载脂蛋白CⅡ基因启动子区-190T→A突变对其转录的影响

为探讨载脂蛋白CⅡ基因启动子区-190bp处的碱基突变(T→A)对载脂蛋白CⅡ基因转录的影响，及其与血浆载脂蛋白CⅡ浓度降低的关系。通过定点诱变技术构建带有一190bp处T→A突变的载脂蛋白CⅡ启动子的荧光素酶表达载体pGL3应用脂质体介导的基因转染技术，将带有正常的载脂蛋白CⅡ启动子的表达质粒和构建的突变质粒分别与内参照质粒pRL-TK共转染HepG2细胞，瞬时表达；利用双荧光素酶测试系统检测荧光素酶活性。结果发现，带有启动子区-190T→A突变的载脂蛋白CⅡ启动子的荧光素酶表达活性比正常的载脂蛋白CⅡ启动子的表达活性低18．56％。结果提示，载脂蛋白CⅡ基因启动子区-190bp处的碱基由T突变为A降低了载脂蛋白CⅡ启动子的转录活性。     

人XAF1基因启动子的克隆及其在人肝癌细胞株中活性的测定

目的分析XAF1基因启动子在肝癌细胞株中的活性,为研究XAF1基因转录调控的基本机制奠定基础。方法从肝癌细胞株中扩增XAF1基因的1395bp启动区域片段并分别克隆到报告基因载体pGL3-basic和pEGFP-1中,分别将含有XAF1基因启动子的报告基因载体pGL3-basic和pEGFP-1转染肝癌细胞株HepG2、SMMC7721,检测萤火虫荧光素酶的活性并观察绿色荧光蛋白的表达。通过转染细胞、荧光素酶活性测定及观察绿色荧光蛋白的表达,检测其启动子活性。结果重组的质粒经双酶切和测序结果证实克隆的XAF1启动子片段序列正确;转染后的HepG2、SMMC7721荧光素酶相对发光强度分别是6．97±0．74、6．12±0．59。其绿色荧光蛋白强度明显低于对照组。结论本实验构建的含XAF1启动子的报告基因质粒为研究XAF1基因的转录调控提供实验依据。     

HBV启动子克隆及萤光素酶报告基因载体的构建

目的对HBV启动子基因序列进行分析,克隆并构建S1、S2、ENⅠ/X及ENⅡ/C 4个启动子的萤光素酶报告基因载体。方法用pHBV 1.3作为模板进行PCR扩增目的片段,将获得片段与pGL3-Enhancer荧光素酶报告载体重组构建,分别转染Huh7细胞后,检测萤光素酶活性。结果成功获得121 bp、368 bp、437 bp、237 bp 4个目的扩增片段,并成功构建了S1、S2、ENⅠ/X及ENⅡ/C启动子报告基因载体。结论上述载体的成功构建及初步分析为进一步研究HBV启动子活性及新的抗HBV药物奠定了基础。     

含有MS4A7基因启动子的荧光素酶报告基因质粒的构建及意义

目的构建含有人4次跨膜监视蛋白A（MS4A）基因启动子的萤火虫荧光素酶报告基因质粒。方法用PCR方法扩增获得含有人MS4A7基因启动子的DNA片段,将其连接至TA克隆质粒后转移至虫荧光素酶质粒pGL3-basic中,得到pGL3-MS4A7-Promoter重组质粒;经限制性内切酶酶切、PCR及测序鉴定得到确认;将该质粒转染进入HL-60细胞,并检测细胞中虫荧光素酶的活性。结果 pGL3-MS4A7-Promoter重组质粒插入片段和相邻序列正确,克隆的MS4A7基因片段有启动子活性。结论成功构建了pGL3-MS4A7-Promoter报告基因质粒,为进一步研究MS4A7基因的表达调控奠定了基础。     

