特定序列寡核苷酸对人骨髓间充质干细胞体外扩增及成骨分化的影响

目的探讨特定序列人工合成的寡核苷酸（Oligodeoxynucleotide,ODN）MT01对人骨髓间充质干细胞（Human bone marrow mesenehymal stem cells．hBMSCs）增殖及成骨分化的影响。方法采用Ficoll梯度密度离心法分离培养hBMSCs并进行鉴定。以1μg／mL的ODN MT01处理hBMSCs,细胞计数试剂盒检测细胞增殖情况,碱性磷酸酶试剂盒检测成骨分化情况。结果经1μg／mL的ODN MT01处理的hBMSCs体外培养,第3、4、5、6、7天hBMSCs增殖明显;成骨诱导的第4、14、21天．碱性磷酸酶表达明显增加。结论特定浓度人工合成ODN MT01能够在体外促进hBMSCs的扩增及成骨分化。     

Wnt3 a信号分子对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化 过程中端粒酶活性的影响

目的探索Wnt3a信号分子对体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化过程中端粒酶活性的影响。方法采用密度梯度离心联合贴壁筛选法分离培养SD大鼠股骨骨髓间充质干细胞。传代后通过形态学和流式细胞学检测细胞表面标志物CD29、CD44、CD45,筛选并鉴定细胞。采用成骨诱导培养基联合不同浓度的wnt3a(5 ng/mL、25 ng/mL、100 ng/mL)诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化,以碱性磷酸酶活性检测评价其成骨分化能力。通过TRAP-ELISA端粒酶活性检测法检测在不同浓度的wnt3a干预下诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中端粒酶活性的表达。结果骨髓间充质干细胞传至第3代后可获得均一性较高的细胞,流式细胞学检测细胞表面标志物CD29、CD44高表达,CD45低表达。成骨诱导培养基联合不同浓度的wnt3a诱导大鼠BMSCs 7 d后,碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)活性检测结果:与普通成骨诱导培养基相比,含有5 ng/mL及25 ng/mL wnt3a的成骨诱导培养基可显著增加其碱性磷酸酶(ALP)活性(P0.05),而含有100 ng/mL wnt3a的成骨诱导培养基则明显抑制其碱性磷酸酶(ALP)活性(P0.05)。与普通成骨诱导培养基相比,联合诱导培养基诱导骨髓间充质干细胞成骨分化过程中,端粒酶活性的改变无明显的统计学差异。结论小剂量(5 ng/mL、25 ng/mL)的wnt3a分子能够促进体外培养的骨髓间充质干细胞成骨分化,而大剂量(100 ng/mL)的wnt3a分子则抑制其成骨分化。骨髓间充质干细胞具有较弱的端粒酶活性,成骨分化过程中其活性逐渐减弱,直至消失;wnt3a信号分子刺激并不能有效激活其端粒酶活性。     

诱导小鼠骨髓间充质干细胞向雄性生殖细胞的定向分化

目的探讨小鼠骨髓间充质干细胞是否能够在体外被诱导发生向雄性生殖细胞方向的分化。方法从雄性小鼠骨髓中分离能够长期贴壁生长的细胞,并鉴定其是否为间充质干细胞。对分离的细胞进行生殖细胞特异性报告基因标记(stra-8-GFP)。采用视黄酸诱导标记的细胞发生向生殖细胞方向的分化。通过观察报告基因表达和生殖细胞相关基因mRNA表达情况确定是否发生了分化。结果从小鼠骨髓中分离到的贴壁生长的细胞表达间充质干细胞的表面标志CD90、CD44、CD105和Sca-1;细胞在体外可以被诱导分化为成骨、成软骨及成脂肪细胞。报告基因标记的间充质干细胞在被视黄酸诱导2d后开始表达绿色荧光蛋白和生殖细胞相关基因Mvh、Fragilis和Stella的mRNA。未经视黄酸诱导的细胞不表达绿色荧光蛋白和生殖细胞相关基因。结论小鼠骨髓间充质干细胞在体外可以被视黄酸诱导发生向雄性生殖细胞方向的分化。     

