乙型肝炎病毒核心基因启动子变异与血清HBeAg及病毒载量关系的探讨

目的研究乙型肝炎病毒（HBV）核心基因启动子（BCP）变异与e抗原（HBeAg）及病毒载量的关系。方法（1）研究对象为176例HBV慢性感染者（轻、中、重度慢性乙型病毒性肝炎,肝炎肝硬化,慢性重型肝炎和原发性肝癌）。（2）研究方法：①采用PCR微板核酸杂交结合ELISA检测显示技术,对患者血清进行检测HBVBCP区核苷酸（nt）1762碱基A→T和1764G→A联合突变。②采用PCR结合荧光探针检测技术,检测患者血清乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸（HBVDNA）含量.③采用ELISA检测技术,检测患者血清HBV标志物（HBsAg、HBeAg、抗-HBs、抗-HBe及抗-HBc）。结果（1）在176例HBV慢性感染者中检出HBVBCP区T1762A1764变异者73例,HBVBCP变异的阳性率为41．5％。HBV BCP变异在HBeAg阴性病例的阳性率为49．4％（44／89）,显著高于HBeAg阳性病例的阳性率33．3％（29／87）（P=0．03）。（2）HBV BCP变异阳性组的HBV DNA含量显著高于HBV BCP变异阴性组的含量（P=0．000）。BCP阳性组HBV DNA含量在HBeAg阳性病例及HBeAg阴性病例中均较BCP阴性组高（P=0．000）。结论（1）HBV BCP变异可引起HBV感染者的HBeAg阴转。（2）HBV BCP变异可使HBV致病力增强,病毒复制水平提高。（3）对HBsAg 阳性／HBeAg阴性患者需要进一步检测HBV DNA,以免由于基因变异导致将HBeAg阴性者误认为病毒的免疫清除或静息而延误抗病毒治疗时机。     

慢性肝病患者乙型肝炎病毒核心基因启动子变异与临床类型的相关性研究

目的:研究慢性肝病患者乙型肝炎病毒核心基因启动子(HBV BCP)变异与临床类型的相关关系.方法:采用PCR微板核酸杂交结合ELISA检测显示技术,对176例HBV慢性感染患者的血清进行HBV BCP区核苷酸(nt)1762碱基A→T和1764G→A联合突变检测.根据病情的严重程度将患者分为6组不同临床类型:①慢性乙型肝炎轻度;②慢性乙型肝炎中度;③慢性乙型肝炎重度;④肝炎肝硬化;⑤慢性重型肝炎;⑥原发性肝癌.并与HBV BCP变异的阳性或阴性进行等级相关分析.结果:HBV BCP双变异在慢性乙型肝炎轻、中、重度组,肝炎肝硬化组,慢性重症肝炎组和原发性肝癌组的阳性率分别为28.0%、31.4%、34.2%、39.4%、60.0%和70.0%(rs=0.259,P=0.001).结论:HBV BCP变异与HBV慢性感染的由轻至重的临床类型呈正相关,随着病情的加重,BCP变异的阳性率亦随之增高.     

原发性肝癌患者乙型肝炎病毒核心启动因子变异与IL-10、IL-12、TNF-α及IFN-γ关系的探讨

目的研究原发性肝癌患者乙型肝炎病毒核心基因启动子变异(HBVBCP)与IL-10、IL-12、TNF-α及IFN-γ关系。方法176例HBV慢性感染者[慢性乙型病毒性肝炎轻、中、重度,肝炎肝硬化,慢性重型肝炎和原发性肝癌(HCC)]。采用PCR微板核酸杂交结合ELISA检测显示技术,对患者血清进行检测HBVBCP区核苷酸(nt)1762碱基A→T和1764G→A联合突变;采用双抗体夹心ELISA检测技术,检测患者血清细胞因子(IL-10、IL-12、TNF-α和IFN-γ)水平。结果HBVBCP变异在HCC组的阳性率为70.0%(14/20)显著高于慢性肝病组的阳性率37.8%(59/156)(P=0.008);HCC组的血清TNF-α水平明显高于慢性肝病组(P=0.000),而HCC组的血清IL-10、IL-12和IFN-γ水平与慢性肝病组的比较差异无显著性(P>0.05)。结论HBVBCP变异与原发性肝癌关系密切,且血清TNF-α在原发性肝癌的发生中可能起到一定的作用。     

