抑制消减杂交（SSH）在植物功能基因研究中的应用

基于PCR的抑制消减杂交（SSHPCR）是目前用于差异cDNA序列的检测，以及构建基因组差异DNA文库最有效、并且应用最广泛的方法之一。虽然这种方法有很多优点，但仍存在一定的局限性，具有一些不可避免的缺陷。从四个方面讨论SSH在植物功能基因研究中的应用，进而探讨SSHPCR方法在植物基因克隆方面遇到的问题及解决对策。     

糖尿病肾病肾阴虚证DNA消减文库的构建

在多年糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)肾虚证的研究中,结果发现血管紧张素Ⅰ转换酶(angiotensin Ⅰ-converting enzyme,ACE)基因多态性与肾阴虚证密切相关[1].这提示肾阴虚证存在其相关基因.目前克隆疾病的相关基因有多种方法,其中抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)对研究复杂基因组的差异基因具有一定的优越性.目的:采用抑制性消减杂交技术(suppression sub-tractive hybridization,SSH)构建汉族人糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)肾阴虚证DNA消减文库.方法:选择汉族DN且中医辨证为肾阴虚证的患者以及正常人作为其对照组,进行正向和反向消减杂交.用硅胶法抽提血白细胞DNA,用RsaⅠ酶切基因组DNA成大小不等的片段,分别与两种不同的接头连接,进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将PCR产物与U载体连接,经蓝白斑筛选后,再用PCR方法插入片段筛选出阳性重组质粒,构建DN肾阴虚证DNA消减文库.结果:用SSH方法筛选出了DN肾阴虚证的差异DNA片段,得到586个白色克隆,再经PCR方法快速筛选出阳性重组质粒,从而成功地构建了DN肾阴虚证的DNA消减文库.结论:SSH技术能够快速有效地分离差异DNA片段以构建DN肾阴虚证DNA消减文库,为进一步筛选和克隆DN肾阴虚证相关基因奠定了基础.     

慢性肾炎肾阳虚证cDNA消减文库的构建

目的：采用抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization,SSH）技术构建汉族人慢性肾炎（chronic glomemlonephritisCGN）肾阳虚证cDNA消减文库。方法：选择汉族人CGN且中医辨证为肾阳虚证的患者以及正常人作为其对照组,进行正向和反向消减杂交。采用Trizol一步法提取总RNA。用SMART（Switch Mechanism At 5end of RNA Template）技术逆转录并扩增总cDNA,用RsaI酶切基因组cDNA成大小不等的片断,分别与两种不同的接头连接,进行2次消减杂交及两交抑制性PCR,建立抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization,SSH）,在SSH基础上进行镜像选择（mirror orientation selection,MOS）,将PCR产物与U载本连接,经蓝白斑筛选后,再用PCR方法插入片段筛选出阳性重组质粒,构建CGN肾阳虚证消减文库。结果：用SSH方法筛选出了CGN肾阳虚证的差异cDNA片段。得到了443个白色克隆,再经PcR方法快速筛选出阳性重组质粒,从而成功地构建了CGN肾阳虚证的cDNA消减文库。结论：SSH技术能够快速有效地分离差异cDNA片段以构建CGN肾阳虚证cDNA消减文库,为进一步筛选和克隆CGN肾阳虚证相关基因奠定了基础。     

运用抑制性消减杂交技术构建糖尿病肾阳虚证DNA消减文库

目的:运用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)构建糖尿病(Diabetic mellitus,DM)肾阳虚证DNA消减文库。方法:选择汉族中医辨证为肾阳虚证的DM患者以及正常人做对照组,进行正向和反向消减杂交。用RsaⅠ酶切用硅胶法抽提基因组DNA成大小不等的片段,分别连接两种不同的接头,进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将PCR产物与U/A载体连接,经蓝白斑筛选及菌液PCR筛选出阳性重组质粒,构建DM肾阳虚证DNA消减文库。结果:用SSH方法筛选出DM肾阳虚证的差异DNA片段,经克隆及PCR筛选出阳性重组质粒,从而成功地构建了DM肾阳虚证的DNA消减文库。结论:SSH技术能够快速有效地分离差异DNA片段以构建DM肾阳虚证DNA消减文库,为进一步筛选和克隆DM肾阳虚证相关基因奠定了基础。     

