抗CD3单克隆抗体的制备,标记与鉴定

选用抗人Ｔ细胞ＣＤ３杂交瘤细胞产生的腹水，经系列免疫化学方法纯化和鉴定后，以异硫氰酸荧光素（ＦＩＴＣ）标记纯化之抗ＣＤ３单克隆抗体。将构建的荧光抗体与标准抗ＣＤ３单克隆抗体在流式细胞仪上分别对同一样本进行检测共２４例，ＣＤ３＋细胞分别是（６３８±４３）％和（６８２±４７）％，两者差异无显著性（Ｐ＞００５）。本文结果为进一步使国产抗ＣＤ系列单克隆抗体应用于流式细胞仪提供了基础     

鼠抗人CD3单克隆抗体免疫抑制机制探讨

目的探讨鼠抗人CD3单克隆抗体(OKT3)抗排斥作用机制.方法使用OKT3诱导人外周血淋巴细胞凋亡.使用电镜、DNA电泳及原位切口末端标记技术(TUNEL)检测凋亡,同时检测CD95的表达.结果电镜及DNA电泳发现OKT3处理组外周血淋巴细胞(PBL)发生凋亡.TUNEL检测发现处理组凋亡发生率39.8%,显著作者简介郑骏年(1966-),男,江苏徐州人,主治医师,硕士.高于对照组10.2%(P＜0.01).处理组PBLCD95表达率48.7%,显著高于对照组34.9%(P＜0.05).结论上调PBL表面CD95表达,诱导其凋亡是OKT3抗排斥作用的机制.     

应用人—鼠杂交瘤技术制备抗绿脓杆菌人单克隆抗体的初步研究

The fusion of peripheral B lymphocytes from human immunized with P. aeruginosa polyvalent vaccine and mouse myeloma cell line SP2/0 was successfully performed. The rate of fusion was 74%(71/96) and the positive rate of antibody was 19.7%. Two hybridoma cell lines (A3 and F8) secreting McAb against P. aeruginosa were obtained after three times cloning by limiting dilution. The human chromosomes together with mouse chromosomes were discovered in karyotype assay of the hybrids. A3 and F8McAbs were human IgG by class determination. These MrcAbs could recognize 43 kd and 36 kd MW specific components of P. aeruginosa antigen by enzyme linked immuno-transfer blot technique.     

CD3/CD19双特异性单克隆抗体的制备、鉴定及其再导向的研究

目的制备ＣＤ３／ＣＤ１９双特异性单克隆抗体（ＢｓＡｂ）并研究其生物学作用。方法采用杂交－杂交瘤技术制备ＢｓＡｂ，以双亚类ＥＬＩＳＡ和细胞结合试验确证ＢｓＡｂ的存在，再用５１Ｃｒ释放试验证实ＢｓＡｂ的再导向细胞毒效应。结果获得３株ＣＤ３／ＣＤ１９四源杂交瘤细胞，其中１株已成为稳定分泌ＣＤ３／ＣＤ１９ＢｓＡｂ的四源杂交瘤细胞株。细胞毒试验表明ＣＤ３／ＣＤ１９ＢｓＡｂ上清、ＣＤ３／ＣＤ１９纯化抗体以及ＣＤ３／ＣＤ１９化学交联ＢｓＡｂ都能增强ＣＤ３激活杀伤细胞（ＣＤ３ＡＫ细胞）对Ｎａｌｍ－６靶细胞的杀伤作用（Ｐ＜０．０５～０．００１）。结论ＣＤ３／ＣＤ１９ＢｓＡｂ具有显著的再导向激活Ｔ细胞杀伤特异肿瘤靶细胞的功能，提示该ＢｓＡｂ有临床应用的潜在价值。     

应用人—鼠杂交瘤技术制备抗绿脓杆菌人单克隆抗体的初步研究

作者用绿脓杆菌多价菌苗免疫的人外周血淋巴细胞与SP2/0小鼠骨髓癌细胞融合,一次成功。细胞融合率为74％,抗体阳性率为19.7％。经3次克隆化后共获得2株能稳定地分泌抗绿脓杆菌人单克隆抗体的杂交瘤细胞株A_3和F_3。核型分析可见人与小鼠的染色体共存。亚类检定均属人IgG,免疫印迹实验证明它们可识别绿脓杆菌抗原分子量为43kd和36kd的特异组分。     