hAFP增强子调控的肝癌特异性基因治疗载体的构建及活性测定

目的:构建新型AFP顺式作用元件调控的基因表达载体,检测该调控元件的特异性和活性表达.方法:设计含有特定酶切位点的引物,采用PCR法从HepG2细胞中克隆AFP启动子及增强子基因亚区片段.启动子与增强子长、短片段分别与含有报告基因荧光素酶基因的载体pGL-3的多克隆位点连接,构建不同长度hAFP增强子调控的肝癌特异性Luciferase表达载体APSE-Luc/APLE-Luc.经测序,PCR及酶切鉴定各重组体.用脂质体法将表达载体转染表达或不表达AFP的肿瘤细胞系进行荧光强度及特异性表达测定.结果:成功地将AFP基因启动子、增强子克隆到报告基因载体pGL-3的多克隆位点,构建成为不同长度hAFP增强子调控的肝癌特异性Luciferase表达载体APSE-Luc/APLE-Luc,酶切鉴定和DNA序列分析无误.转染APLE-Luc质粒的细胞中Luciferase表达量明显高于转染APSE-Luc质粒的细胞,其在HepG2细胞中的表达明显高于SMMC7721细胞及Hela细胞.结论:成功构建AFP启动子与增强子联合调控载体APSE-Luc/APLE-Luc.AFP增强子能够特异性地增强目的基因在AFP阳性细胞中表达,并且不同的亚区活性不同,长片段的活性明显高于短片段.     

胃癌Pdx1启动子载体构建及其受DNA甲基化的调节

目的:构建胰十二指肠同源盒基因1(pancreatic duodenum homeobox 1,Pdx1)启动子调控的荧光素酶基因表达载体,筛选Pdx1启动子,探讨Pdx1启动子活性受DNA甲基化的影响.方法:针对Pdx1基因启动子区域进行PCR扩增,经限制性酶切法将扩增产物克隆至荧光素酶基因报告载体中,构建pGL3-Pdx1重组质粒.荧光素酶检测法检测胃癌细胞中Pdx1各段报告基因的启动子活性,并用DNA甲基化酶SssI处理胃癌细胞,比较各报告基因的启动子活性变化.结果:经过酶切和PCR法鉴定成功构建了9个携带Pdx1启动子的重组荧光素酶基因报告载体;荧光素酶检测法显示与pGL3-basic比较,含有F383的3个报告基因F383、F720和F1039有强启动子活性,组间比较无显著性差异;与对照组比较,SssI甲基化酶处理的F383、F720和F1039启动子活动明显降低(P<0.05).结论:成功获得由Pdx1启动子调控的荧光素酶基因表达载体,并筛选出具有强启动子活性的3个报告基因(F383、F720和F1039),且其启动子活性受DNA甲基化影响.其中F383可能是Pdx1启动子核心,这些结果为研究胃癌...     

MEF2A第11号外显子四个特殊变异位点的生物学活性研究

目的建立MEF2A蛋白细胞学定位和转录激活活性的体外检测体系,探讨MEF2A第11号外显子四个特殊变异位点的生物学意义。方法构建含绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）报告基因真核表达载体的MEF2A野生型融合表达质粒pEGFP-MEF2A和变异型融合表达质粒pEGFP-MEF2A-Mut;通过脂质体介导的方法将以上质粒转染到Hela和293T细胞,用荧光显微镜检测绿色荧光蛋白的定位表达情况。构建含HRC基因启动子/增强子序列的萤火虫荧光素酶报告基因表达质粒pGL3-HRC enhancer,将该质粒与野生型MEF2A cDNA表达质粒pCDNA-MEFcDNA,或变异型MEF2A cDNA表达质粒pCDNA-MEFcDNA-Mut,以及海肾荧光素酶质粒pRL-TK,用脂质体转染法共转染于293T细胞,Western blot检测MEF2A蛋白的表达,双荧光素酶报告基因检测系统测定荧光素酶报告基因的表达。结果本研究建立的细胞学定位和转录激活活性检测体系均可有效检测MEF2A蛋白的生物学活性;与野生型MEF2A蛋白相比,四种MEF2A特殊变异蛋白的细胞学定位和转录激活活性均无显著性差异。结论本研究发现的MEF2A基因第11号外显子四个含特殊变异位点的MEF2A变异蛋白不会影响其细胞学定位和转录激活的生物学活性。     

