异种移植转基因用含粘附分子-2启动子的人CD59 重组基因的构建

目的：构建含人粘附分子－2（ICAM－2）启动子的人补体调节蛋白CD59重组基因,并钭其用于异种器官移植转基因。方法：利用PCR方法从人血基因组扩增得到ICAM－2启动子、CD59基因的第一内含子片段,经电泳分离、切胶回收纯化得到上述片段,分别双酶、单酶切这两条片段,纯化回收备用;双酶切pcDNA3-CD59真核表达载体,经电泳分离,切胶回收纯化得到不含病毒启动子、含筛选基因Neo的一段pcDNA3-CD59cDNA作为载体序列;ICAM－2启动子片段先与载体进行定向克隆连接反应后转化细菌,阳性转化蓖质粒抽提及酶切鉴定,得到pcDNA3-ICAM2-CD59质粒;再单酶切此质粒,纯化该载体与CD59第一内含子片段连接,转化细菌、抽提质粒,用脂质体将该质粒转染猪血管内皮细菌,流式细胞仪检测CD59蛋白表达。结果：得到pcDNA3-Enhancer-ICAM2-CD59质粒,以EcoR I消化此重组质粒,产生5．5及0．5kb两片段,以Hind Ⅲ消化重组质粒,得到5．45及0．55kb两片段,以Kpn I/Hind Ⅲ双酶切质粒时,出现5．0、0．55、0．4kb 3条片段,对插入子分别进行测序,上述结果完全符合设计要求及正确序列。流式细胞仪检测重组基因表达阳性。结论：含人ICAM－2启动子的CD59重组基因表达载体获得成功,该重组基因构建成功为转基因应用奠定了基础。     

基因重组构建MDR基因表达载体及其表达研究

基因重组构建ＭＤＲ基因表达载体及其表达研究（摘要）研究生王熙才导师周克敏，韩复生，张霆均昆明医学院第一附属医院昆明６５００３２北京医科大学北京１０００８３中国中医研究院北京１００７００利用基因重组技术，成功地构建了人ＭＤＲ１基因片段的表达载体ｐＧＥ－...     

双启动子报告基因表达载体的构建及其在真核细胞中表达活性测定

目的 研究含双启动子表达载体在真核细胞中的表达活性。方法 构建分别含有ＣＭＶ及ＣＭＶ－ＳＶ４０启动子的ｐＣ－ＬａｃＺ及ｐＣＳ－ＬａｃＺ真核表达载体。用阳离子脂质体Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ将其转染至ＴＪ９０５真核细胞中,对转染后２４～７２ｈ的细胞提取物进行β－半乳糖苷酶活性检测;并与转染标准ｐＳＶ－ｇａｌ载体的细胞提取物的酶活性进行比较分析。结果 ＴＪ９０５细胞中转染ＣＳ－ＬａｃＺ的β－半乳糖苷 酶活性明显高于其它两种载体（Ｐ〈０．０５）。且转染后４８ｈ是酶活性达高峰的时间。结论 两种启动子同时启动的基因表达效率较高。这为今后基因治疗中提高外源基因表达效率提供了一条有益的探索之路。     

Hsv—tk、重组人TNF—α融合基因表达载体的构建及瞬时表达

目的：构建pEGFP-TK-TNF-α表达载体，观察其在喉癌细胞Hep-2中的瞬时表达，方法：应用PCR方法对各自的进行扩增并经测序载体pGEM-T-Easy测序，利用逆转录病毒载体PLXSN中的多克隆位点将二者融合为融合基因TK－rhTNF-α并将其亚克隆至pEGFP-N3的EcoRI和BamHI位点间成功构建表达载体pEGFP-TK-rhTNF-α，并在该载体转染人喉细胞Hep-2后观察融合蛋白表达情况，结果：酶切鉴定证实TK－rhTNF-α融合基因片段已克隆到pEGFP-N3的EcoRI和BamHI位点间，并在转染人喉癌细胞Hep-2中观察到TK－rhTNF-α融合基因片段已克隆到pEGFP-N3的EcoRI和BamH1位点间，并在转染人喉癌细胞Hep-2中观察到TK－rhTNF-α融合基因及绿色荧光蛋白的表达。结论：pEGFP-TK-rhTNF-α表达载体便于观察转染细胞中TK－rhTNF-α融合蛋白的表达情况及蛋白定位，为自杀基因联合细胞因子基因疗法提供有利条件。     