抗人SOCS3单克隆抗体的制备及其生物学特性鉴定

目的 制备高效价的抗人SOCS3单克隆抗体并对其生物学特性进行鉴定.方法 以重组GST-SOCS3融合蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与Sp2/0细胞融合,经多次筛选及克隆化,建立可稳定分泌抗SOCS3单克隆抗体的杂交瘤细胞株.用ELISA及Western blot鉴定单克隆抗体的特性,并测定其效价、Ig亚类及相对亲和力.结果 筛选到一株可稳定分泌抗人SOCS3单克隆抗体的杂交瘤细胞株.Western blotting显示在相对分子质量为6.3×104处出现特异性反应带.杂交瘤细胞培养上清效价为1:640,腹水效价为1:25600,Ig亚类为IgG2a,相对亲和力达4.84×106 L/mol.结论 成功制备能特异性识别人SOCS3的单克隆抗体,为进一步研究人体细胞因子信号传导的负反馈调节及SOCS3在微生物感染中的免疫调节作用奠定了基础.     

抗人甲胎蛋白单克隆抗体的制备及其特性研究

本文采用亲和层析法纯化的甲胎蛋白（ＡＦＰ）抗原免疫的ＢＡＬＢ／ｃ鼠脾细胞与ＳＰ２／０小鼠骨髓瘤细胞系融合，获三株分泌抗人ＡＦＰ单克隆抗体（ＭｃＡｂ）的杂交瘤细胞系。用ＥＬＩＳＡ阻断试验和夹心ＥＬＩＳＡ试验作特异性鉴定，杂交瘤细胞株染色体的众数为１０４条，三株细胞系ＭｃＡｂ均属小鼠ＩｇＧ１型。经体外连续传代３个月及冻存一年复苏后均能持续分泌抗ＡＦＰ抗体。     

鼠抗人CD3T淋巴细胞单克隆抗体治疗再生障碍性贫血免疫调节作用的临床观察

目的探讨特异性细胞免疫抑制剂鼠抗人CD3T淋巴细胞单克隆抗体(CD3单抗)治疗再生障碍性贫血(再障,AA)的机制及疗效.方法22例AA患者中位年龄26岁,其中重型再障(SAA)15例,慢性再障(CAA)7例.既往未经特殊治疗12例,既往治疗无效的10例中,已加用环孢素(CsA)≥3个月7例.CD3单抗给药方法5 mg静脉滴注,每天1次,连用10d为1疗程.采用APAAP法测定T细胞表面抗原的表达;应用ELISA法测定外周血单个核细胞培养上清中细胞因子的含量.结果随访3～22个月,有17例骨髓象明显好转,外周血白细胞平均升高1.61×109/L,中性粒细胞升高0.77×109/L,血红蛋白升高42g/L,血小板升高45×109/L(P均＜0.01).其中,6例基本治愈,7例缓解,4例明显进步,总有效率为77.27%,5例无效;T淋巴细胞亚群的变化CD4/CD8比值由1.20±0.41上升至1.44±0.39、HLA-DR的表达率由(32.1±14.7)%下降至(14.6±5.3)%(P均＜0.01);体外培养患者外周血单个核细胞分泌下列淋巴因子含量的中位数值(U/ml)肿瘤坏死因子α(TNFα)、干扰素γ(IFNγ)与白细胞介素-2(IL-2)分别由252、796和94降至146、524和48(P均＜0.01).不良反应单抗治疗期间,全部病例均发热,6例出现胸闷、呼吸困难,但治疗期间无1例死亡.结论与其他常用的免疫抑制剂相比,CD3单抗治疗AA疗效快、有效率高且安全性较好,其免疫调节作用特异性强.     

直标鼠抗人CD14单克隆抗体2F9-FITC的研制及鉴定

目的:研制异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的直标单克隆抗体2F9-FITC,用于白血病的免疫分型诊断.方法:2F9杂交瘤细胞的亚克隆,2F9腹水的制备、纯化、纯度鉴定按照常规方法进行;参考改良Marsshall氏法,制备FITC标记的2F9-FITC单抗;通过流式细胞术鉴定单抗亚型,比较2F9-FITC和标准CD14-FITC在不同类型白血病细胞上的表达情况.结果:制备了大量高纯度的IgG1κ亚型2F9单抗,成功研制了直标单抗2F9-FITC,A495/A280比值为0.44;2F9-FITC与CD14-FITC在单核细胞上反应的阳性细胞百分数分别为84.50%及90.08%,而在淋巴细胞仅为0.52%和1.01%;2F9-FITC与标准CD14-FITC在各类白血病细胞上的阳性细胞百分数的差异不显著(n=23,t=0.922,P=0.367).结论:研制的2F9-FITC能够替代进口的同类高质量单抗试剂,用于单核细胞相关性白血病的免疫诊断.     

