miR-145抑制VSMC增殖的作用及其相关信号通路研究

目的探讨miR-145对PDGF-BB诱导的大鼠原代血管平滑肌细胞(VSMC)的作用及丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信号转导途径的作用。方法体外培养大鼠原代VSMC,再将细胞分为空白对照组、miR-NC组、PDGF-BB+miR-145组及PDGF-BB组。CCK-8法检测各组细胞的增殖情况;实时RT-PCR方法检测PCNA、c-Jun及SM22a的表达水平;Western印迹方法检测ERK1/2和p-ERK1/2的表达、JNK和p-JNK的表达以及p38MAPK和p-p38MAPK的表达。结果 miR-145过表达后能够抑制PDGF诱导的大鼠原代VSMC增殖,并下调VSMC增殖相关基因PCNA、c-Jun的表达、上调分化相关基因SM22a的表达;PDGF-BB诱导VSMC后,ERK、JNK、p38MAPK的磷酸化水平均明显上调,而转染miR-145慢病毒后再加PDGF刺激,ERK、JNK、p38MAPK的磷酸化水平均明显下调。结论 miR-145能够抑制去分化型VSMC中的MAPK信号通路,进而抑制VSMC的增殖。     

微小RNA-1慢病毒载体介导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的研究

目的通过微小RNA-1(microRNA-1,miR-1)慢病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞(MSC),探讨miR-1对MSC向心肌细胞分化的影响。方法采用全骨髓贴壁培养法分离培养大鼠MSC并进行流式细胞学鉴定;构建表达miR-1慢病毒载体;将miR-1慢病毒载体转染大鼠MSC(MSCmiR-1)连续培养15d,光镜下观察转染后细胞形态,分别于0、4、6、15dqRT-PCR检测miR-1、心肌相关基因锌指结构蛋白(GATA-4)、肌钙蛋白I(cTnI)、α肌动蛋白(α-actin)的表达;免疫荧光观察cTnI的表达;Western blot检测α-actin的表达。结果原代大鼠MSC呈长梭形、漩涡状生长,流式细胞学检测显示,98%以上细胞表达CD44和CD29,不足1%细胞表达CD45;成功构建miR-1重组慢病毒载体,病毒滴度为3×108 TU/μl;转导miR-1后,MSCmiR-1高表达心肌特异性相关基因GATA-4、α-actin、cTnI,并随时间逐渐增强,转染4d免疫荧光检测可见cTnI在部分MSCmiR-1中表达,于15d时表达最强,Westernblot进一步证实了α-actin在MSCmiR-1中表达。结论转导miR-1至大鼠MSC中可促使其向心肌样细胞的分化。     

MiR-92a-3p_R+1和miR-92a-1-5p在ox-LDL诱导大鼠VSMC表型转化和增殖中的作用

目的探讨miR-92a-3p_R+1和miR-92a-1-5p在氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)表型转化和增殖中的作用及其与ERK1/2信号通路的相关性。方法分离、培养大鼠VSMC,以ox-LDL(50 mg/L)诱导VSMC,采用ERK1/2特异性抑制剂U0126(10μmol/L)阻断ox-LDL(50 mg/L)诱导VSMC的ERK1/2信号激活,MicroRNA微阵列分析VSMC的miR-92a-3p_R+1和miR-92a-1-5p表达,CCK-8法和Brdu流式细胞术检测细胞增殖;免疫荧光法检测VSMC收缩表型标志蛋白SM22α的变化;Western blot检测VSMC的ERK1/2通路信号激活情况(ERK、p-ERK)、表型标志蛋白SM22α、细胞周期相关蛋白(PCNA、cyclin D1、p21、p27)的表达情况。结果 ox-LDL诱导下,VSMC的miR-92a-3p_R+1和miR-92a-1-5p表达明显上调,VSMC的ERK1/2磷酸化水平明显增加,SM22α的表达降低,同时细胞周期相关蛋白PCNA、cyclin D1高表达,p21、p27低表达;ERK1/2通路特异性抑制剂U0126干预后,ERK1/2磷酸化水平受抑制,相应的VSMC miR-92a-3p_R+1和miR-92a-1-5p表达明显下调(P0.05),VSMC增殖显著下降,SM22α的表达上调(P0.05),提示VSMC由合成表型转化为收缩表型,并下调PCNA、cyclin D1的表达,上调p21、p27蛋白的表达(P0.05),说明其表型转化和增殖明显受抑制。结论 miR-92a-3p_R+1和miR-92a-1-5p在ox-LDL诱导VSMC表型转化和增殖中起重要作用,并与ERK1/2信号通路密切相关。     