大鼠牙髓干细胞与骨髓间充质干细胞分化成骨样细胞能力对比研究

目的：以骨髓间充质干细胞作为参考,讨论牙髓干细胞作为骨组织修复种子细胞的可行性。方法：通过酶消化法获得大鼠牙髓干细胞,离心法获得骨髓间充质干细胞,贴壁培养,通过倒置光学显微镜观察二者形态差异;流式细胞技术鉴定骨髓间充质干细胞的间质细胞表面标志物表达;MMT法检测细胞生长曲线;特定的成骨诱导液诱导干细胞成骨分化,免疫荧光法检测成骨细胞表面标志物表达。结果：分离的大鼠骨髓间充质干细胞与牙髓干细胞形态学以及生长特性具有相似性,且符合间充质干细胞特性,牙髓干细胞第4天进入对数生长期,第7天进入平台期,骨髓间充质干细胞第4天进入对数生长期,第8天进入平台期;经过成骨诱导后二者都具备成骨样细胞分化能力,牙髓干细胞在成骨诱导后的骨钙素表达上与骨髓间充质细胞有着相似的能力;牙本质泌涎蛋白表达阳性。结论：牙髓干细胞具有与骨髓间充质干细胞都具有成骨分化能力,但牙髓干细胞细胞成分相对复杂,增殖能力较强。     

5-氮杂胞苷和地塞米松对大鼠骨髓间充质干细胞分化作用的实验研究

[目的]探究5-氮杂胞苷和地塞米松对大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成骨分化能力的影响。[方法]SD大鼠骨髓间充质干细胞体外扩增和传代培养,流式细胞术鉴定细胞表面标志,取3代细胞随机分为空白组、激素组、激素+5-氮杂胞苷组,相应药物干预3 d后成骨诱导分化14 d,RT-PCR和Western blot检测Runx2和PPARγ的表达。[结果]所取得骨髓间充质干细胞纯度和均一性好,细胞表面标记CD90高表达,CD34、CD45低表达。第3代细胞经药物干预和成骨诱导后,与空白组相比,激素组Runx2基因表达降低,PPARγ基因升高,5-氮杂胞苷+激素组结果与激素组相反(P<0.05)。[结论]激素能抑制骨髓间充质干细胞成骨分化,促进成脂分化,5-氮杂胞苷能干预激素的这种作用,提高骨髓间充质干细胞分化潜能。     

人骨髓间充质干细胞分离培养及体外诱导分化为成骨细胞

[目的]建立人骨髓来源的间充质干细胞( hBMSCs)分离、培养及传代的方法,观察成hBMSCs体外成骨潜能.[方法]采用全骨髓贴壁筛选法分离培养hBMSCs,流式细胞仪检测细胞表型;所得细胞第3代用含100 nmol/L地塞米松、5mmol/Lβ -甘油磷酸钠,50 μg/ml抗坏血酸的条件培养基进行骨诱导,茜素红染色鉴定.[结果]分离培养的细胞流式细胞术检测显示CD44、CD105阳性,而CD34、CD45阴性,符合MSCs特征;hBMSCs经骨诱导后可形成钙结节,茜素红染色显示阳性.[结论]全骨髓贴壁筛选法可分离获得高纯度的hBMSCs,其在体外具有成骨潜能.     