HBV侵犯外周血单个核细胞对干扰素-γ表达的影响

目的:探讨HBV侵犯外周血单个核细胞(PBMCs)对干扰素-γ(IFN-γ)表达和分泌水平的影响。方法:巢式PCR检测120例慢性HBV感染者PBMCs中HBVDNA;采用实时定量RT-PCR和ELISA法分别检测PBMCs中IFN-γmRNA的表达及血清IFN-γ的分泌水平。结果:120例慢性HBV感染者PBMCs中HBVDNA阳性率为62.5%,且HBeAg阳性组PBMCs中HBVDNA阳性率(80.0%)明显高于HBeAg阴性组(45.0%);慢性HBV感染者IFN-γmRNA的表达和分泌水平均低于健康对照组;慢性HBV感染者PBMCs中HBVDNA阳性组IFN-γmRNA的表达和分泌水平均明显低于HBVDNA阴性组;HBeAg阳性组IFN-γ表达和分泌水平均明显低于HBeAg阴性组。结论:慢性HBV感染者IFN-γ的表达和分泌水平与HBV侵犯PBMCs有关,亦与不同疾病状态相关。     

慢性肝病与HBVBCP变异、IL-10、IL-12、TNF-α及IFN-γ关系研究

目的：探讨不同临床类型慢性肝病与HBVBCP变异及IL-10、IL-12、TNF-α和IFN-γ关系。方法：以176例HBV感染慢性感染者（慢性乙型病毒性肝炎轻、中、重度,肝炎肝硬化,慢性重型肝炎和原发性肝癌）作为研究对象。采用PCR微板核酸杂交结合ELISA检测显示技术,对患者血清进行检测HBVBCP区核苷酸（nt）1762碱基A→T和1764G→A联合突变;采用双抗体夹心ELISA检测技术,检测IL-10、IL-12、TNF-α和IFN-γ水平。结果：BCP变异与不同临床类型肝病呈正相关（r=0.259,P=0.001）。IL-12、TNF-α和IFN-γ的水平除了慢性肝炎中度组外,其余各组与慢性肝炎轻度组间的比较有显著差异（P〈0.05）。而IL-10水平比较在慢性肝炎轻度组与其他组间差异无统计学意义（P〉0.05）。结论：BCP变异与慢性感染的不同临床类型呈正相关,随着病情的加重BCP变异的阳性率有随之增高趋势。IL-12、TNF-α和IFN-γ在HBV感染不同临床类型肝病中可能起到主要作用。     

乙型肝炎病毒前C区/BCP区突变及其临床意义

目的探讨利用基因芯片技术检测乙型肝炎病毒(HBV)前C区/BCP区基因突变方法的临床价值及前C区/BCP区基因突变的临床意义。方法应用基因芯片技术检测95例慢性乙型肝炎患者的HBV前C区G1896A(nt1896G→A)、A1814C(nt1814A→C)及HBV C基因启动子(BCP)T1762A、G1764A(nt1762A→T、nt1764G→A)四位点突变,同时检测血清HBV DNA含量及ALT、AST水平。结果95份血清标本中,有91份分别检测到了HBV前C区/BCP区基因突变,阳性率95.8%,其中61896A突变33例(36.3%),A1762T G1764A联合突变64例(70.3%),G1896A A1762T G1764A联合突变22例(24.2%),未检测到A1814C突变毒株。抗-HBe阳性的慢性乙肝患者HBV前C区/BCP区突变率较HBeAg阳性的患者明显增高。G1896A突变后血清ALT水平与未变异组比较有显著性差异(P<0.05),而其他各组的肝功能无显著变化。G1896A A1762T G1764A联合突变后,血清HBV DNA水平较未变异组降低(P<0.05),其他各组间则无显著变化。结论应用基因芯片法测定HBV特定变异位点,可一次同时检测多个突变位点,具有一定的临床应用价值。HBV前C区/BCP区突变对血清HBVDNA水平和肝功能有一定的影响。     

