶段鼠胚进行体外培养,观察囊胚发育率和囊胚细胞数的变化．结果所有添加胰岛素的浓度组,囊胚发育率均高于对照组,其中0．005μg／mL和0．05μg／mL浓度组囊胚细胞数显著高于对照组和其他各浓度组．2-细胞至4-细胞、4-细胞至桑椹胚前添加胰岛素囊胚率显著高于对照组和其他实验组．结论在ICR小鼠胚胎体外培养时添加胰岛素能够促进胚胎发育;胰岛素浓度增至μg／mL对在ICR小鼠胚胎无毒性作用;在ICR小鼠胚胎体外培养的适宜胰岛素浓度为0．005μG／mL和0．05μG／mL;2-细胞至4-细胞、4-细胞至桑椹胚前添加胰岛素更加重要．     

Effect of Insulin on Development of ICR Mouse Embryos in Vitro

Objective To study the effects and the appropriate concentration of insulin on the development of mouse embryos in vitro, and the effects of insulin on the development of different stages of embryos.Methods Mouse embryos were cultured in vitro in the mKSOM media supplemented with insulin at different concentrations and with insulin during different stages of embryos. The blastocyst rates and the cell numbers were counted.Results Additions of insulin significantly increased the rates of blastocyst and the total cell numbers. The concentrations of 0.005 μg/ml and 0.05 μg/ml insulin caused a significant increase in the total cell numbers compared with the control and experimental groups. Addition of insulin from 2-cell to 4-cell stage or from the 4-cell to morula stage, significantly increased the blastocyst rates compared with control and experi-mental groups.Conclusion Insulin can promote the development of mouse embryos in vitro. The appropriate concentration of insulin added in mKSOM was 0.005 μg/ml and 0.05 μg/ml.Exposure of embryos to insulin, beginning at the 2-cell and extending to the 4-cell stage or beginning at the 4-cell and extending to the morula stage, is important for the development of ICR mouse embryos in vitro.     

新建IVF实验室使用前的生物学检测

目的检测新建IVF实验室培养体系的可靠与否。方法采用鼠胚生物学实验(小鼠体外受精和小鼠体内胚的体外培养)和人精子体外存活实验检测IVF实验室的培养体系,并观察鼠胚的体外发育情况和人精子体外存活情况。结果小鼠体外受精实验的平均囊胚形成率低于小鼠体内胚实验组(85.50%vs 90.51%),人精子体外存活实验结果稳定(SMI0.85),受测样品合格。结论上述方法很好地检测了IVF实验室的稳定情况,而小鼠体内胚的体外培养更能准确地检测新的IVF实验室。     

精子孵育时间及培养液成分对小鼠体外受精和胚胎发育的影响

目的探讨精子孵育时间及培养液成分对小鼠体外受精和胚胎发育的影响,为人类辅助生殖技术完善质量控制体系创建可靠的平台。方法将精子获能时间分为3组,分别为0.5、1和2h,用HTF＋10%SSS和HTF＋10%FCS两种获能受精液,ICR雄鼠附睾尾的精子与成熟卵母细胞进行体外受精（IVF）。受精卵分别用IVC-ONE＋10%SSS、IVC-ONE＋10%FCS、HTF＋10%FCS和HTF＋10%SSS4种培养液对体外受精胚胎进行培养。结果结果获能时间为0.5h时,卵母细胞的受精率显著高于其他组,差异有高度统计学意义（P〈0.01）;获能时间若超过1h,受精率明显下降。胚胎用IVC-ONE＋10%FCS培养液进行培养时囊胚率和囊胚孵出率（89%和40%）显著高于IVC-ONE＋10%SSS（51%和29%）、HTF＋10%FCS（11%和2%）和HTF＋10%SSS（11%和0%）,差异有高度统计学意义（P〈0.01）。结论小鼠体外受精时,宜选用HTF受精液,并获能0．5h;小鼠体外受精卵进行培养,以含10％FCS的IVC＋ONE为胚胎培养液,可获得较高的囊胚率,葡萄糖并不是小鼠胚胎形成囊胚所必需的;在含磷酸盐的培养液中EDTA不能有效克服ICR2-cell的体外发育阻滞现象。