人补体衰变加速因子、补体膜辅助调节蛋白及CD59真核表达载体构建及序列分析

目的:构建人补体衰变加速因子(Decayacceleratingfactor,DAF)、补体膜辅助调节蛋白(membranecofactorprotein,MCP)、CD59的真核表达载体pSecTag2/HygroB-DAF、pSecTag2/HygroB-MCP、pSecTag2/HygroB-CD59。方法:应用PCR方法,从DAF-pGEM-TEasyVector、MCP-pGEM-TEasyVector和CD59-pGEM-TEasyVector分别克隆所需的DNA片段,经限制性内切酶BglandXhol消化后,插入到具有相应酶切位点的真核表达载体pSecTag2/HygroB中,分别构建人DAF、MCP、CD59真核表达质粒,并进行酶切鉴定及DNA序列测定分析。结果:DAF基因大小为1049bp,MCP基因大小为1065bp,CD59基因大小为312bp,与genbank中记载的人DAF、MCP和CD59cDNA序列结果基本相同。结论:成功构建DAF、MCP和CD59真核表达质粒,为今后进一步探讨及研究转基因肝脏奠定了基础。     

为建立转基因猪进行异种器官移植构建CD59表达载体用ICAM-2启动子及CD59第一个内含子的分子克隆

目的：为建立能更有效抑制HAR的转入CRP基因猪，克隆其调控序列-ICAM-2启动子、Intronl增强子，使之能够在血管内皮细胞上大量表达。方法：提取人基因组DNA。用PCR方法克隆ICAM-2启动子、CD59的第一内含子片段。结果：电泳、测序鉴定，所获得片段与设计的一致。     

人maff基因表达载体构建的实验研究及意义

[目的]构建人maff基因表达载体并在人肝癌细胞系HepG2细胞中表达。[方法]PCR（聚合酶链式反应）扩增人maff基因,并将其和克隆质粒连接,转染到大肠杆菌中扩增,酶切鉴定,然后将目的基因和表达载体连接,转染到人肝癌细胞系HepG2细胞中表达并用westernblo（t蛋白质印记）进行鉴定。[结果]经酶切和westernblot鉴定,人maff基因表达载体可在真核细胞内表达Maf F蛋白。[结论]该实验构建了人maff基因真核表达载体,为进一步研究中药预防肿瘤发生提供实验基础。     

hTFF2毕赤酵母表达载体的构建与鉴定

目的 构建三叶因子2(hTFF2)的毕赤酵母表达载体.方法 从人胃窦部提取总RNA,经RT-PCR得到hTFF2 cDNA,用PCR方法扩增hTFF2基因,并将其克隆到毕赤酵母的表达载体pGAPZαA中,构建真核重组表达质粒pGAPZαA-hTFF2.结果 通过双酶切和基因序列分析确定插入pGAPZαA中的片段为hTFF2基因片段.结论 重组质粒pGAPZαA-hTFF2成功构建,为在真核细胞中高效表达hTFF2及下一步的功能研究奠定了基础.     

Noggin基因沉默表达载体的构建及效果评价

目的构建慢病毒介导的Noggin RNAi干扰序列,并分析这些干扰序列对Noggin基因的沉默效果。方法针对目的基因Noggin的mRNA设计四条干扰序列,并将这些序列连接到Lenti-KD慢病毒载体,将重组质粒瞬时转染HEK-293T包装细胞,获得重组慢病毒。将重组病毒感染MC3T3-E1细胞,利用Puromycin进行筛选,获得稳定表达细胞系。通过实时荧光定量PCR和Western Blot技术分析不同干扰序列的干扰效果。结果实时荧光定量PCR结果显示,四种干扰序列对Noggin基因的表达都有一定的沉默效果,但只有shNoggin-1（P<0.01）对其表达影响显著。Western Blot结果显示,四种干扰序列中只有shNoggin-1（P<0.01）对Noggin的表达蛋白具有显著的降低作用。结论 获得了一种Noggin基因的干扰序列,该序列能够干扰Noggin基因mRNA的稳定性,从而影响蛋白的表达。该干扰序列可以用于部分敲除Noggin基因,从而用于研究Noggin基因的功能。     

大鼠脑挫伤后细胞间黏附因子1时序性表达的实验性研究

目的观察大鼠脑挫伤后不同时间段细胞间黏附因子1（intercellular adhesion molecule－1,ICAM－1）的表达变化规律。方法参照Feeney法建立大鼠闭合性脑挫伤模型,将实验大鼠分为对照组和脑挫伤后1h、6h、24h、48h、72h、7d组,共7组,每组8只,运用Westernblot方法检测脑挫伤组织中ICAM—1的表达。结果大鼠脑挫伤1h可见ICAM－1有少量表达,伤后24h表达明显增多,72h达到高峰,其后下降,伤后7d仍有表达,且高于对照组水平。各实验组与对照组比较,差异均有统计学意义（均P〈0．05）,各实验组两两比较差异均有统计学意义（均P〈0．05）。结论大鼠脑挫伤后ICAM－1表达随着时间的变化表达呈现一定的规律性,可为推断脑挫伤早期损伤时间提供一定的参考依据。     

