RhoC基因对肝癌细胞促血管生长因子表达的影响

目的:观察RhoC基因对肝癌HepG2细胞表达促血管生长因子（VEGF，bFGF）的影响。 方法:将pcDNA3.1-RhoC重组质粒和空载体pcDNA3.1转染HepG2细胞，用RT-PCR及免疫组化检测HepG2细胞的RhoC mRNA及RhoC蛋白表达情况;RT-PCR及免疫组化检测HepG2细胞VEGF和bFGFmRNA及蛋白的表达。将转染pcDNA3.1-RhoC重组质粒和空载体pcDNA3.1的HepG2细胞接种裸鼠，观察肿瘤的成瘤率。结果:与转染空载体pcDNA3.1的HepG2细胞相比，转染pcDNA3.1-RhoC重组质粒的细胞表达RhoC mRNA及RhoC 蛋白增强，其表达VEGF和bFGFmRNA及蛋白明显增强（P＜0.01）;重组质粒转染组成瘤率高于空载体组。结论:RhoC表达可促进HepG2细胞表达血管内皮生成因子。RhoC可促进肝癌细胞分泌促血管生长因子，可能是促进肝癌侵袭、转移的机制之一。     

RNA干扰靶向抑制胃癌细胞血管内皮生长因子C表达的实验研究

目的 构建针对血管内皮生长因子C（VEGF-C）的RNA干扰质粒表达载体pSIH1-H1-copGFP,并评价其转染胃癌细胞后对VEGF-C表达的抑制作用.方法 设计并合成针对VEGF-C基因mRNA序列的3条短发夹RNA及1条阴性对照序列,克隆到pSIH1-H1-copGFP载体,重组构建RNA干扰质粒,并将其转染胃癌细胞（SGC7901）,采用RT-PCR分析转染后VEGF-C基因的表达情况.结果 重组构建pSIH1-H1-copGFP载体经双酶切及插入片断序列分析,表明其成功插入设计位点,并且序列完全一致.3种siRNA质粒表达载体的转染效率均为60%～70%,对VEGF-C mRNA表达的抑制率分别为35.4%、33.8%和81.5%.结论 RNA干扰质粒表达载体介导对VEGF-C基因的RNA干扰可明显抑制胃癌细胞中VEGF-C的表达,可能成为抑制胃癌淋巴管生成的一种有效手段.     

电穿孔法和化学法在多药耐药胃癌细胞转染中的效果比较

目的:比较电穿孔法和化学法在多药耐药(MDR)胃癌细胞中转染效果。方法:将表达抑癌基因WTX的质粒分别用电穿孔法和两种化学法(Lipofectamine2000、Attractene)转染MDR胃癌SGC7901/VCR细胞,观察转染后细胞中增强型绿色荧光蛋白(e GFP)和目的基因WTX m RNA的表达情况。结果:e GFP分析结果显示,与无耐药的亲代SGC7901细胞比较,两种化学转染法对SGC7901/VCR细胞的转染效率明显降低(均P0.05),而电穿孔转染法未见明显降低(P0.05),且明显高于两种化学转染法对SGC7901/VCR细胞的转染效率(均P0.05)。RT-PCR结果显示,电穿孔转染的SGC7901/VCR细胞中WTX m RNA表达量明显高于两种化学法转染的SGC7901/VCR细胞中的WTX m RNA表达量(均P0.05)。结论:对于MDR胃癌细胞,电穿孔转染法不易受其细胞膜成分的影响,可以保持较好的转染效率。     

组织因子对人胃癌细胞体外侵袭转移特性的影响

目的 构建稳定转染人组织因子(TF)的人胃癌细胞株SGC7901,研究TF对胃癌细胞体外侵袭转移特性的影响.方法 采用巢式PCR技术自人胎盘组织克隆目的基因TF,应用脂质体介导的转染技术将其导入人胃癌细胞株SGC7901,采用G418筛选稳定表达TF的细胞,采用RT-PCR及Western blot法检测TF mRNA及蛋白的表达,并进行Transwell实验及划痕实验观察细胞体外侵袭转移能力的变化.结果 经基因测序证实成功构建了稳定、高效表达TF的人胃癌细胞系SGC7901/TF.转染组TF mRNA及TF蛋白表达增高;与阴性对照组及空白对照组相比,转染组细胞的体外侵袭转移能力增强.结论 TF能够增强人胃癌细胞的体外侵袭转移能力.     