CLEC4M慢病毒载体的构建及其在K-562细胞中的表达

目的本研究拟构建CLEC4M慢病毒表达载体,建立稳定过表达的K-562细胞株。方法应用逆转录PCR克隆出正常人CLEC4M基因序列,将序列插入GV166载体,构建GV166-CLEC4M慢病毒表达载体,之后转染293T细胞进行慢病毒包装。用获得的慢病毒液感染人白血病细胞系K-562,通过实时荧光定量PCR和Western Blot检测K-562细胞中CLEC4M的过表达情况。结果测序结果显示成功构建重组慢病毒表达质粒GV166-CLEC4M;依据实时荧光定量PCR可测定慢病毒能够有效感染K-562细胞;CLEC4M在K-562细胞中的mRNA和蛋白水平都成功的过表达。结论 CLEC4M慢病毒表达载体的构建,为进一步研究CLEC4M基因在HCV入胞的分子机制奠定了基础。     

miR-30b对血管平滑肌细胞迁移能力的影响

目的探究microRNA-30b(miR-30b)对大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)迁移能力的影响。方法体外分离培养大鼠VSMC,将VSMC随机分为正常对照组(未进行转染)、miR-对照组(转染miR-NC,浓度为50 nmol/L)、miR-30b mimics组(转染miR-30b mimics,浓度为50 nmol/L)。采用实时荧光定量PCR实验检测miR-30b及钙黏附蛋白E-Cadherin的表达情况;采用划痕愈合实验检测VSMC的迁移率;采用Transwell实验检测VSMC的迁移能力;采用Western blot技术检测E-Cadherin蛋白的表达。结果①miR-30b mimics组与正常对照组和miR-对照组比较,miR-30b表达水平升高(P0.05)。②划痕愈合实验结果显示,与正常对照组和miR-对照组相比,miR-30b mimics组VSMC的划痕修复率明显降低(P0.05)。③Transwell实验可见,miR-30b mimics组VSMC的迁移能力较正常对照组和miR-对照组明显减弱(P0.05)。④miR-30b mimics组E-Cadherin mRNA和蛋白的表达较正常对照组和miR-对照组明显增强(P0.05)。结论 miR-30b上调E-Cadherin的表达,从而抑制大鼠VSMC的迁移。     

miR-1284过表达对胃癌细胞中EIF4A1的影响

目的通过验证miR-1284可能的靶基因,从而探讨miR-1284影响胃癌发生发展可能的分子作用机制。方法采用生物信息学软件预测miR-1284可能的靶基因。以慢病毒介导miR-1284过表达转染胃癌MGC-803细胞为miR-1284组(LV-miR-1284组),转染空载体慢病毒载体的细胞为阴性对照组,未转染慢病毒载体的细胞为空白对照组。运用荧光定量PCR检测各组EIF4A1基因的表达,Western blot法检测各组EIF4A1蛋白的表达,通过双荧光素酶对EIF4A1进行靶基因验证。结果与阴性对照组和空白对照组比较,miR-1284组的EIF4A1基因和蛋白的表达量下降,双荧光素酶示miR-1284能与靶基因EIF4A1的3'UTR的结合。结论 miR-1284通过作用其靶基因EIF4A1发挥生物功能学作用。     