大鼠缺血再灌注ICAM-1表达与小动脉损伤关系的实验研究

目的探讨大鼠缺血再灌注（I/R）时细胞间黏附分子-1（intercelluar adhesion molecule-1,ICAM-1）表达与小动脉形态学改变的关系及意义。方法 70只Wistar大鼠随机分为3组：Ⅰ组：正常对照组（10只）,Ⅱ组：缺血组（10只）,Ⅲ组：I/R组（50只）。Ⅰ组由三通管放血立即处死。Ⅱ、Ⅲ组10min内放血至血压为40mmHg,并维持45min。Ⅱ组缺血45min后处死,Ⅲ组缺血45min后进行输血输液治疗,分别于再灌注1、3、6、12、24h时点处死。免疫组化染色观测ICAM-1在各组大鼠脑、肾、四肢肌肉的小动脉内皮和平滑肌细胞表达的阳性细胞数,并用光镜和透射电镜观察小动脉形态学改变。结果 （1）Ⅰ组脑、肾及四肢肌肉的小动脉ICAM-1不表达;与Ⅰ组比较,Ⅱ组ICAM-1在大鼠脑、肾及四肢肌肉的小动脉的表达变化差异无统计学意义（P〉0.05）;Ⅲ组再灌注1h脑、肾及四肢肌肉的小动脉ICAM-1表达上调（P〈0.05）,再灌注3h肾及四肢肌肉的小动脉ICAM-1表达达高峰,再灌注6h脑的小动脉ICAM-1表达达高峰,持续至24h;（2）光镜和电镜下Ⅱ组小动脉内皮和平滑肌轻微损伤,Ⅲ组损伤加重,以再灌注3h损伤最为显著。结论 ICAM-1在大鼠小动脉表达上调介导了I/R小动脉的损伤。     

细胞间粘附分子-1水平与2型糖尿病肾病病变程度的关系

目的 探讨血清中细胞间粘附分子-1（Intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1）的水平与2 型糖尿病肾病（Diabetic nephropathy,DN）病变程度的关系。方法 选择2017年4月～2019年1月在我院住院2 型糖尿病及健康体检者共265 例分为五组[对照组、非DN 组、早期DN 组、临床期DN 组（肾功能正常）、临床期DN 组（肾功能异常）],观察各组ICAM-1 与UAER 的关系。结果 1.DN 各组ICAM-1 明显增高,且随着DN 病情的加重,ICAM-1水平逐渐升高（对照组：48.00±13.10 ng/mL;非DN 组：203.02±30.55 ng/mL;早期DN 组：400.32±55.78 ng/mL;临床期DN 组（肾功能正常）：601.12±51.81 ng/mL;临床期DN 组（肾功能异常）：863.71±36.44 ng/mL）。2.DN 各组UAER 均与ICAM-1 呈正相关（早期DN 组：UAER 与ICAM-1 的相关系数r=0.789,临床期DN 组（肾功能正常）：UAER 与ICAM-1 的相关系数r=0.719,临床期DN 组（肾功能异常）：UAER 与ICAM-1 的相关系数r=0.510）。结论ICAM-1与DN 病变程度相关,可作为反映DN 病情严重程度的参考指标,也可作为DN 早期筛查的参考指标。     

缺血预处理对缺血再灌注的大鼠肝脏中肿瘤坏死因子—α、细胞间黏附分子—1 mRNA表达的影响

目的 通过观察缺血预处理对缺血再灌注大鼠肝脏中的一些生化指标的变化,以及肿瘤坏死因子－α和细胞间粘附分子－1 mRNA表达的变化,研究缺血预处理对缺血再灌注损伤的干预方式及干预程度。方法 利用大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型,比较缺血预处理组与缺血再灌注组以及各预处理组间在血清天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶、乳酸脱氢酶,肝组织中丙二醛、过氧化物歧化酶等生化指标的含量变化,并观察了组织中中性粒细胞（PMNs)浸润量,研究了TNF－α及ICAM－1 mRNA表达的变化。结果 各预处理组酶的漏出和脂质过氧化物的形成减少,抗氧自由基能力增强,组织中PMNs浸润量降低。TNF－α和ICAM－1mRNA表达减少。结论 缺血预处理对肝脏缺血再灌注损伤有显著的保护作用。一次缺血10min再灌注10min的预处理保护效果最佳。缺血预处理的干预机制可能是通过下调TNF－α和ICAM－1 mRNA表达,减轻PMNs在病变部位聚集及其所产生的病理损伤作用而实现的。     

