共表达ETEC CFA/Ⅰ、CS6福氏痢疾减毒株与单独表达CFA/Ⅰ及CS6混合疫苗株的免疫原性比较

目的　以减毒志贺菌为载体 ,研制肠毒素大肠杆菌 (enterotoxigenicEscherichiacoli,ETEC)多价疫苗可以有效防治细菌性腹泻。方法　以共表达肠毒素大肠杆菌定居因子CFA/Ⅰ和CS6的重组减毒福氏痢疾疫苗株FWL0 1(pZCF16 )和两种混合的表达CFA/Ⅰ的FWL0 1(pZHY2 1)和表达CS6的FWL0 1(pZLG6 )减毒福氏痢疾疫苗株 ,分别以同等剂量口服免疫BALB/c小鼠 ,比较二者肠毒素大肠杆菌定居因子的免疫效果。结果　免疫BALB/c小鼠全部产生了抗CFA/Ⅰ和CS6的特异性血清抗体IgG和分泌型抗体sIgA ,共表达CFA/Ⅰ、CS6的减毒福氏痢疾菌FWL0 1(pZCF16 )的免疫原性与混合的FWL0 1(pZHY2 1)和FWL0 1(pZLG6 )相似或稍高。结论　在同一菌株可以表达多种菌毛 ,构建ETEC多价疫苗有效可行     

产肠毒素大肠杆菌混合载体疫苗的免疫原性评价

本研究在构建表达ETEC菌毛抗原CFA/I、CS6和CS3、融合肠毒素LTB/STm的混合活载体疫苗的基础上 ,以两株福氏志贺载体疫苗 ,同等剂量相混合进行免疫。通过口服免疫 ,该混合多价活疫苗能够诱导机体产生相应的抗ETEC特异的血清和黏膜抗原抗体反应 ,达到了与各单独疫苗株一致的免疫效果 ,同时保持了载体志贺菌自身的免疫原性。     

毒素源性大肠杆菌CFA/Ⅰ、CS3重组菌株粘附力、免疫原性和保护性研究

采用可逆性肠结扎成兔腹泻(RITARD)动物模型检测了毒素源性大肠杆菌(ETEC)定居因子抗原Ⅰ(CFA/I)和表面抗原3(CS3)重组菌各1株的肠道粘附力,免疫原性和保护性。经肠道及口服接种重组菌株对肠道均有较强的粘附力,与CFAs阴性宿主菌相比P<0.0025。口服免疫家兔时,第4周血清抗体滴度达到高峰,滴度分别为1:9000和1:80000;肠道免疫家兔后血清效价在第2周达到高峰,滴度分别为1:8000和1:60000。在抗体滴度高峰时进行ETEC野生株攻毒,结果显示口服组抗腹泻保护率为66.7％～75％,肠道组为50.1％～71.4％。攻毒后免疫家兔的排菌天数较对照组明显减少。     

志贺菌福氏5a M90T热休克蛋白70(DnaK)多克隆抗体的制备和鉴定

目的制备小鼠抗志贺菌福氏5a M90T热休克蛋白70(Dna K)的多克隆抗体,并鉴定其特异性和效价。方法 PCR扩增M90T中的基因dna K插入到原核表达载体p ET-24a中,获得p ET24a-dna K重组质粒,然后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中表达,通过亲和柱纯化融合蛋白Dna K-His。将纯化的融合蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,采集抗血清。用免疫印迹法、ELISA和免疫荧光技术鉴定抗血清的特异性和效价。结果重组质粒p ET24a-dna K在大肠杆菌BL21(DE3)中可以高效表达。用纯化的融合蛋白Dna K-His免疫小鼠制备得到的多克隆抗体能特异性低检测志贺菌福氏5a M90T Dna K蛋白,能有效地用于免疫印迹法、ELISA和免疫荧光等试验。结论成功制备了抗志贺菌福氏5a M90T Dna K蛋白的小鼠多克隆抗体。     

宋内志贺氏菌I相大质粒的定向改造和诱动转移

本文通过全细胞PCR克隆了宋内志贺氏菌侵袭性I相大质粒上的virG基因的部分片段(virG*),并用天冬氨酸半醛脱氢酶基因(asd)取代了virG*的中间部分,随之插入自杀性诱动质粒pXL275中,获得重组质粒pKNVA1.通过细菌间交配和体内同源重组,pKNVA1整合至I相大质粒中,在另一温度敏感的结合转移质粒pTH10的帮助下,共整合质粒被诱动转移至福氏志贺氏菌FWL01和大肠杆菌X6097中,并通过氯霉素富集和蔗糖反选择使自杀质粒pKNVA1从大质粒上脱落下来,玻片凝集试验和大质粒电泳图谱证实了宋内I相大质粒的成功诱动转移,表明这是一种定向转移大质粒行之有效的方法.     