DKK1在大鼠骨髓间充质干细胞成骨、成脂分化早期的差异性表达

目的：分析DKK1在大鼠骨髓间充质干细胞成脂、成骨分化早期的表达,探讨其调节机制。方法 Real－time PCR检测骨髓间充质干细胞在成脂、成骨诱导培养早期DKK1基因表达的水平;检测激素处理骨髓间充质干细胞DKK1基因的表达水平。结果成脂组与正常对照组,在成脂诱导6、12、24、48时DKK1基因表达水平较对照组增高,差异有统计学意义, P＜0．01。成骨组与正常对照组,0．5、6两个时间点DKK1基因表达量较对照组明显降低,差异有统计学意义,P＜0．05。骨髓间充质干细胞激素处理3、6、12、24时检测,结果显示激素作用下,骨髓间充质干细胞DKK1表达明显增加,差异有统计学意义,P＜0．05。结论 DKK1在骨髓间充质干细胞成脂、成骨分化早期可能起重要的调节作用,激素可能通过调节DKK1的表达而发挥调节成脂、成骨分化的作用。     

人小涎腺成纤维样单克隆细胞的成骨分化

目的：探索人小涎腺成纤维样单克隆细胞的体外培养、扩增方法,鉴定其性质,研究向成骨细胞分化的潜能。方法：组织块贴壁法原代培养人小涎腺细胞,收集成纤维样细胞,用96孔板稀释铺板法克隆培养,免疫荧光和RT-PCR检测细胞表型,并进行成骨诱导分化,通过骨钙素、一型胶原免疫细胞化学染色及碱性磷酸酶、茜素红钙结节染色鉴定成骨分化。结果：成功的在体外扩增培养出人小涎腺成纤维样单克隆细胞,免疫荧光证实细胞表达CD13、CD29、CD106和CD44,RT-PCR显示CK18、α-SMA、vimentin、CD106、nestin基因表达与人骨髓间充质干细胞相似。成骨诱导8天后,碱性磷酸酶表达阳性率100%,19天后骨钙素和一型胶原大量表达,并形成钙结节。结论：所建立的分离培养体系能够获得大量人小涎腺成纤维样单克隆细胞,免疫表型类似于间充质干细胞。在成骨诱导培养条件下具有良好的向成骨细胞分化的潜能。     

脐血间充质干细胞的分离培养鉴定及诱导分化研究

目的：分离培养人脐血间充质干细胞（human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells,hUCB-MSC）,体外观察其生长特性,并在特定条件下诱导分化,探讨其成脂成骨分化能力.方法：采用沉降法和密度梯度离心结合贴壁培养法自脐血中分离间充质干细胞,倒置显微镜下观察其形态及生长情况;流式细胞仪分析细胞周期并检测细胞表面标志物;用茜素红染色和油红0染色分别鉴定其成骨成脂分化能力.结果：纯化的hUCB-MSC贴壁生长,呈均一梭形,具有较强的增值能力,流式细胞仪分析P3代hUCB-MSC稳定表达间充质干细胞表面抗原标志CD73,CD105和CD90等,不表达造血标志CD34和CD45;成骨诱导后3周后细胞茜素红染色阳性;成脂诱导3周后细胞油红0染色阳性.结论：本实验分离的hUCB-MSC具有较强的增殖能力,表达间充质干细胞的表面标记,具有成骨成脂分化潜能.     

大鼠椎间盘巢源性干细胞的体外分离、培养和特性鉴定

目的:对大鼠椎间盘干细胞巢来源的干细胞(ISN-SCs)进行体外分离、培养和特性鉴定。方法:以10周龄雄性SD大鼠作为研究对象,按照解剖区域分离椎间盘干细胞巢组织(骺板外周软骨膜部分),用Ⅱ型胶原酶消化获取细胞后进行体外培养,选用第四代细胞进行干细胞相关特性的鉴定:采用流式细胞技术测定细胞周期;MTT法测定增殖曲线;流式细胞技术检测干细胞相关表型;q PCR检测干细胞相关基因的表达水平;细胞三系诱导分化培养后采用茜素红染色及钙钴染色检测成骨分化能力,阿利新蓝染色检测成软骨分化能力,油红O染色检测成脂肪分化能力,q PCR检测多向分化相关基因的表达水平。结果:大鼠ISN-SCs呈成纤维样细胞,多触角,具有贴壁能力,是一种慢周期细胞,高表达干细胞相关阳性表面抗原分子CD29、CD90、CD44,低表达干细胞相关阴性表面抗原分子CD34、CD45、CD19、CD11b;成骨诱导分化后茜素红染色和钙钴染色均为阳性,成软骨分化后阿利新蓝染色阳性,成脂肪分化后油红O染色阳性,且各分化相关基因(成骨:Runx2、OPN、OCN;成软骨:SOX-9、COL2a1、ACAN;成脂肪:PPARγ、C/EBPα)表达水平较对照组显著增高,其与骨髓间充质干细胞(BMSCs)具有相似的干细胞相关基因(NANOG、SOX-2、OCT-4)表达水平。结论:ISN-SCs具备干细胞的生物学特性,在体外经诱导后可以向软骨细胞及脂肪细胞转化,可为椎间盘的自体生物学修复研究提供良好的细胞来源。     

