肝癌细胞实验室大量培养的方法及其质腔

目的 探讨以提取肝癌抗原肽为目的的肝癌细胞实验室大量培养方法及其质量控制。方法 先利用普通培养瓶在ＣＯ２孵箱中进行少量培养,再接种到１０Ｌ转瓶进行旋转培养;ＦＣＭ检测ＭＨＣ－Ｉ类抗原表达。结果 细胞数增加１～９倍,不仅保持了ＭＨＣ－Ｉ类抗原的表达量,而且,培养细胞质量高、好。结论 建立了用于制备肝癌抗原肽的肝癌细胞实验室大量培养方法。     

内皮素在培养的肝癌细胞中的表达及其作用

确定人肝癌细胞合成释放内皮素与否；探讨外源性ＥＴ－１对培养的人肝癌细胞增殖的影响。方法：应用特异性放射免疫分析法测定肝癌细胞培养液中ＥＴ－１含量；采用＾３Ｈ－胸腺嘧核苷参入和液体闪烁技术观察ＥＴ－１对培养的加和不加表皮生长因子的肝癌细胞增殖的影响。     

C2-神经酰胺诱导肝癌细胞凋亡

目的 观察无血清条件下神经酰胺对人肝癌细胞SMMC-7721细胞凋亡的诱导作用。方法 采用AO-EB荧光染色、流式细胞术DNA倍体分析和DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡。结果 终浓度10μmol/L的C2-神经酰胺作用24h，可诱导无血清培养的SMMC-7721细胞发生凋亡，AO-EB染色可见典型的细胞凋亡表现，细胞核固缩、浓染、裂解，细胞质芽突脱落成为凋亡小体。经流式细胞仪检测可见典型的亚二倍体峰。DNA凝胶电泳呈现典型的180-200bp的DNA梯状条带。结论 C2-神经酰胺可诱导SMMC-7721细胞凋亡。     

人肝癌组织伴生成纤维细胞的体外培养及其生物学性状的初步探讨

目的:体外培养人肝癌组织伴生成纤维细胞,观察其生长状态,为进一步研究其功能奠定基础。方法:应用组织块培养法进行人肝癌伴生成纤维细胞的原代培养,细胞铺满培养瓶底后首次传代,通过胰酶消化法和反复贴壁法进行成纤维细胞的纯化;通过倒置显微镜观察细胞形态、免疫组织化学方法检测细胞膜波形蛋白(v im entin)、角蛋白(keratin)表达情况,对细胞进行鉴定。结果:组织块法原代培养约1周可见纤维样细胞从组织块周围游出,5周左右细胞基本长满培养瓶底。首次传代时应用胰酶消化法进行成纤维细胞的初次纯化,第2次转种时先后应用酶消化法和反复贴壁法再次进行细胞纯化,第3代以后基本可获得呈典型克隆性生长、长梭形纤维样细胞,生长周期短。免疫组化染色结果为v im entin染色阳性,keratin染色阴性。结论:在体外成功培养了人肝癌组织伴生成纤维细胞,并对其生物学性状进行了初步探讨,为进一步研究其与肝癌细胞生长、浸润及转移的关系等机制奠定了基础。     

硬脂酸和苹婆酸对培养大鼠肝癌细胞形态的影响

目的：观察硬脂酸、苹婆酸对培养大鼠肝癌细胞形态的影响。方法：油红Ｏ染色以及扫描和透射电镜技术。结果：硬脂酸、苹婆酸加入肝癌细胞的培养基后，细胞形态发生显著改变，梭形细胞增多，一些细胞伸出较大的胞质突起，有些细胞可借这种突起互相接触，细胞表面微绒毛增多，有些细胞的微绒毛与相邻细胞的胞膜呈相嵌接触，有的甚至延伸至相邻细胞的核膜附近。胞浆较为丰富，线粒体形态趋于正常。油红Ｏ染色结果显示，硬脂酸、苹婆酸加     

丹参酮ⅡA对人肝癌BEL-7402细胞生长的影响及其机制

目的研究丹参酮ⅡA对体外培养的人肝癌细胞系BEL-7402细胞生长的影响及其作用机制。方法0~10 μg/ml丹参酮ⅡA作用人肝癌BEL-7402细胞72 h后,用倒置相差显微镜观察丹参酮ⅡA对BEL-7402细胞的生长抑制作用;荧光显微镜、透射电镜、DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡;流式细胞术检测不同浓度丹参酮作用后细胞凋亡率的变化。结果肝癌细胞经丹参酮ⅡA作用后,细胞生长明显受到抑制;荧光显微镜、透射电镜观察发现细胞皱缩、核质浓缩、核碎裂、细胞起泡及凋亡小体形成等凋亡特征性形态改变;琼脂糖凝胶电泳观察到DNA“梯状带”;流式细胞仪定量分析示浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、和10.0 μg/ml的丹参酮ⅡA处理肝癌细胞72 h后,细胞凋亡率分别为(20.78±2.17)%、(24.64±2.07)%、(31.47±3.86)%、(43.65±4.04)% 和(52.36±3.75)%,与对照组[(2.37±0.29)%]比较,均有显著性差异。结论丹参酮ⅡA能抑制体外培养的人肝癌细胞系BEL-7402细胞的生长,其机制可能为诱导细胞凋亡。     