乙型肝炎病毒治疗性多表位基因疫苗在小鼠中的免疫应答研究

目的:分析乙型肝炎病毒(HBV)重组多表位抗原基因在大肠杆菌中非融合表达的蛋白B-BPT的免疫原性,以期为HBV预防/治疗性疫苗的研制奠定实验基础。方法:构建重组质粒pBAD/BPT,并在大肠杆菌中诱导表达。以纯化的蛋白B-BPT免疫BALB/c小鼠,用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测该融合蛋白诱导的小鼠细胞毒T淋巴细胞(CTL)应答。用流式细胞术(FCM)检测小鼠CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群的比例,用MTT比色法检测淋巴细胞的增殖效应。结果:B-BPT蛋白免疫BALB/c小鼠后,可诱导特异性CTL应答(P<0.05,与空白对照组比较);B-BPT蛋白免疫后,可显著刺激小鼠脾淋巴细胞增值(P<0.05,与空白对照组比较)。结论:该非融合表达的蛋白B-BPT可有效地诱导小鼠特异性CTL免疫应答,为进一步研制乙肝预防治疗性疫苗奠定了基础。     

抗原致敏期缺损补体增强抗肿瘤免疫效应

目的 观察蛇毒因子(CVF)缺损补体对疫苗诱导的抗肿瘤免疫的影响.方法 用CVF分别在抗原的致敏期和免疫的效应期缺损补体,抗原OVA加完全弗氏佐剂(CFA)联合免疫C57BL/6小鼠,14 d后接种E.G7肿瘤细胞,评价补体缺损效果,观察肿瘤出现时间,记录小鼠肿瘤大小.结果 OVA CFA免疫的正常小鼠,在肿瘤接种14 d内能完全抑制肿瘤生长;抗原致敏期缺损补体,肿瘤接种21 d内能完全抑制肿瘤生长;免疫效应期缺损补体,肿瘤出现的时间与OVA CFA免疫的正常小鼠相似.结论 抗原致敏期补体缺损可能有利于抗肿瘤免疫.     

慢性炎性痛诱致小鼠焦虑样行为和前扣带回TRPC3和TRPC6通道的表达上调

目的:探讨慢性炎性痛诱致小鼠焦虑样行为情况下前扣带回(anterior cingulate cortex,ACC)TRPC 3/6通道的表达改变。方法:采用小鼠痛行为检测方法、旷场行为检测方法和免疫印迹实验(Western Blot)。结果:小鼠后肢足底皮下注射完全弗氏佐剂(complete freund’s adjuvant,CFA)建立慢性炎性痛模型。痛行为检测结果显示足底皮下注射CFA可以诱致小鼠产生长时程的机械性和热痛觉过敏现象。旷场实验可见CFA致炎致痛后的小鼠较正常小鼠在旷场中央区活动距离明显降低,停留时间明显减少,提示慢性炎性痛小鼠表现为显著的焦虑样行为。进一步采用Western Blot实验发现炎性痛焦虑样小鼠前扣带回脑区的TRPC3和TRPC6通道蛋白表达水平较对照组动物显著上调。结论:CFA引发的慢性炎性痛模型中,小鼠产生焦虑样情绪,TRPC3和TRPC6通道蛋白在ACC部位的蛋白表达水平明显升高。提示这些焦虑样痛情绪的发生与疼痛痛觉通路中ACC脑区的TRPC3及TRPC6表达密切相关。     

人乳头瘤病毒HPV6b重组减毒沙门菌粘膜免疫的效果测定

为观察人乳头瘤病毒 6b型 (HPV6b )的重组减毒沙门菌载体疫苗粘膜免疫小鼠的免疫效果及探讨研制治疗尖锐湿疣的治疗性粘膜疫苗的机制 ,我们用构建的HPV6b重组减毒沙门菌粘膜免疫BALB/c小鼠 ,检测了阴道冲洗液中特异的SIgA、血清中IgG、T淋巴细胞增殖以及载体疫苗在机体内的稳定性。结果表明 ,粘膜免疫后 ,实验组与对照组相比较 ,阴道冲洗液中抗HPV6bL1的SIgA差异显著 ,实验组血清中抗HPV6bL1IgG水平低 ,T淋巴细胞增殖明显 ,疫苗在小鼠体内持续存在4 0d以上。研究结果提示我们所构建的重组减毒沙门菌粘膜免疫小鼠后 ,阴道粘膜局部能分泌特异的抗人乳头瘤病毒HPV6bSIgA ,也能激发细胞免疫 ,且此疫苗在小鼠体内能稳定存在。     