构建人补体衰变加速因子真核载体并转染NIH/3T3成纤维细胞

目的：构建人补体衰变加速因子（DAF）真核表达载体pSecTag2／HygroB-DAF，并利用壳聚糖组装成纳米微粒复合体，转染小鼠NH／3T3成纤维细胞。方法：应用PCR方法，从DAF—pGEM—T Easy Vector克隆相关的DNA序列，插入具有相应酶切位点的真核表达载体pSecTag2／HygroB中，构建pSecTag2／HygroB—DAF真核表达质粒，并进行酶切鉴定及序列测定；利用壳聚糖包裹质粒，转染小鼠NIH／3T3细胞，并对转染细胞用抗DAF进行免疫组化染色。结果：DAF基因大小为1049bp，与基因序列数据库中记载的人DAF cDNA序列结果完全一致；利用壳聚糖-DAF纳米微粒转染NIH／3T3细胞24h后，免疫组化染色显示细胞质弥漫染色阳性。结论：成功构建了人DAF真核表达载体并通过壳聚糖介导转染NH／3T3细胞。     

肺癌根治术后sICAM-1水平的变化及其意义

目的了解可溶性细胞间粘附分子-1 (soluble intercellular adhesion molecule, sICAM-1)在肺癌患者血清中的表达状况及手术前后sICAM-1水平的变化趋势,探讨检测血清sICAM-1在肺癌鉴别诊断、病情判断及转移中的作用.方法本实验以肺癌手术切除标本、正常肺组织、肺癌及肺良性病变患者血清为研究对象,采用免疫组化、酶联免疫吸附试验方法进行了研究.结果肺癌患者组血清sICAM-1水平明显高于肺良性病变组(P<0.01);且Ⅲ-Ⅳ期组高于Ⅰ-Ⅱ期组(P<0.05);ICAM-1阳性表达组血清sICAM-1含量较ICAM-1阴性组高;转移组含量较无转移组高(P<0.05);与肺癌术前比,根治组术后3 d血清sICAM-1水平明显升高(P<0.01),术后7 d出现下降趋势,术后14 d根治组血清sICAM-1水平明显低于术前水平(P<0.01),而探查组与术前比无明显变化.结论肺癌患者血清中sICAM-1水平增高提示肺癌晚期、有淋巴结转移、预后差;肺癌根治术后14 d血清sICAM-1水平明显低于术前水平,检测血清sICAM-1水平有助于判断病情及手术治疗效果.     

同型半胱氨酸对人脐静脉内皮细胞表达ICAM-2及与树突状细胞粘附的影响

目的 探讨同型半胱氨酸（Hcy）对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）分泌和表达细胞间粘附分子-2（1-CAM-2）以及内皮细胞与树突状细胞（DC）粘附的影响。方法 在人脐静脉内皮细胞培养基中加入浓度为0．5mmol／L的Hey作用不同时间，以及加入不同浓度的Hey作用24h。用ELISA法检测内皮细胞培养基中HU-VECs分泌ICAM-2的蛋白含量，用Western blot法检测HUVECs表达ICAM-2的蛋白含量，用分子探针标记的DC与HUVECs共孵育，共聚焦显微镜下计数粘附于HUVECs的DC数量，以检测Hey对HUVECs与DC粘附的影响。结果用0．5mmol／L Hey干预后，HUVECs分泌ICAM-2蛋白在12h开始高于空白组（P〈0．05），24h和48h均增加显著（均P〈0．01）；而ICAM-2蛋白的表达在6h开始高于空白组（P〈0．05），24h达峰值（P〈0．01），48h下降显著，且与空白组相比无统计学差异。用不同浓度的Hey干预24h后，ICAM-2蛋白的分泌和表达及HUVECs与Dc粘附均呈剂量依赖性增加，当Hey浓度高于0．5mmol／L时增加更显著。结论 Hey能刺激HUVECs分泌和表达ICAM-2蛋白，从而促进HUVECs与DC的粘附，这可能是其诱导动脉粥样硬化早期形成的重要机制之一。     

含人白细胞介素-2基因逆转录病毒载体系统的建立及转染人白血病细胞株的研究

应用逆转录病毒载体LNCIL－2介导人白细胞介素（IL）－2基因经包装细胞PA317包装成重组病毒后，转染人白血病细胞株K562、HL－60，经G418筛选获阳性克隆，阳性克隆上清表达IL－2活性。转染后细胞经Southern检测存在新霉素抗性基因（neoR）。转染IL－2基因的白血病细胞生长速度、克隆形成率均落后于转染空载体或未转染基因的细胞。表明含人IL－2基因逆转录病毒载体系统已成功建立，转染人IL－2基因的白血病细胞增殖活性下降。