活化转录因子3基因Cas9编辑慢病毒载体的构建及鉴定

目的:构建靶向活化转录因子3(ATF3)在CRISPR/Cas9技术编辑的慢病毒载体。方法:针对ATF3基因设计并合成三条对应的向导(gRNA)序列和一条无意义序列,向导RNA序列与双酶切U6-EF1a-Cas9-FLAG-P2A-EGFP载体链接,DNA测序鉴定重组载体。荧光/绝对定量法测定慢病毒浓度。共转染人微血管静脉内皮细胞(HMEC)后,实时定量荧光PCR检测ATF3 mRNA表达,验证HMEC细胞中是否含有ATF3基因及其是否有突变。对照病毒和三个靶点慢病毒分别感染Cas9蛋白稳定株,感染后混合克隆进行抽提基因组DNA,将得到PCR产物进行错配酶法进行酶切,对于筛靶中阳性的PCR产物一组序列与野生型对比。Western blot检测ATF3蛋白表达,验证转染效果。定量PCR检测ATF3mRNA的改变。结果:测序表明ATF3在Cas9编辑下慢病毒载体构建成功。HMEC倒置荧光显微镜荧光视野和明视野进行对比,感染可达到80%转染率,GFP持续稳定表达。Western blot结果显示,ATF3蛋白表达有明显下调(P<0.05)。结论:本研究成功构建了ATF3Cas9编辑慢病毒载体,为进一步研究ATF3在静脉桥血管再狭窄中早期内皮功能失调作用机制及基因治疗提供了实验依据。     

Cx43基因shRNA慢病毒载体的构建及其对大鼠心肌细胞Cx43基因的作用

目的构建缝隙连接蛋白(Cx)43基因shRNA慢病毒载体,并检测其对大鼠心肌细胞Cx43基因的作用。方法针对Cx43基因序列,设计RNA干扰靶点序列,合成靶序列的双链DNA,接入pGCL-GFP载体,挑选阳性克隆行PCR鉴定及测序。用pHelper1.0和pHelper2.0质粒转染293T细胞,包装产生具备感染能力的慢病毒。以293T细胞中绿色荧光蛋白的细胞数量计算病毒滴度;以最适感染复数感染大鼠心肌细胞,通过荧光显微镜观察感染效率;应用real-time PCR和Western blot法检测大鼠心肌细胞Cx43 mRNA及Cx43蛋白表达,并评价其抑制效果。结果经PCR鉴定和测序证实,Cx43慢病毒载体构建正确,其病毒滴度为8×108TU/mL、转染效率为82.59%。荧光定量real-time PCR法检测Cx43 mRNA的抑制率为96.10%,Western blot法检测Cx43蛋白的抑制率为77.16%。结论成功构建了Cx43基因shRNA慢病毒载体,其能显著抑制大鼠心肌细胞Cx43基因的表达。     

miR99a-5-p在结核分枝杆菌感染宿主巨噬细胞中的免疫调控作用

目的:初步探讨结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)感染THP-1细胞内特异miRNA在宿主抗结核免疫中的作用。方法:提取MTB感染及未感染THP-1细胞RNA,基于Illumina NovaSeq6000二代测序平台检测THP-1细胞内miRNA表达谱。采集4名健康受试者6 ml外周血并分离人原代巨噬细胞。应用实时荧光PCR(qRT-PCR)技术验证MTB感染THP-1细胞内特异miRNA并检测人原代巨噬细胞中靶标miRNA的表达水平。构建miRNA过表达载体,经慢病毒转染THP-1巨噬细胞获得稳定的过表达细胞株,使用qRT-PCR检测H37Rv感染的miRNA过表达细胞及对照空载体细胞中的肿瘤坏死因子α(TNF-α)及γ-干扰素(IFN-γ)表达水平。结果:从16个二代测序结果表达差异明显的miRNA分子中选取既往未作研究且差异最为明显的miR-99a-5p(P=0.021)作为研究靶基因。通过qRT-PCR在THP-1细胞及原代巨噬细胞中验证,发现miR-99a-5p在THP-1感染组和原代巨噬细胞内的表达量(分别为0.482±0.148和...     