Dapper1在胃癌组织中的表达及其对survivin介导的细胞凋亡的调控

目的 研究Dapper1(Dpr1)在胃癌组织中的表达及其对survivin介导的细胞凋亡的调控.方法 用RT-PCR方法检测30例患者胃癌及癌旁正常组织中Dpr1 mRNA的表达情况;用RT-PCR检测SGC7901细胞转染pcDNA3.1-Dpr1质粒前后Dpr1和survivin mRNA表达的变化;用Western blot检测转染前后Dvl-2、β-catenin及survivin蛋白表达的变化;用流式细胞术检测转染后SGC7901细胞凋亡率的变化. 结果本组30例胃癌组织中17例Dapperl mRNA表达下调,发生率为57%,且与胃癌的浸润深度和分化程度相关(P＜0.05);转染pcDNA3.1-Dpr1后SGC7901细胞中Dpr1 mRNA表达水平上调,survivin mRNA表达水平下调;Dvl-2、β-catenin以及Survivin蛋白表达量降低;转染pcDNA3.1-Dpr1质粒后SGC7901细胞的凋亡率升高. 结论 Dpr1能够通过经典WNT通路抑制凋亡相关蛋白survivin的表达,在胃癌细胞的凋亡中发挥重要作用.     

过表达核转录因子Kr(u)ppel样因子4下调胃癌AGS细胞血管内皮生长因子的表达

目的 观察过表达核转录因子Kr(u)ppel样因子4(KLF4)是否下调胃癌AGS细胞血管内皮生长因子(VEGF)的表达.方法 体外培养人胃癌AGS细胞,分为4组:转染空质粒24 h对照组、转染空质粒48 h对照组、转染KLF4表达质粒24 h组、转染KLF4表达质粒48 h组.构建KLF4表达质粒,脂质体LipofectamineTM2000分别转染空质粒、KLF4表达质粒到AGS细胞,24、48 h后提取总RNA和蛋白,实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法、Western blot法分别检测KLF4和VEGF mRNA和蛋白水平的表达.结果 AGS细胞在24 h转染率为65%-75%,48 h转染率为40%～45%.实验组与对照组转染24、48 h后,KLF4 mRNA的表达量分别为:563.584±250.744比4.997±5.729(P＜0.05);351.852±212.439比2.4420±1.3770(P＜0.05).VEGF mRNA表达量分别为:0.008 929±0.003 810比0.002 294±0.000720(P＜0.05);0.018 375±0.008 263比0.002 193±0.001 698(P＜0.05);胃癌AGS细胞KLF4蛋白表达量显著性增加,相对应地VEGF蛋白表达水平显著性降低(P＜0.05).结论 体外胃癌AGS细胞过表达KLF4导致VEGF mRNA和蛋白表达下调,KLF4可能参与抑制调节胃癌AGS细胞VEGF的表达.     

碱性成纤维细胞生长因子真核表达载体的构建及表达

目的构建人碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)真核表达质粒,研究其在体内外的表达.方法通过基因克隆技术,构建并大量制备pcDNA3.1/myc-His(-)-bFGF真核表达体系,RT-PCR和细胞免疫组织化学方法检测体外瞬时表达情况;直流电脉冲介导重组质粒pcDNA3.1/myc-His(-)-bFGF和pCD2-血管内皮细胞生长因子121(vascular endothelial growth factor,VEGF121)在兔颈部肌肉瓣内转移并表达,测定其促血管生成的生物学效应.结果构建的pcDNA3.1/myc-His(-)-bFGF真核表达体系成功转染体外培养HeLa细胞,目的基因在mRNA水平和蛋白水平均有表达.pcDNA3.1/myc-His(-)-bFGF和pCD2-VEGF121重组质粒分别转染在体肌瓣,获得外源基因高水平表达.转基因肌肉发生血管增生、血流增强的生物学效应.结论构建了人bFGF真核表达质粒,并可在体内外顺利表达,为进一步组织移植或组织工程基因治疗研究奠定了基础.     