乙型肝炎病毒X基因对c-met基因启动子区的调控作用

目的 明确乙型肝炎X基因(HBx)对c-met基因启动子区的调控及其在肝细胞癌侵袭和转移中的机制.方法 将HBx表达质粒转染HepG2细胞,采用Western blot方法比较转染前后HBx对原癌蛋白质c-met(c-met)表达的影响,进一步将c-met基因启动子区分成5个(包括全部序列)不同长度的片段,然后与PGL3-Basic荧光素酶报告基因系统连接构建成重组质粒,将上述质粒与HBx表达质粒共转染于HepG2细胞中,通过荧光素酶测定、启动子区突变分析及侵袭试验比较转染前后HBx对c-met表达调控的影响.荧光素酶活性值采用ANOVA单因素方差分析,侵袭细胞数统计采用t检验.结果 HBx能够增强c-met的表达;通过对c-met基因启动子区缺失分析,确定了c-met基因启动子区(-183 bp～-100 bp)是HBx作用的调控区域,进一步对该区域可能的转录因子结合位点(SP1-1、SP1-2、AP-2)进行突变分析,发现这3个结合位点均参与了HBx对c-met基因启动子区的调控.测定全部缺失构建体荧光素酶活性结果显示,-184上游部分序列缺失后对HBx的反应有轻微的降低,当-183 bp/-122 bp、-121 bp/-100 bp两个片段缺失后,启动子对HBx的反应均有明显降低,F=40.37,P<0.01;c-met启动子突变分析显示,HBx诱导的荧光素酶活性在SP-1-1、SP-1-2,AP-2突变体组中明显下降,F=235.3,P<0.01.Matrigel侵袭试验检测结果显示,转染pCEP4-X-FLAG表达质粒的HepG2细胞侵袭性增加,穿膜细胞数为(74.33±6.24)个,而未转染组穿膜细胞数为(28.24±3.05)个,t=9.68,P<0.01.结论 HBx引起肝细胞癌的侵袭转移可能是通过对c-met基因启动子区(-183 bp～-100 bp)转录因子SP-1、AP-2结合位点的调控来实现的,但是该过程中所涉及的信号通路仍有待进一步研究.     

特发性矮小症患者SHOX基因启动子突变的功能分析

目的 研究矮身材同源盒基因(SHOX)启动子-372G→A突变对其转录活性的影响及机制.方法 构建含SHOX基因启动子野生型-372G和-372A纯合突变的荧光素酶报告基因载体,在鸡的软骨细胞中检测其转录活性;PCR扩增产生-372G及-372A转录活性的双链DNA探针,凝胶电泳迁移率(EMSA)榆测结合在-400/-290片段的转录因子.结果 报告基因结果 显示SHOX基因启动子-372A转录活性高于-372G 30%(P相似文献   

pGL3-Basic-COX-2-promoter:报告基因重组质粒的构建及其功能鉴定

目的:构建COX-2基因启动子荧光素酶报告基因重组质粒 pGL3-Basic-COX-2-promoter,并进行功能鉴定.方法:根据已知人的COX-2基因启动子序列设计两端引物,扩增人基因组DNA中的COX-2启动子.载体质粒pGL3-Basic和COX-2启动子分别用限制性内切酶HindⅢ和Bgl Ⅱ 双酶切,将COX-2基因启动子插入到pGL3-Basic报告载体中.构建的pGL3-Basie-COX-2-promoter重组质粒和内参质粒pRL-SV40瞬时共转染胃癌MKN45细胞,加入100倍细胞数量的Hpylori共培养不同时间后,检测双荧光素酶的活性.结果:成功构建COX-2基因启动子重组质粒pGL3-Basie-COX-2-promoter,质粒测序及酶切结果完全正确.瞬时转染实验显示,COX-2启动子在MKN45细胞中的转录表达随时间的变化而升高,转染后40 h的双报告基因活性是转染后8 h的3.5倍(P＜0.01);加入Hpylori共培养后,同时间点的荧光素酶活性明显升高(P＜0.05或0.01),转染后40 h的活性是转染后8h的5倍(P＜0.01).结论:pGL3-Basic-COX-2-promoter在胃癌MKN45细胞中能被转录激活,加入Hpylon刺激后COX-2活性显著增强,pGL3-Basic-COX-2-promoter可以用来鉴定和检测细胞中,COX-2的水平.     

乙型肝炎病毒启动子调控的增强型绿色荧光蛋白真核表达载体的构建与表达

目的研究乙型肝炎病毒（HBV）启动子（含增强子）调控下的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因在肝癌细胞中的表达.方法用聚合酶链反应（PCR）技术分别扩增出HBV的4个启动子,载入T载体,测序后插入到含EGFP报告基因的质粒pEGFP-1,构建出HBV不同启动子调控的EGFP基因表达载体,经酶切、测序鉴定各重组体.采用脂质体介导法将4种构建好的载体转染肝癌细胞株HepG2,用倒置荧光显微镜观察各重组体转染细胞中EGFP的表达.结果各目的片段测序正确并成功插入表达载体中,转染了各质粒的阳性细胞克隆均可检测出EGFP的表达,不同启动子调控下的蛋白表达量有所不同. 结论HBV启动子调控下的EGFP报告基因能够在肝癌细胞中特异表达,不同启动子表达效率之间存在一定的差异性,从而为肝脏疾病的基因治疗提供了一个新的选择.     

pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达

目的构建pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2重组表达载体并进行293T细胞的转染表达。方法根据pcDNA3-HBsAg-p30-ROP2重组质粒设计引物,进行PCR扩增,获得HBsAg-p30-ROP2融合基因并进行酶切,酶切片段与pEGFP-N1载体连接,构建pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2真核表达载体,酶切和测序鉴定后转染293T细胞,采用荧光、Western blot和ELISA检测其蛋白表达效率;分别用P30单抗腹水、ROP2鼠源多抗、乙肝患者血清进行ELISA,检测融合蛋白的免疫反应性。结果 PCR扩增HBsAg-p30-ROP2基因片段约2 600bp,与理论值相符。构建的重组质粒pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2经双酶切获到约4 700bp和约2 600bp的两条片段,与预期相符。对重组载体测序,HBsAg基因的252位C→A,345位T→C,ROP2基因的695位A→T,且3个碱基突变均为同义突变。免疫荧光法检测pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2转染成功并正确表达,细胞蛋白浓度2.40mg/ml。提取的融合蛋白能被弓形虫p30单抗腹水、ROP2鼠源多抗和乙肝患者血清识别。结论成功构建pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2重组表达载体,并在293T细胞中过表达,表达蛋白具有免疫反应性,为乙肝和弓形虫联合疫苗的研制奠定了基础。     

小鼠谷胱甘肽S转移酶K1启动子荧光素酶报告基因的构建及功能鉴定

目的:构建小鼠谷胱甘肽S转移酶K1(mGSTK1)启动子荧光素酶报告基因质粒,并分析其活性。方法:根据GeneBank中mGSTK1基因序列设计引物,应用PCR技术扩增mGSTK1启动子片段,插入pGL3-basic载体,获得mGSTK1启动子报告基因质粒pGL3-mGSTK1-2046。再以pGL3-mGSTK1-2046为模板,进一步构建了2个5’端部分缺失的报告基因质粒:pGL3-mGSTK1-936和pGL3-mGSTK1-76。将构建的报告基因质粒瞬时转染不同的细胞株3T3-L1和人胚肾(HEK)293,48 h后检测荧光素酶的活性。结果:所构建的质粒经酶切、测序鉴定正确。pGL3-mGSTK1-2046在3T3-L1和HEK293中均有不同程度的转录活性。将pGL3-mGSTK1-2046、pGL3-mGSTK1-936和pGL3-mGSTK1-76转染HEK293细胞,结果显示pGL3-mGSTK1-936转录活性最高,而pGL3-mGSTK1-76转录活性显著降低。结论:成功构建mGSTK1启动子荧光素酶报告基因质粒;翻译起始点上游的-971～-111 bp片段是mGSTK1启动子的重要区域。为深入了解mGSTK1启动子的调控机制以及今后对代谢性疾病的治疗提供一定的实验基础。     

SV40T抗原真核表达载体的构建及其在食管癌细胞EC9706中的表达鉴定

构建胃壁细胞特异性表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV和非特异性表达载体pcDNA3.1(-)/SV,行酶切及测序鉴定.用脂质体转染法将构建的载体导入食管癌细胞EC9706细胞株,RT-PCR法检测SV40T抗原基因的表达,免疫组化法检测蛋白表达情况. 结果限制性内切酶分析与测序结果示H /K ATP酶β亚基启动子与SV40T基因成功构建于pcDNA3.1(-)真核表达载体中;转染细胞提取基因组DNA及总RNA,分别经PCR和RT-PCR反应扩增出618 bp和272 bp的特异性片段,非特异性表达载体pcDNA3.1(-)/SV瞬时转染时SV40T抗原表达阳性,而特异性表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV转染组蛋白表达阴性.认为构建特异性表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV并在食管癌细胞EC9706中检测其表达为转基因肿瘤动物模型的建立奠定了理论基础.     