人骨诱导因子和绿色荧光蛋白基因共表达慢病毒载体的构建和鉴定及在HT-29细胞中的表达

目的构建和鉴定人骨诱导因子基因(hOGN)和绿色荧光蛋白(GFP)共表达慢病毒载体,并检测其在人大肠癌细胞株HT-29中的表达水平。方法采用PCR方法克隆hOGN基因;将hOGN基因连接到带有GFP的慢病毒表达载体pEZ-Lv201中构建慢病毒载体;将构建的慢病毒载体质粒pEZ-hOGN-SV40-eGFP-IRES-Puro(pEZ-hOGN)与慢病毒包装质粒混合物Lenti-PacHIVmix共转染293T细胞,收集慢病毒悬液;重组病毒转染H1299细胞,定量PCR法检测重组病毒滴度;将构建的pEZ-hOGN感染HT-29细胞,荧光显微镜观察和Western印迹检测感染后HT-29细胞中GFP表达情况和目的基因hOGN的表达情况。结果基因测序分析证实克隆的hOGN基因与GenBank提供的序列完全一致;构建的重组慢病毒载体经双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定证实OGN正确插入pEZ-Lv201;定量PCR测定慢病毒滴度为0.1×10~9~1×10~9TU/ml。在HT-29细胞中重组病毒感染96h后在荧光显微镜下可检测到较强的绿色荧光蛋白表达,Western印迹检测到在HT-29细胞中hOGN蛋白过表达。结论成功构建携带hOGN基因的重组慢病毒载体,在HT-29细胞中有效表达。     

长链非编码RNA LINC00628通过竞争性结合miR-145促进肺腺癌细胞吉非替尼抵抗

目的 探究长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)LINC00628及其潜在靶基因mi-croRNA-145(miR-145)对肺腺癌细胞吉非替尼抵抗的影响.方法 收集54例肺腺癌患者的肿瘤及癌旁组织.以人肺腺癌细胞系PC9为体外模型构建吉非替尼抵抗细胞系(Gefitinib resis...     

低表达的microRNA-145对c-Myc表达的影响

目的:探讨microRNA(miR)-145是否通过调控c-Myc参与肝癌行为的调控.方法:实时定量PCR检测肝组织及细胞系miR-145表达水平:检测不同肝组织c-Myc的mRNA和蛋白表达量:通过转染上调miR-145在HepG2细胞表达后,检测转染前后空白组、实验组、阴性对照组HepG2中c-Myc的mRNA和蛋...     

过表达miR-140-5p对高脂饲养诱导的非酒精性脂肪性肝病大鼠的作用及机制

目的 探究过表达miR-140-5p对高脂饲养诱导的非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)大鼠的作用及机制.方法 40只大鼠随机分为对照组、模型组、空载体组和过表达组,每组各10只.对照组给予普通饲料饲养,模型组给予高脂饲料饲养构建NAFLD大鼠模型,空载体组在模型组基础上于饲养第13周、第18周尾静脉注射含空载质粒的慢病毒...     

Klotho RNA干扰对人主动脉平滑肌细胞钙化和表型转化的影响

目的 探讨抗衰老因子(Klotho)RNA干扰对人主动脉血管平滑肌细胞钙化和表型转化的影响.方法 采用慢病毒抑制人主动脉平滑肌细胞的Klotho表达,通过荧光显微镜、荧光定量PCR及Western印迹法验证转染效率.采用微量法检测细胞内钙离子含量及碱性磷酸酶活性,酶联免疫吸附试验检测骨桥蛋白水平,采用荧光定量PCR检测...     

水蛭素对凝血酶诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响

为研究重组水蛭素对凝血酶诱导的兔胸主动脉血管平滑肌细胞增殖的影响及其作用机制.选用第2～5代培养的血管平滑肌细胞,在与凝血酶(4.0 ku/L)共同孵育的条件下,分别给予水蛭素(6.0 ku/L)和肝素(6.O ku/L)进行干预.通过四唑盐比色实验检测细胞生长活性,流式细胞术检测细胞周期,免疫组织化学检测血小板生长因子和增殖细胞核抗原在血管平滑肌细胞中的表达.结果发现,重组水蛭素能明显抑制凝血酶诱导的平滑肌细胞增殖,其抑制作用可能与减低了血管平滑肌细胞对血小板生长因子和增殖细胞核抗原的表达有关.     