狼疮性肾炎肾阴虚证cDNA消减文库的构建

目的:采用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术构建汉族人狼疮性肾炎(LupusNephritis LN)肾阴虚证cDNA消减文库。方法:选择汉族人LN且中医辨证为肾阴虚证的患者以及正常人作为其对照组,进行正向和消减杂交。采用Trizol一步法提取总RNA,用SMART(Switch Mechanism At 5 end of RNA Template)技术逆转录并扩增总cDNA,用RsaI酶切基因组cDNA成大小不等的片段,分别与两种不同的接头连接,进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将PCR产物与U载体连接,经蓝白斑筛选后,再用PCR方法插入片段筛选出阳性重组质粒,构建LN肾阴虚证消减文库。结果:用SSH方法筛选出了LN肾阴虚证的差异cDNA片段,得到了450个白色克隆,再经PCR方法快速筛选出阳性重组质粒,从而成功地构建了LN肾阴虚证的cDNA消减文库。结论:SSH技术能够快速有效地分离差异cDNA片段以构建LN肾阴虚证cDNA消减文库,为进一步筛选和克隆LN肾阴虚证相关基因奠定了基础。     

糖尿病肾病肾阳虚证DNA消减文库的构建

目的：采用抑制性消减杂交技术(suppression subtractire hybridization，SSH)构建汉族人糖尿病肾病(dialbetic nephropth1y，DN)肾阳虚证DNA消减文库。方法：选择汉族人DN且中医辨证为肾阳虚证的患者以及正常人作为其对照组，进行正向和反向消减杂交。用硅胶法抽提血白细胞DNA，用RsaI酶切基因组DNA成大小不等的片段，分别与两种不同的接头连接，进行两次消减杂交及两次抑制性PCR，将PCR产物与U载体连接，经蓝白斑筛选后，再用PCR方法插入片段筛选出阳性重组质粒，构建DN肾阳虚证DNA消减文库。结果：用SSH方法筛选出了DN肾阳虚证的差异DNA片段，得到600个白色克隆，再经PCR方法快速筛选出阳性重组质粒，从而成功地构建了DN肾阳虚证的DNA消减文库。结论：SSH技术能够快速有效地分离差异DNA片段以构建。DN肾阳虚证DNA消减文库，为进一步筛选和克隆DN肾阳虚证相关基因奠定了基础。     

糖尿病肾病肾阴虚证DNA消减文库的构建

在多年糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)肾虚证的研究中，结果发现血管紧张素Ⅰ转换酶(angiotensin Ⅰ—converting enzyme．ACE)基因多态性与肾阴虚证密切相关。这提示肾阴虚证存在其相关基因。目前克隆疾病的相关基因有多种方法，其中抑制性消减杂交(suppression subtractiv ehybridization。SSH)对研究复杂基因组的差异基因具有一定的优越性。目的：采用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridiration，SSH)构建汉族人糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)肾阴虚证DNA消减文库。方法：选择汉族DN且中医辨证为肾阴虚证的患者以及正常人作为其对照组，进行正向和反向消减杂交。用硅胶法抽提血白细胞DNA。用Rsa Ⅰ酶切基因组DNA成大小不等的片段，分别与两种不同的接头连接．进行两次消减杂交及两次抑制性PCR，将PCR产物与U载体连接，经蓝白斑筛选后，再用PCR方法插入片段筛选出阳性重组质粒，构建DN肾阴虚证DNA消减文库。结果：用SSH方法筛选出了DN肾阴虚证的差异DNA片段，得到586个白色克隆，再经PCR方法快速筛选出阳性重组质粒，从而成功地构建了DN肾阴虚证的DNA消减文库。结论：SSH技术能够快速有效地分离差异DNA片段以构建DN肾阴虚证DNA消减文库．为进一步筛选和克隆DN肾阴虚证相关基因奠定了基础。     

分子生物学技术在中药鉴定中的应用

本文总结了近年来分子生物学技术在中药鉴定,包括在动、植物药材鉴定方面的应用,并简述这些技术的原理和方法。将应用的分子生物学技术分为 3类：电泳技术、生物免疫技术和 DNA分子遗传标记技术 (1.基于 PCR反应的方法,包括随机扩增多态 DNA、任意引物聚合酶链反应、微卫星 DNA、扩增片段长度多态和毛细管 PCR; 2.限制性片段长度多态和 PCR产物的 RFLP分析; 3.DNA测序; 4.高特异性 PCR鉴别; 5.DNA芯片或基因芯片鉴别 )。本文可供中医药工作者作参考。     

菌根真菌诱导的铁皮石斛根差减cDNA文库构建

 目的 构建菌根真菌共生诱导的铁皮石斛根的差减cDNA文库,从中筛选出差异表达基因。方法 采用SMARTer PCR cDNA合成方法直接以总RNA为模板合成并富集稀少cDNA,再利用抑制消减杂交（SSH）方法构建受菌根真菌共生诱导铁皮石斛根的差减cDNA文库。结果 成功构建了受菌根真菌诱导铁皮石斛根的差减cDNA文库,共获得1 975个阳性克隆。经检测,90%以上克隆能扩增出有效产物,其插入片段大小在150~1 000 bp之间。随机挑取了20个克隆菌液测序并进行了比对分析,大部分为植物应对环境胁迫防御性基因。结论 该技术体系所构建的差减cDNA文库质量较好,操作方便,尤其适用于珍稀濒危的植物材料。     