人羊水来源c-kit~+间充质干细胞的生物学特征和心肌诱导分化

目的探讨人羊水来源c-kit~+间充质干细胞(c-kit~+human amniotic fluid-derived mesenchymal stemcells,c-kit~+HAFMSCs)的生物学特征及心肌诱导分化能力。方法通过产前诊断或自愿引产获取50份孕中期羊水标本,经流式细胞仪分选c-kit~+HAFMSCs,MTT法观察细胞增殖情况,并通过流式细胞仪、细胞免疫化学染色观察行细胞表型鉴定。在体外经成骨及成脂诱导分化,于诱导培养后21 d采用yon Kossa染色观察钙沉积颗粒,油红O染色观察脂滴形成情况。实时荧光定量PCR检测细胞经5氮-2’脱氧胞苷心肌诱导前后,NKx2.5、Tbx5、GATA-4、α-MHC 4种心肌特异性基因表达情况。结果经流式细胞仪分选,人孕中期羊水中c-kit~+HAFMSCs含量约为贴壁细胞的3.07%±1.03%;体外增殖迅速,表达MSCs表面标志CD29、CD44、CD73、CD90、CD105,不表达造血干细胞表面标志CD34、CD45;农达人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)-ABC,不表达HLA-DR。细胞免疫化学染色示CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、Oct-4染色呈阳性,CD34、CD45染色呈阴性。MTT检测示第5、10、15代c-kit~+HAFMSCs具有相似的生长曲线。成骨和成脂诱导培养后21 d,细胞内有钙盐沉积和脂滴形成。实时荧光定量PCR检测示,心肌诱导后14 d,NKx2.5、Tbx5、GATA-4、α-MHC 4种心肌特异性基因表达均较诱导前明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论通过流式细胞仪分选的c-kit~+HAFMSCs在体外可以诱导分化为心肌样细胞,可能成为心肌再生性治疗的种子细胞。     

诱导hBMSCs成骨分化中微小RNA和靶基因表达水平的变化

目的明确萎缩性骨不连组织中表达上调的数种微小RNA(micro RNA,miRNA)与其相应靶基因mRNA、蛋白在hBMSCs成骨分化过程中的表达变化趋势和生物学功能。方法取自体髂骨植骨手术患者的髂骨骨髓血,采用密度梯度离心法分离培养hBMSCs。取第4代hBMSCs以成骨诱导培养液诱导成骨分化,分别提取0、12 h,1、2、4、7、14 d时的细胞总RNA和蛋白,进行miRNA的实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)、相应靶基因mRNA的qRT-PCR和蛋白Western blot检测。结果诱导hBMSCs成骨分化时,成骨性靶基因碱性磷酸酶(alkalinephosphatase liver/bone/kidney,ALPL)、PDGF-α多肽(PDGF-αpolypeptide,PDGF-A)和BMP-2的mRNA和蛋白表达在多数时间点同对照(0 h)相比增加(BMP-2在12 h和1 d时下降),1～7 d变化最为显著。不同时间点的miRNA、靶基因mRNA和蛋白表达水平存在差异,其中hsa-miRNA-149*和hsa-miRNA-654-5p miRNA含量的变化趋势与各自靶基因ALPL和BMP-2的mRNA及蛋白表达水平总体上成负相关(P<0.05),hsa-miRNA-221与其靶基因PDGF-A的变化趋势无明显负相关关系(P>0.05)。结论诱导hBMSCs成骨分化过程中,hsa-miRNA-149*和hsa-miRNA-654-5p对其相应靶基因ALPL和BMP-2的mRNA及蛋白存在密切调控关系。     