共表达HIV-1 gag-gp120与白细胞介素6重组鸡痘病毒的筛选

目的构建共表达中国株HIV1gaggp120与白细胞介素6(IL6)的重组鸡痘病毒(FPV)。方法分别将HIV1gaggp120基因和IL6基因插入到FPV表达质粒pUTAL复合启动子和单一启动子下游,构建重组FPV表达质粒pUTAGEIL6。利用脂质体法将重组质粒和FPV282E4株共转染鸡胚成纤维细胞,经BUdR加压筛选,重组病毒分别用SDSPAGE和WesternBolt进行鉴定,观察病毒样粒子的形成和重组病毒在哺乳动物细胞中的表达,并分析其免疫原性。结果阳性重组病毒基因组点膜处有显色斑点,WesternBolt结果显示重组病毒表达了gaggp120嵌合蛋白和IL6,在病毒感染细胞中有反转录病毒样粒子形成,且重组病毒可在哺乳动物细胞中表达目的蛋白。小鼠免疫指标检测表明该重组病毒具有很好的免疫原性。结论成功构建了共表达中国株HIV1gaggp120与IL6的重组FPV,为HIV-1基因工程活载体疫苗和巨分子颗粒化疫苗的制备奠定了基础。     

不可分型流感嗜血杆菌外膜蛋白P6的重组表达及免疫保护作用研究

目的 研究不可分型流感嗜血杆菌(NTHi)重组外膜蛋白P6的理化性质和对小鼠的免疫保护作用.方法 利用PCR技术,以NTHi基因组为模板,扩增出编码外膜蛋白P6的基因片段;构建pET-32a-P16重组质粒;转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,并对表达条件进行了优化.通过阴离子交换和凝胶过滤层析对蛋白进行纯化.经SDS-PAGE、Western blot等对蛋白的理化性质进行初步分析,继而免疫BALB/c小鼠,用同源菌经腹腔攻击,比较免疫组和对照组小鼠死亡率.结果 实现了该蛋白在大肠杆菌中的高效表达,产物表达形式为可溶性表达,纯化后蛋白纯度可达95%,收率可达5 mg/g(蛋白/湿菌),相对分子质量(M_r)为14 145.848,Western blot证实重组P6蛋白能与菌源提纯P6蛋白免疫小鼠后的抗血清发生特异性反应.动物实验结果表明重组P6蛋白在小鼠体内能诱生高滴度的抗体,显示免疫组小鼠存活率明显高于对照组(P<0.01).结论 重组NTHi外膜蛋白P6的原核表达产物为可溶性蛋白,在小鼠体内能诱生高效价抗体,在小鼠感染模型中具有保护作用,为NTHi疫苗的研发提供了基础资料.     

ctB和ure I双基因融合表达及其免疫特性分析

目的构建霍乱毒素B亚单位(CtB)和幽门螺杆菌尿素膜通道蛋白(UreI)融合的原核表达质粒pET32a( )ctB/ureI,并初步研究融合蛋白CtB/UreI的表达特性和免疫特性。方法PCR从pUC18ctB中克隆ctB基因,定向在pET32a( )/ureI的ureI基因5′端插入ctB基因,构建ctB和ureI双基因原核表达质粒pET32a( )ctB/ureI,转该质粒于E.coliBL-21(DE3),经酶切和序列分析鉴定工程菌。IPTG诱导表达,HP-His亲和层析纯化,SDS-PAGE和Gel-ProAnalizer4分析,重组蛋白免疫BALB/c小鼠。用Westernblot和ELISA分析重组蛋白的免疫特性。结果工程菌含完整的ctB和ureI基因,与相对应基因的序列同源性分别为100%。在22℃,1mmol/LIPTG诱导4h后,重组蛋白的表达占菌体总蛋白12%,亲和层析纯化后蛋白纯度为94.3%。Westernblot表明重组蛋白分别能与相应的抗体反应,该蛋白免疫小鼠后能产生相应的IgG抗体。结论成功构建了能表达CtB/UreI蛋白的大肠杆菌表达菌株。对融合蛋白表达和纯化后,初步证明了该重组蛋白有CtB和UreI的双特异反应原性和免疫原性,为研究新型幽门螺杆菌疫苗奠定了坚实的基础。     