狼疮性肾炎肾阴虚证DNA消减文库的构建

目的：采用抑制性消减杂交技术(Suppression subtractive hybridization，SSH)构建狼疮性肾炎(lupus nephritis，LN)肾阴虚证DNA消减文库。方法：选择汉族人LN中医辨证为肾阴虚证患者以及正常人作为其对照组，用硅胶法抽提血白细胞DNA，经过酶切、接头连接、两次抑制性消减杂交及抑制、巢式PCIR后，将PCIR产物与A载体连接，经蓝白斑筛选，再用PCIR方法插入片段筛选出阳性重组质粒，构建LN肾阴虚证DNA消减文库。结果：用SSH方法筛选出了LN肾阴虚证的差异DNA片段，得到581个白色克隆，再经PCR方法快速筛选出阳性重组质粒，从而成功地构建了DN肾阳虚证的DNA消减文库。结论：SSH技术能够快速有效地分离差异DNA片段以构建LN肾阴虚证DNA消减文库，为进一步筛选和克隆LN肾阴虚证相关基因奠定了基础，亦为寻找肾虚证相关基因提供重要线索。     

用抑制性差减杂交构建As2O3诱导的NB4 细胞凋亡相关基因文库

目的: 构建三氧化二砷(As_2O_3)诱导的急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4细胞凋亡相关基因文库.方法:用含4 μmol·L~(-1)As_2O_3和正常培养基培养NB4细胞24 h,抽提总RNA,经逆转录酶合成双链cDNA,分别以砷诱导凋亡组和对照组作为tester和driver,进行双向抑制性差减杂交(supptess-ion sublxactive hybridization,SSH),筛选As_2O_3诱导的NB4细胞凋亡相关基因,将差异表达基因进行PCR扩增并与pGEM-Teasy克隆载体连接,转化DH5 α大肠杆菌,经蓝白斑筛选获得白色阳性克隆,PCR扩增出未知基因片段.结果:成功构建了分别代表在NB4细胞中表达上调和下调的基因文库.结论: 经双向抑制性差减杂交获得了NB4细胞差异表达基因文库,为克隆NB4细胞凋亡相关基因奠定了基础.     

傣药苦冬瓜与小冬瓜的比较研究

目的:对傣药苦冬瓜与小冬瓜药材进行比较研究,为临床应用提供参考.方法:从苦冬瓜、小冬瓜的原植物、药材性状、显微、薄层色谱、临床应用等方面进行比较研究.结果:苦冬瓜与小冬瓜在植物形态、药材外观、显微等方面极为相似,但在药材的味道上,存在着极大的差异,薄层鉴别上日光下检视同样点样量显色斑点有微量差异外,254nm荧光下,小...     

石斛属植物rbcL基因序列变异和系统发育初步研究

目的 探讨10种石斛植物叶绿体rbcL基因序列变异和系统发育关系.方法 根据Genebank已经公布的植物rbcL基因序列设计一对引物,用于石斛rbcL基因PCR扩增.基因序列排列用Clustal X软件完成,应用Seqnconverter软件分析序列的长度、GC含量、GpC量、GCskew值等;用Mega 4.1软件分析转换值、颠换值、转换/颠换比;采用最大简约法(maximum parsimony method)获得最大简约系统树;应用自展法(bootstrap)检验系统树,自展次数为1 000次.结果 10种石斛植物叶绿体rbcL基因的长度范围为944～950 bp,其中536 bp为保守位点,466 bp为变异位点,439 bp为具有系统发育信息的信息位点.基因中GC含量为40.61%～41.37%,GpC含量为4.03%～4.78%,GCskew 值为0.043 2～0.082 1.序列转换/颠换比(Si/Sv)为0.9.结论 利用PCR和核酸测序方法可以获得rbcL基因的核苷酸序列,能为石斛植物的系统发育研究提供核苷酸序列方面的资料.     