β细胞素在肝癌中的表达及其与肝癌侵袭能力的相关性研究

目的:检测β细胞素(BTC)在肝癌组织及癌旁组织中的表达并探讨其与肝癌侵袭能力的相关性。方法:采用免疫组织化学法检测BTC在肝癌组织和癌旁组织中的表达水平。结果:BTC在肝癌组织中的表达与癌旁组织相比存在高表达的现象,且肿瘤直径≥3cm和有包膜浸润的肝癌组织中BTC也存在高表达的现象,而且这些差异有统计学意义(P<0.05)。结论:BTC表达与肝癌的增殖、侵袭能力密切相关,可能在肝癌发生、发展过程中起着重要的作用。     

肝癌细胞转染野生型p53基因稳定表达后肝癌细胞出现自发凋亡

肝癌细胞转染野生型ｐ５３基因稳定表达后肝癌细胞出现自发凋亡＊张晓东１王文亮１穆峰２（１第四军医大学病理学教研室西安７１００３３２第四军医大学唐都医院胸外科）关键词肝肿瘤细胞凋亡ｐ５３基因转染中图号Ｒ７３－３１目的进一步探讨ｐ５３基因与细胞凋亡（ａｐｏ...     

大鼠肝星状细胞分离与培养方法的实验研究

目的：探讨一种经济易行的分离与培养大鼠肝星状细胞的方法,为研究肝纤维化的发病机制提供良好条件。方法：采用离体循环酶液灌注法对成年大鼠的肝脏进行消化,经两种密度的Nycodenze密度梯度液高速离心（20000r/min）和细胞悬液低速离心（40×g）去杂质后得到肝星状细胞。台盼蓝拒染实验鉴定细胞活率,desmin和GFAP免疫细胞化学双抗单染色法鉴定肝星状细胞的纯度。结果：肝星状细胞的得率为（3.6±0.1）×10^7/肝,肝星状细胞存活率为（92.8±0.8）%,对培养24h的肝星状细胞行desmin和GFAP共同鉴定DAB显色,细胞阳性率为（96.2±0.5）%。结论：本改良法在保证大鼠肝星状细胞产量的前提下提高了细胞纯度,有利于对原代大鼠肝星状细胞及肝纤维化的进一步研究。     

IVF实验室质控中影响鼠胚体外培养的因素分析

目的 :建立适宜的小鼠胚胎体外培养体系 ,探讨CO2 气体纯度和培养器皿对小鼠胚胎体外发育的影响。 方法 :采用微滴法培养 2 细胞鼠胚 ,以 4～ 8 细胞鼠胚和桑椹胚形成率作为判断培养效果的指标。 结果 :普通纯度CO2 气体培养组的 4～ 8 细胞形成率、桑椹胚形成率分别为 12 .5 %、0 .0 % ,高纯度CO2 气体培养组分别为6 7.6 %、4 4 .1% ,两组比较差异有统计学意义 (P均 <0 .0 0 1)。国产玻璃器皿培养组的 4～ 8 细胞形成率、桑椹胚形成率分别为 74 .4 %、5 3.5 % ,进口一次性器皿培养组分别为 85 .7%、6 2 .8% ,两组比较差异无统计学意义 (P >0 .0 5 )。结论 :高纯度CO2 气体更适宜鼠胚的体外发育 ;国产玻璃器皿与进口一次性器皿对鼠胚体外发育的效果相近     

DC-CIK细胞联合手术治疗原发性肝癌的临床研究

目的:评价树突状细胞(Dendritic cells,DC)-细胞因子激活的杀伤细胞(Cytokine induced killer,CIK)即DC-CIK细胞联合手术治疗原发性肝癌的临床疗效。方法:将67例原发性肝癌患者随机分为治疗组和对照组,治疗组34例,行肝癌切除术,术后给予DC-CIK细胞治疗。对照组33例,行肝癌切除术。治疗结束后比较2组的免疫功能、生活质量、生存率、肿瘤复发率及不良反应。结果:治疗组DC-CIK细胞治疗后CD3+、CD4+、CD16+CD56+和CD4+/CD8+比值明显上升,CD8+效应细胞比例下降,与治疗前比较差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,治疗组治疗后CD3+、CD4+、CD16+CD56+和CD4+/CD8+比值显著上升,CD8+效应细胞比例显著下降,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗组有61.8%的患者生活质量得到改善,明显高于对照组的36.4%(P<0.05)。治疗组的1年生存率为91.2%,对照组为81.8%,治疗组的1年复发率为8.8%,对照组为15.2%,两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。自体DC-CIK细胞治疗常见的副反应为发热、寒颤,对症处理后均可缓解。结论:DC-CIK细胞联合手术治疗原发性肝癌安全有效,对提高肝癌患者的免疫功能,改善患者生活质量,提高治疗效果具有重要作用。     