乙型肝炎病毒C基因启动子变异、HBV DNA及细胞因子与原发性肝癌的关系

目的：探讨乙型肝炎病毒C基因启动子（HBVBCP）变异、HBVDNA及细胞因子与原发性肝癌（HCC）的关系。方法：将176例HBV慢性感染者分为慢性肝病组（156例）和HCC组（20例）。采用PCR微板核酸杂交结合ELISA检测显示技术检测HBVBCP区核苷酸（nt）1762碱基A→T和1764碱基G→A联合突变。并检测两组患者的血清HBVDNA含量及细胞因子白细胞介素-10（IL-10）、IL-12、肿瘤坏死因子α（TNF—α）、γ干扰素（IFN-γ）水平。结果：HBVBCP变异在HCC组的阳性率（70．0％）显著高于慢性肝病组（37．8％，P〈0．01）。HCC组的血清HBVDNA含量、TNF—α水平均显著高于慢性肝病组（P〈0．05，P〈0．01），而血清IL-10、IL-12和IFN-γ水平与慢性肝病组无显著性差异（均P〉0．05）。结论：HBV BCP变异与原发性肝癌关系密切．且血清TNF—α及HBV DNA复制水平在原发性肝癌的发生中可能也起到主要的作用．     

乙型肝炎病毒A1762T/G1764A变异的临床意义

目的 探讨乙肝病毒（HBV）A1762T／G1764A变异的临床意义。方法 应用基因芯片方法对115例慢性乙型肝炎患者进行HBV A1762T／G1764A变异检测,分析A1762T／G1764A变异与临床类型、HBV-DNA、HBeAg及肝纤维化血清学指标透明质酸（HA）、Ⅲ型前胶原（PⅢP）、Ⅳ型胶原（CL-Ⅳ）、层粘蛋白（LN）的关系。结果 慢性乙型肝炎轻度、中度、重度及肝炎肝硬化中A1762T／G1764A变异率分别为43％、55％、61％、89％（P〈0．05）;A1762T／G1764A变异组病人肝纤维化指标HA、PⅢP、CL-Ⅳ明显高于对照组（P〈0．05）。结论 HBV A1762T／G1764A变异与与疾病进展及肝纤维化具有相关性。     

肝脏疾病进展与乙型肝炎病毒前 C／C 区突变

目的：研究慢性乙型肝炎患者前C/C区突变位点与肝脏疾病进展的临床意义。方法应用实时荧光定量PCR及直接测序法检测HBeAg阴性慢性乙型肝炎30例、HBeAg阳性慢性乙型肝炎20例,分析前C/C区变异位点与患者病情进展的相关性。结果肝硬化组前C/C区变异位点T1762/A1764、A1896发生率（86.3％,54.5％）明显高于慢性肝炎组（32.1％,35.7％）,差异均有统计学意义（ P ＜0.05）。慢性肝炎组与肝硬化组HBV载量差异无统计学意义（ P ＞0.05）;HBeAg阴性患者T1762/A1764,T1766/A1768,A1896变异位点发生率较HBeAg阳性患者显著增高（ P ＜0.05）。结论 T1762/A1764,A1896突变率的增加会促使肝脏疾病进展至肝硬化;HBeAg阴患者T1762/A1764,T1766/A1768,A1896变异位点的频率增加会促进肝脏疾病的进展。     