地塞米松对骨髓间充质细胞增殖及成骨、成脂分化的效应

目的 探讨不同浓度地塞米松(dexamethasone,DEX)作用不同时间对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的增殖及成骨、成脂分化的影响.方法 体外分离培养大鼠BMSCs,将状态良好的第三代细胞接种于96孔板中,随机分组为对照组(不加入DEX)及不同浓度(1 nmol/L、10 nmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L)DEX作用组,培养1、3、5、7、9 d后,分别用细胞增殖检测(CCK-8)法检测细胞增殖状况.将BMSCs接种于6孔板中,随机分为对照组及不同浓度(1 nmol/L、10 nmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L)DEX作用组,培养7、14 d后分别用荧光定量PCR方法检测成骨、成脂相关基因的表达,培养14 d后用Western blot检测成骨、成脂相关蛋白的表达.培养5 d后进行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色,培养14 d后进行油红"O"染色、茜素红染色.结果 较低浓度的DEX促进BMSCs增殖,而较高浓度DEX抑制BMSCs增殖.干预早期,较低浓度的DEX促进BMSCs成骨分化而高浓度DEX抑制其成骨分化;干预晚期,各浓度DEX均促进BMSCs成骨指标的表达,但是不能诱导BMSCs钙质沉积.DEX浓度依赖性地促进BMSCs成脂相关指标基因和蛋白的表达,并诱导BMSCs细胞内脂质沉积.结论 DEX可直接影响BMSCs增殖及向成骨、成脂方向分化,这种效应存在浓度和干预时间依赖性.     

正弦电磁场对高糖环境下大鼠骨髓间充质干细胞分化的影响

目的探讨正弦电磁场对高糖环境下大鼠BMSCs分化的影响,并探讨其中可能的分子机制。方法贴壁筛选法分离、培养大鼠BMSCs,将第三代细胞分为暴磁组、高糖组、高糖暴磁组及对照组。高糖组采用高糖培养基(葡萄糖浓度为15 mmol/L),电磁场组每天给予1 mT、50 Hz正弦电磁场刺激2 h。刺激21 d后采用茜素红染色、油红O染色观察各组在成骨和成脂分化上的差异,刺激7 d后Real-time PCR检测成骨/成脂相关基因Runx2、ALP、Id4、PPARγ、aP2的表达变化。结果暴磁组钙结节形成能力较对照组增强、成骨相关基因表达增高,高糖组形成脂滴能力增强、成脂相关基因表达增高,高糖暴磁组成骨和成脂基因表达均有增高,但前者更为明显。结论正弦电磁场对高糖环境下的大鼠骨髓间充质干细胞有促进成骨、间接抑制成脂分化的作用,其机制可能与通过上调关键分子Id4有关。     