VEGF-ASODN转染对胃癌细胞VEGF表达及生长的抑制作用

目的研究血管内皮细胞生长因子（VEGF）-反义寡核苷酸（ASODN）转染胃癌细胞SGC-7901对其VEGF表达和生长的抑制作用。方法人工合成硫代磷酸化VEGF-ASODN,转染胃癌细胞SGC-7901,24h后实时荧光定量RT-PCR检测细胞VEGF mRNA起始拷贝数,ELISA法检测细胞及培养液上清中VEGF蛋白含量,Western blot法检测细胞生存素（survivin）蛋白含量,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,用MTT实验检测转染对细胞活性的影响,用细胞生长曲线表示转染对细胞生长的影响。结果VEGF-ASODN能显著降低VEGF mRNA水平、降低胃癌细胞及其培养液中VEGF蛋白含量、降低survivin蛋白含量、增加细胞凋亡、抑制细胞活性及生长（P〈0.05）。结论VEGF-ASODN转染胃癌细胞SGC-7901能显著抑制VEGF和survivin蛋白表达、增加细胞凋亡、抑制细胞生长。     

VEGF-ASODN转染对胃癌细胞VEGF和survivin表达的影响

目的:观察血管内皮细胞生长因子反义寡核苷酸（VEGF-ASODN）转染胃癌细胞SGC-7901对血管内皮生长因子（VEGF）和生存素（survivin）表达的影响。方法:人工合成硫代磷酸化VEGF-ASODN。实验分为5组：对照组，错义组，实验1组(转染浓度为100 ng∕mL),实验2组（转染浓度为400 ng∕mL）及实验3组（转染浓度为700 ng∕mL）。转染后实时荧光定量RT-PCR检测细胞RNA起始拷贝数; ELESA法检测细胞及培养上清液VEGF 蛋白含量; Western-blot法检测细胞生存素蛋白表达量; 流式细胞仪检测细胞凋亡; 细胞生长曲线检测转染对细胞生长的影响。结果:3个实验组VEGF mRNA水平和VEGF蛋白表达量及培养上清液VEGF 蛋白含量均明显降低，survivin蛋白的表达水平随转染浓度的升高而降低，转染VEGF-ASODN能使胃癌细胞凋亡增加、细胞生长减缓。结论:VEGF-ASODN转染胃癌细胞SGC-7901能显著抑制细胞VEGF的表达，促进细胞凋亡，抑制细胞增殖。     

Beclin-1在胃癌血管生成拟态形成中的表达及意义

目的 探讨胃癌细胞SGC7901在体外血管生成拟态（VM）的形成过程中,自噬特异性基因Beclin-1的表达情况及其对VM形成的影响.方法 分别将ShRNA整合质粒载体和空白质粒载体转染到胃癌细胞SGC7901中,采用RT-PCR及Western blot法检测SGC7901细胞中Beclin-1表达情况;并在体外构建VM模型,观察不同转染细胞中VM形成能力的差异,同时检测VM形成前后细胞中VM形成基因Notch-1的表达情况.结果 胃癌SGC7901形成VM过程中,Beclin-1及Notch-1 mRNA和蛋白表达均明显升高（均P＜0.05）.与转染空白质粒的SGC7901细胞相比,转染ShRNA整合质粒抑制Beclin-1后,VM形成的细胞管状结构的数目[（15.4±1.1）个比（37.8±1.9）个,P＜0.05]、长度[（316.8±24.6） mm比（385.1±14.2） mm,P＜0.05]和交点数[（11.6±1.1）个比（27.2±1.1）个,P＜0.05]明显减少,同时Notch-1表达亦明显下降（P＜0.05）.结论 Beclin-1通过维持胃癌细胞VM调节基因的稳定表达促使VM形成,抑制Beclin-1为胃癌的基因治疗提供了一个可能的新靶点.     

血管内皮生长因子D促进胃癌淋巴管生长

目的研究血管内皮生长因子D（VEGF-D）与胃癌淋巴管转移之间的关系。方法采用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）从人胃癌旁正常组织中扩增人VEGF-D全长cDNA，经T-A克隆酶切鉴定及测序得到完整的序列后，亚克隆并构建pEGFP／VEGF-D真核表达载体，转染低表达VEGF-D的胃癌细胞株SGC7901，通过体外G418抗生素筛选得到高表达VEGF-D的肿瘤细胞克隆，用这种高表达VEGF-D的胃癌细胞接种于裸鼠皮下，用淋巴管内皮细胞透明质酸盐受体（LYVE-1）行免疫组织化学染色观察肿瘤淋巴管密度和形态。结果对照组和转染pEGFP／VEGF-D组肿瘤的重量分别为（1．13±0．40）g和（2．24±0．82）g，两组差异有统计学意义（P〈0．05）。肿瘤组织内的淋巴管密度分别为2．89±1．32和5．74±1．30，两组差异有统计学意义（P〈0．01）。周边肿瘤组织存在扩张的功能性淋巴管。结论VEGF-D在胃癌中可能通过主动促进淋巴管生长来促进肿瘤生长和远处转移。     