厚朴的任意引物PCR指纹图谱分析

目的：鉴别中药材厚朴，凹叶厚朴及其常见的伪品和混淆品，方法：采用任意引物PCR（arbitrarily primed PCR,AP-PCR)技术扩增植物基因组DNA样品。结果：AP－PCR技术获得清晰可靠的DNA指纹图谱，根据琼脂糖凝胶上显示的DNA带型差异可迅捷地区分厚朴，凹叶厚朴及其伪品，混淆品。结论：为应用AP－PCR技术在分子水平上鉴别中药材厚朴，保证引种的准确性奠定了基础。     

分子生物学技术在中药鉴定中的应用

本文总结了近年来分子生物学技术在中药鉴定,包括在动、植物药材鉴定方面的应用,并简述这些技术的原理和方法,将应用的分子生物学技术分为3类：电泳技术、生物免疫技术和DNA分子遗传标记技术（1．基于PCR反应的方法,包括随机扩增多态DNA、任间引物聚合酶链反应、微卫星DNA、扩增片段长度多态和毛细管PCR;2．限制性片段长度多态和PCR产物的RFLP分析;3．DNA测序;4．高特异性PCR鉴别;5．DNA芯片或基因芯片鉴别）。本文可供中医药工作者作参考。     

论PCR在骨与关节结核诊断中的应用价值

目的探讨PCR在骨与关节结核诊断中的应用价值。方法选取2015年1月—2017年3月该院收治的49例骨与关节结核患者的临床资料为研究对象,分别应用PCR检测方法和抗酸检测法对其关节积液结核杆菌进行检测,并观察两种检测方法的阳性率及假阴性率情况。结果 PCR检测方法在阳性率、假阴性率等方面均显著优于抗酸法,两种方法的比较差异有统计学意义(P0.001)。结论 PCR在骨与关节结核的早期诊断中应用效果显著,可靠性强,具有临床推广价值。     

霍山石斛及相似种的位点特异性PCR鉴别

目的设计出霍山石斛的位点特异性鉴别引物,仅通过PCR就能对霍山石斛的真伪进行准确鉴别。方法利用石斛属植物基因库中rDNA ITS序列数据库进行同源性比较,在与霍山石斛差异较大的区段设计1对特异性引物,然后对19份石斛属植物DNA模板进行PCR扩增,阳性者即为霍山石斛正品。结果发现在退火温度为60℃时,该引物能把霍山石斛的模板从19份石斛属植物中扩增出来,而其他的石斛属植物均为阴性。结论运用位点特异性鉴别引物成功地对霍山石斛进行PCR鉴别,该鉴别反应重现性好,能在霍山石斛鉴别时发挥重要的作用,与形态学、DNA测序等鉴别方法相比,该方法具有高效、准确、简便、省时等优点。     

3种忍冬果实研究进展

忍冬科忍冬属植物种类目前约200种.在我国,蓝靛果忍冬、金银忍冬及忍冬是最常见的忍冬属植物,但目前对三者果实研究及开发利用程度却有较大差异.本文梳理了蓝靛果忍冬果实、金银忍冬果实及忍冬果实在性状、化学成分及药理作用等方面的异同,为今后相关研究及忍冬属果实的资源开发提供借鉴.     

铁皮石斛种子接菌共生萌发抑制差减杂交文库的构建及序列分析

 目的 研究铁皮石斛（Dendrobium officinale）种子接菌共生萌发差异基因表达谱特征。方法 采用抑制差减杂交（SSH）技术,分别以接菌及未接菌培养5周的铁皮石斛种子cDNA作为检测子与驱赶子,构建铁皮石斛种子接菌共生萌发抑制性消减cDNA文库。结果 对部分克隆产物测序,经GenBank中BLASTx同源比较后,进行基因功能注释,得到100个具有植物同源性的表达序列标签（EST）,主要涉及细胞与染色体结构、RNA合成、信号转导、能量与代谢、蛋白质合成与降解及细胞防御等。随机挑选5个目标基因,实时荧光定量PCR分析发现这5个基因在共生萌发的种子中均上调表达。结论 铁皮石斛种子接菌共生萌发涉及多种途径相关基因表达调控,本实验为兰科植物种子萌发分子机制研究奠定基础。     

基于DNA条形码技术的中药小蓟基原植物的分子鉴定

目的:对中药小蓟的基原植物进行分子鉴定,以确保药材质量及其临床疗效。方法:以核基因ITS2片段及叶绿体基因片段psbA-trnH作为DNA条形码,对研究材料进行PCR扩增并双向测序,所得序列经CodonCode Aligner拼接后,用软件MEGA4.0进行相关数据分析,并构建NJ(邻接)树。结果:所研究的刺儿菜复合体样本的ITS2序列间存在明显差异,psbA-trnH序列间也存在稳定差异,基于ITS2序列及psbA-trnH序列构建的邻接(NJ)树可以看出大刺儿菜与小刺儿菜不同样本均能聚为独立一支,表明中药小蓟的基原植物刺儿菜复合体确为两个独立的物种。结论:ITS2和psbA-trnH序列作为DNA条形码可以有效地区分和鉴别物种,在中药原植物物种分类与中药鉴定方面具有广阔的应用前景。