慢性HBV感染患者bcp/pc区点突变模式、pres区缺失及其临床意义

目的阐明HBV(hepatitis B virus,HBV)感染患者不同临床阶段bcp/pc(basic core promoter,BCP/precore,PC)点突变模式及pres区缺失突变规律,并探讨其临床意义。方法慢性HBV感染患者180例,其中,无症状HBV携带者13例,慢性乙型肝炎者75例,HBV相关肝硬化及肝癌分别为62、30例。Qiagen法提取血清HBV-DNA,常规PCR扩增目的基因,纯化PCR产物ABI377DNA自动测序仪直接双向测序。直接测序失败者,回收目的 DNA与PMD-18T载体连接,克隆质粒双向测序。DNAStar软件包的SeqMan软件进行生物信息分析。结果 Bcp/pc区点突变包括nt1753、nt1762、nt1764、nt1776、nt1803、nt1846、nt1896。HBV携带者、慢性乙型肝炎、HBV相关肝硬化及肝癌患者nt 1762(nt 1764)点突变率分别为7.7%、68.0%、72.7%(68.0%)及90.9%(81.8%),肝癌患者G1896A突变频率占54.6%。A1762T+G1764A联合突变占36%;A1762T、G1764A、G1896A联合突变占11%;T1753A/C、A1762T、G1764A、G1896A发生率为7%。克隆测序显示,肝硬化及肝癌患者bcp区起始点A1727G点突变率分别为72%、63%。HBeAg阴性患者存在更多的基因变异(P=0.022),G1776A和G1896A突变是HBeAg阴性的独立预测因素(P<0.05)。Bcp区点突变与HBeAg阴性无明显关系。肝硬化和肝癌患者pres基因缺失突变频率最高,肝癌及肝硬化患者pres1、pres2及pres1+s2缺失频率分别为7.1%、71.4%、7.1%及41.2%、58.8%、29.4%(P<0.05)。结论 A1727G、A1762T、G1764A及A1762T/G1764A联合突变、pres缺失在HBV相关肝硬化及肝癌患者多见,可能是肝脏疾病进展的危险因素,G1776A和G1896A突变是HBeAg阴性的独立预测因素。Bcp/pc点突变及pres区缺失可能为肝癌发生的早期预测因素,值得进一步研究。     

乙型肝炎病毒基本核心启动子T1762A1764 联合突变的临床意义

目的:研究乙型肝炎患者乙型肝炎病毒(HBV)基本核心启动子(BCP)T^1762A^1764联合突变情况及其临床意义。方法:采用聚合酶链反应(PCR)与限制性长度片段多态性分析(RFLP)相结合，检测130例乙型肝炎患者BCP区核苷酸(nt)1762碱基A→T和1764碱基G→A联合突变。结果：HBeAg( )和HBeAb( )两组患者中BCP T^1762A^1764联合突变率的不同频率分别为慢性乙型肝炎患者(Chronic hepatitis B，CHB)40．0％和85．7％，无症状携带者(Asymptomatic carrier，ASC)22．2％和65．0％，献血员为5％。BCP T^1762A^1764双点联合突变组HBV-DNA≥10^5 cps／ml检出例数81例(96．4％)，非突变组HBV-DNA≥10^5 cps／ml检出例数25例(54．3％)。结论：BCP T^1762A^1764联合突变与乙型肝炎的发生、发展以及预后有关，可能是CHB与ASC患者HBeAg(-)的原因之一，可促进乙肝病毒繁殖。对慢性乙型肝炎患者检测HBV BCP T^1762A^1764联合突变有一定的临床意义。     