脐血间充质干细胞的培养鉴定及成骨诱导后的免疫原性研究

目的通过观察体外培养人脐血间充质干细胞(Umbilical cord blood-mesenchymal stem cells,UCB-MSCs)并作诱导成骨分化,探讨其作为组织工程的骨种子细胞的可行性。方法体外分离培养UCB-MSCs,流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达及其变化规律;体外成骨诱导UCB-MSCs2周,采用Alizarin Red染色和钙离子半定量测定的方法评价细胞成骨活性。取P2代UCB-MSCs细胞,流式细胞仪检测加入IFN-γ前后的HLA-Ι、HLA-Ⅱ、CD40、CD80等分子的表达情况;流式细胞仪检测UCB-MSCs在成骨诱导分化前后HLA-Ι类分子、HLA-Ⅱ类分子的表达情况以观察成骨诱导分化的MSCs免疫抗原性的变化。结果第1、3、5代细胞的CD29、CD105和CD166均呈阳性表达,而造血细胞系的表面标记CD31、CD34和CD45则呈低表达,且随传代次数增加含量逐渐下降。UCB-MSCs成骨诱导2周后,Alizarin Red染色为阳性。对照组则无明显钙盐沉积。钙离子半定量的检测结果则表明,UCB-MSCs成骨诱导2周后的钙离子含量远高于未诱导组。流式细胞检测结果显示,人UCB-MSCs高表达HLA-Ι类分子,不表达HLA-Ⅱ类分子和CD40,CD80等共刺激分子;经IFN-γ刺激诱导后,HLA-Ι类分子的表达未发生改变,HLA-Ⅱ类分子呈阳性表达,而CD40和CD80的表达仍为阴性。人UCB-MSCs在成骨诱导分化前后HLA-Ι类分子均为阳性表达;而HLA-Ⅱ类分子在成骨分化前为阴性,诱导后阳性表达率增高。结论①UCB-MSCs能诱导分化为成骨细胞,有望成为较理想的组织工程骨种子细胞;②成骨分化使UCB-MSCs的免疫原性发生相应变化。     

BMSCs向心肌分化的基因表达谱分析

目的分析hBMSCs经5-氮杂胞苷(5-azacytidine,5-aza)诱导向心肌样细胞分化过程中基因表达谱的改变。方法取胸外科非血液病患者手术中废弃的肋骨骨髓分离培养hBMSCs,5-aza诱导第2代hBMSCs。取诱导前及诱导后的细胞,免疫细胞化学法检测α-actin、肌钙蛋白T(cardiac troponin T,cTnT)和连接蛋白43(connexin 43)表达,流式细胞仪检测cTnT阳性细胞百分率;利用人表达谱基因芯片技术筛选分化过程中的差异表达基因,对部分基因进行功能分类和分层聚类分析。结果 hBMSCs经5-aza诱导后,部分呈肌细胞样形态。免疫细胞化学染色检测示诱导前细胞α-actin、cTnT染色呈弱阳性,connexin 43染色呈阴性;诱导后3周细胞α-actin、cTnT、connexin 43染色均呈阳性。流式细胞仪检测示诱导前cTnT阳性细胞百分率为7.43%±0.02%,诱导后3周为49.64%±0.05%。分化过程中共检测到1 814个显著差异表达基因,对其中647个基因分层聚类,聚为5类,生物功能包括信号传导、细胞代谢、增殖分化、发育以及形态发生等。结论 hBMSCs经5-aza诱导向心肌样细胞分化过程受信号传导通路、转录基因、生长因子等多种因素在不同时间点上的共同调控。     

骨髓基质干细胞扩增体系研究

目的 比较三种不同培养体系对人骨髓基质干细胞(h BMSCs)增殖能力、表面标志和分化潜能的影响,探索h BMSCs适合的培养体系。方法 获取h BMSCs,分别用DMEM、DMEM+碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)和无动物组份的间充质干细胞培养基(Mesenchymal Stem Cell Medium-animal component free,MSCM-acf)进行培养,反复传代至第6代,分别计数每种培养体系每个代次的细胞得率。取第4~6代细胞,用流式细胞仪对细胞表面标志进行检测,同时对各组第6代细胞分别向成软骨、成脂和成骨方向进行诱导分化。结果 培养至第2代后,MSCM-acf培养体系细胞得率显著大于其他两组;流式细胞分析结果表明,MSCM-acf培养体系表面阳性标志CD73、CD90和CD105均大于99%,总的阴性标志表达小于2%,优于其他两组,尤其是DMEM+b FGF培养体系;三组均保留了多向分化潜能,添加b FGF的培养体系成软骨分化明显优于其他两组,MSCM-acf培养体系成脂和成骨分化优于其他两组。结论 MSCM-acf培养体系可以实现h BMSCs干性维持下的大量扩增,是h BMSCs较为理想的培养体系。