表达结核分枝杆菌ESAT-6-Ag85A基因的侵入型乳酸菌免疫特性研究

目的:研究表达ESAT-6-Ag85A(ES85A)融合基因的侵入型乳酸菌对小鼠体内免疫特性的影响。方法:将真核表达载体p Valac与ES85A连接构建真核表达质粒,并将其分别电转到重组乳酸菌NC8-pSIP-409和NC8-pSIP-409-FnBPA感受态中,构建双质粒的乳酸菌p Valac-ES85A/409和p Valac-ES85A/Fn BPA。将其免疫BALB/c小鼠,检测表达ES85A的侵入型乳酸菌对小鼠树突状细胞(DCs)亚群CD80和CD83的影响以及血清中细胞因子的表达水平。结果:Western blot和免疫荧光证明ES85A蛋白成功表达;与空载体组相比,在小鼠免疫表达ES85A的侵入型乳酸菌后,小鼠脾细胞中CD11~+CD80~+(P0. 001)和CD11~+CD83~+(P0. 01)以及血清中细胞因子IL-4(P0. 05)的表达都有所增加。结论:表达ES85A的侵入型乳酸菌能促进小鼠体内DCs的分化和成熟以及提高血清中细胞因子IL-4的表达,为后期研制抗结核分枝杆菌的DNA疫苗制剂奠定了基础。     

雷公藤内酯醇(T10)通过抑制脊髓内胶质细胞的激活改善大鼠CFA诱导的炎性痛的机制研究

目的:观察腹腔注射雷公藤内酯醇(Triptolide,T10)对完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant,CFA)诱导的大鼠慢性炎性痛行为的改善作用并探讨其机制。方法:SD大鼠随机分为四组,即Saline+Veh组、Saline+T10组、CFA+Veh组和CFA+T10组。后两组大鼠于右侧足底注射CFA制备大鼠慢性炎性痛模型,前两组则在相同部位注射生理盐水。第二组和第四组大鼠分别于造模前1 h给予T10腹腔注射,随后每12 h给予腹腔注射药物1次,持续用药7 d;第一组和第三组则以相同方式给予100 ml/kg的生理盐水作为对照。采用辐射热法和机械刺激法连续观察给药后大鼠的痛行为;应用免疫组织化学染色和Western Blot方法观察连续给予T10 3d和7 d后大鼠腰膨大平面脊髓背角内小胶质细胞和星形胶质细胞的活化程度;应用实时定量PCR(RT-PCR)方法观察连续给药7 d后大鼠腰5背根神经节内炎性因子,如白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-1β(interleukin-1 beta,IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(tumour necrosis factor-α,TNF-α)的表达变化。结果:(1)与CFA+Veh组相比,CFA+T10组大鼠机械缩足阈值及辐射热痛潜伏期显著下降(P0.05),并持续到造模成功后7 d,表明腹腔注射T10可以明显改善CFA诱导的大鼠机械痛敏和辐射热痛敏。(2)免疫组织化学染色和Western Blot结果显示:造模后3 d和7 d后CFA+Veh组大鼠脊髓背角出现大量CFA诱导活化的小胶质细胞和星形胶质细胞;小胶质细胞标记物IBa-1和星形胶质细胞标记物GFAP的表达量分别在CFA造模后3 d和7 d显著增高(P0.05),而给予T10 3 d和7 d后炎性痛大鼠腰膨大平面IBa-1和GFAP的活化程度均显著减轻(P0.05)。(3)RT-PCR结果显示:与Saline+Veh组相比,CFA造模7 d后腰5背根神经节内炎性因子IL-1β、IL-6 mRNA和TNF-αmRNA的表达显著增高(P0.05),腹腔注射T10 7 d后上述炎性因子的表达则显著降低(P0.05)。结论:腹腔注射T10可以显著改善CFA诱导的大鼠慢性炎性痛,其机制可能与抑制脊髓背角小胶质细胞和星形胶质细胞的活化以及炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的合成有关。     