慢性乙肝患者e抗原血清转换与HBV基因变异的关系

目的 :了解慢性乙肝患者e抗原血清转换中HBV -DNA前C基因及C基因启动子变异的关系。方法 :HBV -DNA阳性且e抗原 /或e抗体阳性的慢性乙型肝炎患者各 30例 ,以PCR结合微板核酸杂交 -ELISA方法检测乙肝病毒前C基因 (nt 1896、nt 1899)及其基本核心启动子 (BCP ,nt 176 2、nt 176 4)变异。结果 :不论前C基因还是BCP变异 ,均与e抗原血清转换相关 (P <0 .0 5 ) ;不论e抗体阳性组还是e抗原阳性组 ,BCP变异均高于前C基因变异 (P <0 .0 5 ) ,但二者均不相关 (P >0 .0 5 )。结论 :乙肝病毒C基因启动子与前C基因的变异是随机的 ,都可下调HBeAg的表达 ,前者更易于发生变异。     

酒精对慢性乙型肝炎患者乙肝病毒多位点基因突变影响研究

目的：探讨酒精对HBV DNA多位点基因变异的影响,为慢性乙型肝炎的临床诊断和治疗提供依据。方法:选取45例慢性乙肝患者为研究对象,分为嗜酒组和非嗜酒组,采用DNA芯片技术, 检测HBV DNA前C区1896及1814位点、BCP区1762及1764位点、P区528及552位点的基因变异。结果:嗜酒组在BCP区1762 、1764位点的变异率明显高于非嗜酒组(P均＜0.05)。在前C区1896、1814位点,P区528、552位点变异率差异无统计学意义（P均＞0.05）。结论:酒精可导致乙肝病毒BCP区1762 、1764位点发生基因突变,BCP区基因变异可促进HBV在人体内的复制表达,加重慢性乙型肝炎患者的病情。     

HBV多基因位点变异与肝细胞癌相关性研究

目的探讨乙型肝炎病毒前C区和C基因启动子基因变异与肝细胞癌发生的关系。方法采用实时荧光PCR检测29例慢性乙型肝炎（CHB）,27例乙型肝炎肝硬化（LC）,26例HBV相关肝细胞癌（HCC）患者血清HBV前C区G1896A和BCP区A1762T／G1764A的变异情况。结果HCC组和LC组前c区G1896A和BCP区A1762T／G1764A变异率均显著高于CHB组（P≤0．005）,HCC组和LC组间无显著差异（P〉0．05）。结论乙型肝炎病毒C基因启动子和前c区基因变异与肝细胞癌、肝硬化的发生密切相关。     

乙型肝炎病毒前-C区1896和基本C区启动子区1762、1764 双突变及YMDD变异对拉米呋啶治疗的影响

目的:研究乙型肝炎病毒前-C区G1896A突变和基本C区启动子区A1762T、G1764A双突变对拉米呋啶治疗的影响。 方法:采用直接测序法对服药前、中、后的血清标本的逆转录多聚酶区及前-C、基本C区启动子区进行检测。 结果:①前-C区G1896A和基本C区启动子区A1762T、G1764A双突变在出现治疗中病毒学反弹与未出现治疗中病毒学反弹患者间及发生血清学转移与未发生血清学转换患者间差异无显著性(P>0.05);②G1896A突变在发生YMDD变异和未发生YMDD变异的患者间差异有显著性(P<0.05),发生YMDD变异的患者很少伴有G1896A突变率低(9%);③出现治疗中病毒学反弹的患者YMDD变异增加,与未出现治疗中病毒学反弹的患者比较差异有显著性(P<0.05)。 结论:前-C区G1896A和基本C区启动子区A1762T、G1764A双突变对拉米呋啶治疗后出现的治疗中病毒学反弹和血清学转换没有影响;在G1896A突变株YMDD变异减少;YMDD变异株的出现对治疗后出现的治疗中病毒学反弹有影响;YMDD变异可能是加剧肝细胞损伤引起治疗中病毒学反弹的因素之一。     

Relation between hepatitis B virus genotypes and gene mutation of basic core promoter in Li nationality