水蛭素对凝血酶诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响

为研究重组水蛭素对凝血酶诱导的免胸主动脉血管平滑肌细胞增殖的影响及其作用机制。选用第2～5代培养的血管平滑肌细胞，在与凝血酶(4．0ku／L)共同孵育的条件下，分别给予水蛭素(6．0ku／L)和肝素(6．0ku／L)进行干预。通过四唑盐比色实验检测细胞生长活性，流式细胞术检测细胞周期，免疫组织化学检测血小板生长因子和增殖细胞核抗原在血管平滑肌细胞中的表达。结果发现，重组水蛭素能明显抑制凝血酶诱导的平滑肌细胞增殖，其抑制作用可能与减低了血管平滑肌细胞对血小板生长因子和增殖细胞核抗原的表达有关。     

微小RNA-155通过靶向缺氧诱导因子1α调控心肌纤维化

目的 探讨微小RNA（miR）-155对心肌成纤维细胞（cardiac fibroblasts, CFs）中纤维化相关基因表达的作用及其机制。 方法 实验分为对照组、血管紧张素(Ang)Ⅱ组、Scramble组、miR-155 mimic组、AngⅡ+ Scramble组、AngⅡ+ miR-155 mimic组、AngⅡ+ HIF-1α siRNA组。AngⅡ刺激原代分离培养的小鼠CFs,模拟心肌纤维化过程中CFs活化过程,采用PCR及Western blot检测各组miR-155、1型胶原（Col 1）、3型胶原（Col 3）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达;采用双荧光素酶报告基因实验检测miR-155与缺氧诱导因子（HIF）-1α 3’端非编码区（3’-UTR）的结合作用。 结果 AngⅡ刺激可显著促进小鼠CFs中纤维化相关基因的表达,同时降低miR-155的水平(P <0.05);过表达miR-155可显著降低AngⅡ诱导的小鼠CFs中纤维化相关基因的表达（P <0.05）;HIF-1α受到了miR-155的负性调控,并能同miR-155结合;miR-155 mimic和HIF-1α siRNA能一致性的降低AngⅡ诱导的小鼠CFs中纤维化相关蛋白的表达。 结论 miR-155能抑制AngⅡ诱导的CFs纤维化,进而抑制心肌纤维化;HIF-1α是miR-155的靶基因,并介导了miR-155发挥抑制AngⅡ诱导的CFs纤维化的过程。     

氟伐他汀对兔髂动脉内皮剥脱后细胞增殖的影响

探讨氟伐他汀对兔髂动脉内皮剥脱后造成的动脉粥样硬化模型中细胞增殖的影响。将雄性新西兰兔随机分为氟伐他汀组 (n =2 8)和对照组 (n =2 8) ,用球囊导管剥脱内皮及高胆固醇饮食造成动脉粥样损伤 ,分别在内皮损伤后 1、2、4、8周处死动物并取髂动脉 ,用常规免疫组织化学染色和计算机图像分析方法观察氟伐他汀对新生内膜中平滑肌细胞增殖和血小板源生长因子 BB的影响。结果发现 ,氟伐他汀组内膜中增殖细胞核抗原染色阳性细胞率明显少于对照组 (P <0 .0 5 ) ;氟伐他汀组血小板源生长因子 BB含量一直处于较低水平 ,且明显低于对照组 (P <0 .0 5 ) ;血管内膜增殖细胞核抗原染色阳性细胞率与血小板衍生因子 BB含量的相关系数为 0 .712 7(P <0 .0 1)。提示氟伐他汀可能部分通过抑制血小板源生长因子 BB合成和分泌而抑制平滑肌细胞增殖。