N-甲基-D-天冬氨酸受体/MAPK/环磷腺苷效应元件结合蛋白通路在前扣带皮层介导痛相关情绪

目的 探讨N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体/MAPK/环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)通路参与前扣带皮层介导痛相关情绪的机制。方法 选取健康SD大鼠共42只，随机分为空白对照组(Ctrl)、脚掌注射生理盐水(NS)组、脚掌注射完全弗氏佐剂(CFA)模型组(CFA)、脚掌注射CFA及前扣带皮层吻侧部(rACC)中注射NS组(CFA+NS)、脚掌注射NS及rACC中注射NS组(NS+NS)、脚掌注射CFA及rACC内注射NMDA受体拮抗剂(APⅤ)组(CFA+APⅤ)、脚掌注射NS及rACC内注射APⅤ组(NS+APⅤ),每组n=6只。分析大鼠回避分数及观察大鼠热缩足潜伏期(PWL),采用免疫组织化学染色检测脑rACC区NMDA受体表达；免疫荧光染色检测脑rACC区NMDA受体、磷酸化ERK(p-ERK)、磷酸化CREB(p-CREB)表达；尼氏染色观察脑rACC区尼氏小体数量；Western blotting检测rACC区NMDA受体、MAPK、CREB、ERK、p-ERK、p-CREB、突触小体相关蛋白25的相互作用蛋白30(SIP30)蛋白表达；Real-time PCR检...     

草原兔尾鼠卵透明带3DNA疫苗pVAX1-sig-LTB-lZP3-C3d3的构建表达及其免疫不育的研究

目的:构建草原兔尾鼠卵透明带3 DNA疫苗pVAX1-sig-LTB-lZP3-C3d3进行小鼠的黏膜免疫,增强该疫苗的免疫不育效果。方法:将两种佐剂分子大肠杆菌不耐热肠毒素B亚基和C3d基因通过酶切鉴定,构建重组质粒pVAX1-sig-LTB-lZP3-C3d3,采用RT-PCR和W estern b lot技术,检测其在mRNA和蛋白水平的表达,并通过肌肉注射、滴鼻和灌服3种途径免疫雌性C57BL/6小鼠,通过ELISA检测抗体水平及分型。结果:酶切鉴定,RT-PCR和W estern b lot结果表明重组质粒构建正确并可在mRNA和蛋白水平的表达,ELISA结果表明以重组质粒pVAX1-sig-LTB-lZP3-C3d3免疫诱导的特异性IgG、IgA的水平明显高于对照组(P<0.01)。抗生育实验表明该疫苗免疫的小鼠平均生仔数与对照组相比差异极显著(P<0.01)。结论:构建的草原兔尾鼠卵透明带3DNA疫苗重组质粒pVAX1-sig-LTB-lZP3-C3d3可高效地激发小鼠特异性免疫应答,提高抗生育的效果。     

小鼠骨髓树突状细胞pcDNA3-hCEA转染疫苗的抗瘤作用

目的:将pcDNA3-hCEA转染小鼠骨髓树突状细胞 (DCs),观察其诱导BALB/c小鼠对CT2 6(hCEA⁺)的抗肿瘤免疫效应。方法:采用rmGM-CSF和rmIL-4体外诱导培养小鼠骨髓DCs;构建真核表达质粒pcDNA3-hCEA;并用lipofectamine将其转染DCs,制备DCs(pCDNA3-hCEA)疫苗;同时制备CT2 6(hCEA⁺);采用RT-PCR检测DCs(pCDNA3-hCEA)中CEAmRNA的表达,采用放射免疫法检测DCs(pCDNA3-hCEA)培养上清中CEA的含量;使用DCs(pCDNA3-hCEA)疫苗体外诱导小鼠同种异体T淋巴细胞靶向性杀伤。采用DCs(pcDNA3-hCEA)疫苗预防免疫BALB/c小鼠,观察其对于荷临界致瘤量CT2 6(hCEA⁺)小鼠的抗肿瘤效应。结果:经G₄₁₈筛选,DCs(pCDNA3-hCEA)有14 %的获得率;RT-PCR检测表明DCs(pCDNA3-hCEA)内CEAmRNA呈阳性表达;放射免疫法检测表明DCs(pCDNA3-hCEA)能微量表达人CEA;DCs(pCDNA3-hCEA)能够有效诱导CEA靶向免疫杀伤。DCs(pcDNA3-hCEA)疫苗延长荷CT2 6(hCEA⁺)瘤小鼠生存期1周至 4周。结论:编码肿瘤抗原基因的真核表达质粒转染的树突状细胞,能够诱导较强的特异性抗肿瘤免疫效应.     