人肝细胞性和胆管细胞性肝癌的细胞角蛋白表达

为了明确用胆管型细胞角蛋白抗体在肝细胞性和胆管细胞性肝癌的鉴别诊断中的应用价值，我们用能在肝内特异性识别ＣＫ１９和ＣＫ１８的抗体及层粘连蛋白抗体进行了免疫组织化学研究。结果表明，１０例ＣＣ全为ＣＫ１９阳性，３７例ＨＣＣ中１４例（３８％）有ＣＫ１９阳性癌细胞，因此，我们提出ＣＫ１９表达与否不能作为鉴别ＨＣＣ和ＣＣ的标准，ＨＣＣ中ＣＫ１９表达与其分化程度无关，但与其组织学类型有关，呈腺样分化的癌巢全呈     

β细胞素下调对肝癌细胞增殖能力的影响及其机制探讨

目的:在肝癌细胞系中通过下调β细胞素(BTC)的表达研究其对肝癌细胞侵袭能力的影响并探究其影响机制。方法:通过siRNA转染下调BTC后,通过Transwell侵袭实验检测SMMC7721和MHCC97-H细胞的侵袭能力变化,并用RT-PCR和Western blot检测与肝癌侵袭能力相关的PI3K/AKT-XIAP信号通路的表达变化。结果:与阴性对照组相比,siRNA下调组中SMMC7721和MHCC97-H细胞的侵袭能力明显降低,PI3K/AKT-XIAP信号通路受到明显抑制。结论:下调BTC表达可能通过抑制PI3K/AKT-XIAP信号通路抑制肝癌细胞的侵袭能力。     

人肝癌细胞总RNA电转染树突状细胞对T细胞的激活效应

目的：采用Trizol一步法提取人肝癌细胞总RNA电转染人外周血树突状细胞（Dendritic Cell,DC）,观察其对混合T淋巴细胞的体外激活效应。方法：通过密度梯度离心法分离人外周血单核细胞,用细胞因子体外培养诱导其成为DC。Trizol一步法提取人肝癌细胞总RNA。通过电转染法将人肝癌细胞总RNA导入DC内;通过混合淋巴细胞实验,获取DC激活的特异性效应T细胞。用MTT法测定效应T细胞的增殖率。结果：电转染方法可将人肝癌细胞总RNA导入DC;电转染前后DC分子表达无显著差异。转染了人肝癌细胞总RNA的DC可特异的激活T细胞且增殖率明显增强（P〈0.05）。结论：电转染为人肝癌细胞总RNA导入DC提供技术上的可行性;转染了人肝癌细胞总RNA的DC可特异激活T细胞。     

肿瘤相关肝星状细胞促进肝癌细胞上皮间质转化和迁移

目的建立人肝癌组织中肿瘤相关肝星状细胞(tHSCs)分离、培养方法,探讨tHSCs对肝癌细胞生物学行为的影响。方法采用密度梯度离心法从新鲜切除的人肝癌组织样本中分离tHSCs锥虫蓝染色检测细胞活力,细胞免疫荧光鉴定活化tHSCs表达α-平滑肌肌动蛋白的特征,光镜观察培养的tHSCs形态学变化;tHSCs无血清培养后,收集条件培养液,分别与肝癌细胞系QGY-7701、BEL-7402、SMMC-7721共培养,并以肝星状细胞系LX-2做对照,采用MTT法、细胞划痕实验、蛋白质印迹等方法检测肝癌细胞增殖、迁移和上皮间质转化(EMT)相关指标的表达。结果从肝癌组织中分离的tHSCs活率在95%以上,纯度接近100%,在体外可进行传代培养与冻存。tHSCs能诱导3个受试肝癌细胞系产生典型的EMT样形态学变化及其分子标记物表达改变,表现为上皮标记物E-钙黏蛋白表达减少(P<0.05),间质标记物波形蛋白表达增加(P<0.05)。与此同时,tHSCs能促进培养的3个肝癌细胞系增殖和迁移。结论从人肝癌组织中分离的原代tHSCs活力和纯度高,可用于tHSCs的生物学功能实验研究。tHSCs在诱导肝癌细胞产生EMT样改变的同时,体外促进肝癌细胞的增殖和迁移。