人去唾液酸糖蛋白受体单克隆抗体制备及其初步应用

目的 制备人去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的小鼠单克隆抗体,并应用该抗体检测ASGPR在细胞系和组织中的表达。方法 对ASGPR H1大亚基进行序列分析,选取ASGPR1全长序列制备免疫原。通过RT-PCR合成ASGPR1 cDNA,构建ASGPR1表达重组载体,在E. coli BL21中表达后纯化,获得目的抗原。应用传统融合杂交瘤技术制备小鼠单克隆抗体,常规检测单抗亚类和效价,竞争抑制实验鉴定单抗特异性。用流式细胞术和免疫组织化学法分别检测ASGPR在多种肝源性与非肝源性细胞系以及多种肝组织中的表达。结果 制备的单克隆抗体亚型为IgG1,效价达112 800。竞争抑制实验结果显示该单抗具有很好的ASGPR结合特异性,而且识别的肽段位于ASGPR胞外段。流式细胞术检测结果显示,ASGPR不同程度地表达于肝源性细胞系,但不表达于非肝源性细胞系。免疫组织化学检测结果显示,ASGPR专一性表达于正常肝组织和肝癌组织,在肝癌组织的表达与分化程度有关,高分化肝癌中的阳性率高于低分化肝癌(75.0% vs 28.6%,P<0.05)。结论 成功制备高特异性人ASGPR小鼠单克隆抗体,适用于用流式细胞术和免疫组织化学法检测ASGPR表达,可用于临床病理鉴定原发性肝癌与转移性肝癌。     

CD28单抗对CD3-AK细胞增殖作用和杀伤效果

目的探讨CD28单抗对细胞增殖效果及细胞毒作用,分析CD28单抗对CD3-AK肿瘤杀伤活性的调节作用。方法制备CD28单克隆抗体,诱导CD3-AK细胞,用倒置显微镜观察细胞数量和形态,用MTT法测定CD3-AK细胞对骨髓瘤细胞的抑制率。结果CD3-AK细胞加入CD28单抗,细胞数量明显增多（t=10.6,P〈0.05）;对肿瘤细胞的杀伤活性明显增高。结论CD28单抗与CD3单抗联合,具有较强的协同作用,能有效提高CD3-AK的肿瘤杀伤活性。     

原发性干燥综合征患者T细胞亚群及CD4~+CD25~+ T细胞检测的意义

目的探讨T淋巴细胞亚群及CD4+CD25+T细胞在原发性干燥综合征(PSS)患者中的检测意义。方法用流式细胞仪检测18例PSS患者以及20例健康体检者外周血CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、NK细胞(CD3-/CD16+56+)、CD3+CD4-CD8-双阴性T细胞及CD4+CD25+调节T细胞水平。结果 PSS患者与正常对照组比较,CD3+CD4+细胞亚群的百分率明显升高(P<0.05);CD4+/CD8+与对照组比较有明显升高(P<0.05);CD3+CD4-CD8-双阴性T细胞及CD4+CD25+调节性T细胞的百分率明显降低(P<0.01),其它T细胞亚群无明显变化。结论 PSS患者T淋巴细胞亚群的水平是异常的。T细胞亚群的比例异常与疾病的病程和临床表现相关联。CD3+CD4-CD8-和CD4+CD25+调节性T细胞水平降低导致机体自身免疫反应抑制功能减弱,免疫耐受状态被打破,可能是引发PSS发生发展的重要因素。     

不同组合 CD3、CD28抗体对 CIK 细胞诱导培养的探索研究

目的：探索利用CD3、CD28抗体对人外周血单个核细胞(PBMC)体外激活转化增强作用,采用不同包被方法及抗体浓度,以期获得一种更有效的包被方法。方法利用人外周血单个核细胞分离技术、体外细胞培养技术及流式细胞术(FMC),以 CD3抗体固相包被、CD28抗体不同浓度固相包被或悬浮加入,计算经12 d 培养获得成熟 CIK 细胞的数量,测定不同包被方法刺激培养后的细胞表型的变化。结果培养后 C 组中 CD4+细胞百分比明显低于 A 组,差异有统计学意义(P <0.05)。C 组中CD8+细胞所占比例高于 A、B 组(P <0.05)。C 组的 T4/T8比值与 A、B 组差异有统计学意义(P <0.05)。B 组 NK 细胞含量与C 组差异有统计学意义(P <0.05)。CD25+细胞在 C 组中所占比例低于 A 组(P <0.01)。结论CD3抗体固相包被及 CD28抗体悬浮加入组合对人外周血细胞的刺激增强作用强于 CD3抗体固相包被 CD28+抗体固相包被组合。     