优化密码促进HPV 6b E7蛋白表达及DNA疫苗诱导的细胞免疫反应

目的：探讨优化密码对人乳头瘤病毒6b型（HPV 6b）基因表达及免疫原性的影响，为治疗性DNA疫苗的研究奠定基础。方法：设计合成含优化密码及pRB结合位点突变的HPV 6bE7(humE7）全长基因。测序验证无误后，定向克隆于pcDNA3的Kpn I和EcoR I位点，成功构建真核表达质粒pcDNA3-hu-mE7。体外转染COS－1细胞，免疫荧光检测其E7蛋白表达。C57BL／6小鼠胫前肌内接种裸DNA，观察其诱导的细胞免疫反应。结果：pcDNA3-hu-mE7在COS－1细胞获得明显表达，表达产物主要位于细胞核中。DNA免疫结果显示，与含有野生型E7基因的表达质粒pcDNA3-wtE7比较，pcDNA3-hu-mE7免疫小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ产生明显升高，CD8^ 和CD4^ 淋巴细胞活性增强。结论：优化密码能促进HPV 6b E7蛋白表达及DNA疫苗诱导的细胞免疫反应。     

炎性痛致大鼠脊髓后角ProBDNF及其受体的表达变化

目的:探讨完全弗氏佐剂(complete Freund’s Adjuvant,CFA)致炎性疼痛后大鼠脊髓后角内ProBDNF及受体P75NTR和Sortilin的表达变化及意义。方法:大鼠随机分为正常组和实验组,实验组大鼠左侧足底皮下注射CFA和生理盐水混合溶剂100μl,建立炎性疼痛模型,实验组包括注射CFA后6 h、1、3、7和14 d组。采用Von Frey纤维测定不同时间点大鼠机械缩足阈值(pawwithdrawal threshold,PWT)的变化;采用免疫组织化学方法检测ProBDNF及P75NTR、Sortilin在脊髓后角的表达变化。结果:足底注射CFA后1 h PWT即下降,并在6 h后达到最低值,3 d后逐渐上调,至14 d仍低于基础值。ProBDNF在正常脊髓后角可见阳性表达;注射CFA后1 d注射侧脊髓后角较对侧其ProBDNF的表达明显上调,上调持续到7 d左右,至14 d逐渐恢复。正常大鼠脊髓后角P75NTR有较弱表达,主要集中在后角I、II层纤维;注射CFA后6 h开始,注射侧脊髓后角内P75NTR的表达明显上调,III-V层的阳性产物也逐渐增加,这种上调持续到7 d左右达高峰,至14 d逐渐下降。Sortilin在正常脊髓后角浅层仅有较弱阳性产物表达,注射CFA后不同时间点脊髓后角Sortilin的表达无明显差异。结论:CFA能诱导大鼠产生为期2周以上的炎性痛病程;脊髓后角ProBDNF和P75NTR的表达上调可能与炎性疼痛中外周痛觉信号的传导和中枢敏化有关。     

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌IsdB活性片段的克隆、表达及抗原免疫保护性初步研究

目的探讨耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)抗原IsdB活性片段(IsdB2)免疫保护作用。方法利用生物信息学技术预测分析出IsdB活性片段(IsdB2),PCR扩增编码IsdB2的基因片段,亚克隆至GST标签融合表达的原核表达载体pGEX-6P-2中,将载体转化入大肠杆菌XL-1 blue,通过IPTG诱导表达IsdB2/GST融合蛋白,利用GST亲和层析初步纯化获取IsdB2蛋白。用IsdB2蛋白抗原辅以氢氧化铝佐剂对小鼠进行免疫实验,统计小鼠存活率对IsdB2抗原的免疫性进行初步研究。结果重组质粒经过BamHⅠ和NotⅠ双酶切鉴定、核酸序列测定和IPTG诱导表达IsdB2/GST及酶切获取IsdB2蛋白的SDS-PAGE分析表明,IsdB2蛋白相对分子质量大小约72 000,GST标签相对分子质量大小约26 000,与预期相符合。用IsdB2蛋白对小鼠进行3次疫苗免疫实验,IsdB2对小鼠的保护率分别为84.6%、50%和60%。结论成功构建重组表达载体pGEX-6P-2-IsdB2,利用大肠杆菌表达系统、GST亲和层析和酶切方法获得IsdB2蛋白抗原,通过3次动物疫苗免疫实验结果表明IsdB2具有免疫保护性,为研制新型有效的MRSA疫苗奠定实验基础。