Objective:To investigate the relation between hepatitis B virus(HBV) genotypes and the double mutation of A-to-T nucleotide(nt) 1762 and G-to-A nt 1764 in basic core promoter(BCP T1762/A1764) in patients of the Li nationality. Methods:Subjects were 125 HBV DNA positive patients that belong to the Li nationality on Hainan Island. HBV DNA genotype was determined by real time fluorimetry polymerase chain reaction. BCP T1762/A1764 mutation was performed using the direct sequencing method. Results:The prevalence rates of genotype B, genotype C, genotype D, genotype C and D mixed infection(genotype C＋D) and genotype B and D mixed infection (genotype B＋C) were 31.20%, 53.60%, 12.00%, 2.40% and 0.80% respectively. Mutation frequencies in patients infected with HBV genotype C(58.21%) were significantly higher than in those infected with other genotypes (P ＜0.01). The serum viral load of the patients with genotype C(5.74±1.21) was also higher than that of those with genotype B(P ＜0.01). Conclusion:The major genotypes in the Li nationality were genotype C and genotype B. The infection of genotype D and mixed infection also occurred in the Li nationality. Genotype C HBV has a higher replication rate, and the different degrees of pathogenecity among HBV genotypes may be related to BCP T1762/A1764 mutation frequency.     

Distribution of hepatitis B virus genotype and cancer predicting precore and basal core promoter mutations

Background

Chronic hepatitis B (CHB) infection which is associated with an increased risk of developing liver disease including cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Viral factors that may increase the risk for HCC development include HBV DNA level, genotypes, and naturally occurring mutations such as hepatitis B virus precore (PC) (G1896A) and basal core promoter (BCP) A1762T/G1764A double mutations. HBV genotypes and subgenotypes can significantly influence HBeAg seroconversion rates, viremia levels, mutational patterns that could significantly influence the heterogeneity in clinical manifestations and even response to antiviral therapy.

Method

94 CHB infected individuals with detectable serum HBV DNA levels were studied. HBsAg, HBeAg, anti-HBc IgM antibody estimations were done by ELISA. HBV DNA estimation was done. The HBV genotypes were determined by TSP-PCR and 10 samples randomly selected for DNA sequencing. PC and BCP mutations were determined by DNA sequence analysis of core region.

Result

Of 94 study participant samples with detectable serum HBV DNA levels, 75 were successfully genotyped and sequenced for BCP/PC region. 30/75 (40%) harbored PC and BCP mutations. The total Double mutations of BCP at A1762T/G1764A nucleotide positions, and PC mutation at G1896A nucleotide position were seen in 29.3% and 21.3%, respectively. All 75 isolates were subtype D using TSP-PCR. However, by sequencing 2/10 were subtype A, while 8 were subtype D.

Conclusion

Our study reinforces that D is the predominant genotype in Indian population. It reveals that Indian CHB subjects have increased prevalence of BCP & PC mutations, which possibly may lead to development of HCC.     

原发性肝细胞癌中乙型肝炎病毒基因整合的突变分析

目的探讨乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)整合序列中基本核心区突变与乙肝病毒相关肝癌发生的相关性。方法应用Alu-PCR和基于接头的LM-PCR方法扩增40对乙肝相关性肝癌组织和配对癌旁组织中整合的HBV序列,PCR产物纯化后以ABI公司3700测序仪进行全自动测序,测序结果使用Pub Med BLAST软件和Bio Edit软件进行分析。结果 65.0%的肝癌组织检测到整合HBV病毒序列(26/40),共检出37个不同的HBV整合序列。67.5%的癌旁组织中检测到整合HBV病毒(27/40),共检出68个不同的整合序列。平均每例肝癌组织中HBV整合序列检出数为1.42个,而癌旁组织为2.52个,癌组织低于癌旁组织。整合HBV序列发生A1762T/G1764A双突变在肝癌中的检出率高于癌旁组织,差异无统计学意义。结论 HBV感染相关肝癌组织及癌旁组织中都检测到整合HBV序列,再次表明整合是肝癌发生中的一个早期事件;而肝癌组织中整合HBV序列有更高的A1762T/G1764A突变检出率,从一个新的侧面表明这些突变在病毒的致癌过程中具有重要作用。