抗前列腺特异抗原/抗CD3双特异性单链抗体四聚体的活性研究

目的:研究抗前列腺特异抗原(PSA)/抗CD3双特异性单链抗体四聚体的生物活性.方法:利用流式细胞仪和51Cr释放试验评价双特异性单链抗体四聚体的抗原亲和活性和体外介导杀伤靶细胞的效果. 利用裸鼠前列腺癌模型分析其在体内介导细胞毒T淋巴细胞对肿瘤细胞杀伤的能力.结果:抗PSA/抗CD3双特异性单链抗体四聚体可以特异性结合表达前列腺癌细胞和CD3阳性的淋巴瘤细胞,阳性结合率分别为70.4%和81%. 在体外,有细胞毒T淋巴细胞存在时该四聚体可引起前列腺癌细胞的裂解,在抗体浓度固定组和效应细胞/靶细胞比例固定组,靶细胞裂解率分别随着效应细胞/靶细胞比例和抗体浓度的增加而增加,最高裂解率分别可以达到(80.3±5.2)%和(78.6±5.5)%. 与对照组比较,接种前列腺癌细胞的裸鼠在体内注射激活的细胞毒T淋巴细胞的同时接受该四聚体的治疗后,肿瘤生长明显受到抑制(P＜0.0001).结论:抗PSA/抗CD3双特异性单链抗体四聚体具有良好的生物学活性,具有体外杀伤肿瘤细胞和体内抑制肿瘤生长的作用.     

三氯乙烯对大鼠外周血淋巴细胞CD3＋CD4＋CD8＋的影响

目的探讨三氯乙烯（TCE）对大鼠外周血淋巴细胞CD3＋CD4＋CD8＋的影响。方法采用豚鼠最大值法（GPMT）。将大鼠随机分为3组,分别为阴性对照组、阳性对照组、TCE实验组,用皮内注射的方式分别注射橄榄油、2,4-二硝基氯苯（DNCB）、三氯乙烯（TCE）,实验结束后收集大鼠外周血液,用流式细胞仪检测淋巴细胞CD3＋CD4＋CD8＋比例。结果TCE实验组和阳性对照组大鼠外周血淋巴细胞CD3＋比例高于阴性对照组;阳性对照组CD4＋、CD4＋／CD8＋高于阴性对照组,CD8＋低于对照组,存在显著性差异（P〈0．05）;TCE实验组CD4＋、CD8＋、CD4＋／CD8＋与阴性对照组比较无统计学差异。结论三氯乙烯经皮染毒对大鼠外周血淋巴细胞亚型比例有一定影响,可能与三氯乙烯的致敏作用存在一定关系。     

EGTA对SLET细胞TCR/CD3复合物介导的[Ca2+]i反应的影响

目的 :证实SLE患者T细胞功能异常是否与其生物化学信号传导异常有关以及EGTA对其影响 ,探讨SLE的发病机理。方法 :用CD3单抗与羊抗鼠二抗IgG相交联刺激T细胞并用EGTA干预后 ,分别粘附细胞仪连续观察 10minT细胞 [Ca2 + ]i的变化 ,并评价 [Ca2 + ]i反应与CD3分子的相关性。结果 :正常人和SLE患者T细胞 [Ca2 + ]i反应的基准值相似 (P =0 .10 5 ) ;SLE患者高峰值、平台值T细胞的 [Ca2 + ]i反应明显高于正常对照 (P <0 .0 0 1,P <0 .0 0 1) ;加入EGTA后二者 [Ca2 + ]i反应有显著差异 :二者的T细胞CD3阳性率无差异 (P =0 .6 6 5 )。结论 :SLE患者T细胞TCR/CD3介导的信号转导途径存在异常 ,且不受EGTA的影响 ,可能是贮存库 [Ca2 + ]i释放的增加所致。