乙肝病毒X基因对肝癌细胞表达RhoC的影响

目的：探讨X基因对肝癌细胞表达RhoC基因的影响。方法：用定向克隆的方法构建X基因的真核表达载体pcDNA3.1-X，脂质体转染HEPG2细胞;潮霉素选择培养稳定表达X基因的HEPG2-X细胞;免疫组化鉴定HEPG2-X细胞RhoC蛋白表达。结果：构建的真核表达载体pcDNA3.1-X在HEPG2细胞中有稳定表达，HEPG2-X细胞表达RhoC蛋白增强。结论：体外条件下，X基因可促进肝癌HEPG2细胞RhoC表达增强。这可能与肝癌的侵袭、转移有关。     

RASSF1A对人胃癌细胞株SGC7901增殖的影响

目的:观察外源性RASSF1A基因对人胃癌细胞SGC7901增殖的影响。方法:利用脂质体转染技术将真核表达重组体pcDNA3.0-RASSF1A质粒和空载体pcDNA3.0质粒分别导入SGC7901细胞，经G418筛选后获得稳定转染细胞克隆。采用RT-PCR和蛋白印迹检测RASSF1A基因表达。绘制细胞生长曲线，并用裸鼠成瘤实验、平板克隆形成实验、流式细胞术分析转染细胞的生物学行为。结果〖HT8.5SS〗经脂质体转染和筛选，建立了高表达RASSF1A基因的SGC7901细胞系。与未转染组和转染空白载体组比较，转染RASSF1A基因的SGC7901细胞生长速度明显减慢; 细胞周期中G1/G0期比例明显增加，而S期比例减少; 克隆形成率明显减少; 裸鼠成瘤抑制率为57.1%。结论:RASSF1A基因能抑制人胃癌细胞SGC7901的增殖。     

人反义血管内皮生长因子基因表达对肾癌细胞的影响

目的　探讨人反义血管内皮生长因子 (VEGF)基因对肾癌细胞VEGF表达及生长的影响。　方法　采用RT PCR方法将VEGF基因克隆于 pcDNA3.1反义真核表达载体 ,构建VEGF的pcDNA3.1反义真核表达载体 ,酶切鉴定。转染人肾癌 780 0细胞 ,G4 18筛选阳性克隆。免疫组化法检测VEGF表达 ,MTT法测生长曲线。　结果　pcDNA3.1 (antisense)VEGF组VEGF蛋白表达阳性细胞率 (10 .3% )明显低于 780 0 PC组 (92 .8% )和 780 0组 (96 .6 % ) ,P <0 .0 1;VEGF反义真核表达载体抑制肾癌 780 0细胞生长 ,在培养的第 4、5、6天 ,抑制率分别为 2 6 .38%、4 1.78%和 37.6 4 %。　结论　VEGF的 pcDNA3.1反义真核表达载体可明显降低肾癌细胞VEGF的表达 ,明显减慢肾癌细胞生长。     

血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因转染骨髓间充质干细胞的表达

目的检测兔骨髓间充质干细胞(BMSc)经血管内皮细胞生长因子(VEGF165)基因转染后外源基因的表达，为进一步利用经基因转染的BMSc构建血管化组织工程骨组织打下基础。方法构建VEGF真核细胞表达载体，利用脂质体介导转染兔BMSc，使用原位杂交、免疫组织化学的方法检测VEGF165在BMSc中的表达。结果成功构建VEGF真核细胞表达载体，原位杂交、免疫组化方法显示经基因转染的BMSc中有阳性棕黄色颗粒出现，而未转染组呈现阴性结果。结论采用基因转移技术可以将VEGF转染至．BMSc中，并有外源性基因和蛋白的表达。