日本血吸虫4个基因启动子相关序列的克隆和初步研究

目的 比较4个日本血吸虫基因启动子相关序列对荧光素报告基因的表达情况。方法 利用PCR技术扩增4个日本血吸虫基因启动子的相关序列, 并利用常规分子生物学技术将PCR产物克隆到荧光素酶报告基因的上游。利用脂质体转染和电穿孔技术将纯化的重组质粒分别转染到HEK293细胞和日本血吸虫体内, 并以荧光素酶检测系统测定了报告基因表达情况。结果 PCR扩增获得了日本血吸虫卵壳蛋白 （Eggshell protein, ESG?2A）、 延伸因子1 （Elongation factor 1 al? pha 1, EF）、 烯醇酶 （Enolase, EN） 和抱雌沟蛋白 （Gynecophornal canal protein, GCP） 基因的启动子相关序列, 并将它们成功地克隆到pGlu?Basic载体。重组质粒转染表明4个日本血吸虫启动子相关序列均可驱动荧光素酶报告基因在HEK293细胞和日本血吸虫虫体表达。其中含有GCP和EN启动子相关序列的重组质粒可在HEK293细胞及其培养基中检测到较高的荧光素酶活性, 含有GCP和ESG的重组质粒可在日本血吸虫虫体培养基中检测到较高的荧光素酶活性。结论 获得的4 个日本血吸虫启动子相关序列均可驱动荧光素酶报告基因在HEK293细胞和日本血吸虫虫体表达, 为进一步利用这些启动子相关序列开展血吸虫基因操作研究奠定了初步基础。     

诱导型和内皮型一氧化氮合酶基因多态性与肝硬化门静脉高压的相关性

目的探讨诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因多态性与肝硬化门静脉高压的相关性。方法采用病例对照和聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术,检测106 例乙型肝炎后肝硬化患者(其中门静脉高压症65例)和108名健康对照者iNOS基因启动子-969G→C多态性及eNOS基因第七外显子894G→多态性,比较等位基因及基因型频率,并进行综合分析。结果在iNOS启动子969G→C多态性中,门静脉高压症组C等位基因和GC基因型频率比对照组显著升高(x2- 5.93,P<0.05)。GC基因型启动子的活性比GG基因型活性强。在eNOS的894G→T多态性中,T等位基因频率明显高于对照组(x2-3.91,P<0.05)。采用Logistic多元回归显示iNOS基因启动子-969G→C多态性及cNOS的894G→T多态性是门静脉高压症新的危险因素。结论iNOS启动子969G→C多态性和eNOS的894G→T多态性与门静脉高压症相关,是形成门静脉高压症新的危险因素。iNOS启动子-969G→C多态性可导致该基因启动子功能活性增强。     

ApoM基因启动子区T-788C多态性与急性冠脉综合征的关系

目的 探讨ApoM基因启动子区T-788C多态性与急性冠脉综合征(ACS)的关系.方法 采用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性技术结合琼脂糖凝胶电泳和基因测序等对675例ACS患者(ACS组)和636例正常健康体检者(对照组)的ApoM基因启动子区T-788C基因型和等位基因频率进行检测.结果 ApoM基因启动子区T-788C多态性在ACS组和对照组的分布频率符合Hardy-Weinberg平衡定律.ApoM基因启动子区T-778C C等位基因及CC基因型ACS组显著高于对照组(P均＜0.01).Logistic回归分析显示,在校正冠状动脉疾病易感因素后,ApoM基因启动子区T-788C C等位基因是ACS发病的独立危险因素(OR =2.14,95％ CI为1.08 ～2.86,P＜0.01).结论 ApoM基因启动子区T-778C多态性与ACS发病存在相关性,其中C等位基因是其独立危险因素.     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5A-TP9启动子序列的确定及转录活性的鉴定

目的：阐明丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A(NS5A)反式激活基因NS5A-TP9表达的调控机制。方法：选取NS5A-TP9基因翻译起始密码子ATG上游661bp的基因组DNA序列作为启动子序列，应用聚合酶链反应(PCR)技术，以肝母细胞瘤细胞系HepG2基因组DNA为模板，扩增该启动子DNA片段，将其克隆至pCAT3中，构建pCAT3-NS5A-TP9-promoter报告基因表达载体，以该质粒转染HepG2细胞，用酶联免疫吸附法(ELISA)检测报告基因编码产物氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性。结果：发现质粒pCAT3-NS5A-TP9-promoter具有指导报告基因CAT转录表达的启动子活性，CAT的吸光度(A值)是缺乏启动子序列对照质粒pCAT3的13．9倍。结论：本研究克隆的启动子DNA序列具有指导下游基因转录的启动子活性，这一结果为研究新基因NS5A-TP9转录表达的调节机制，进一步阐明丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A的作用机制奠定了基础。     

Sonic hedgehog蛋白N端基因片段毕赤酵母表达载体的构建

目的 构建含Sonic hedgehog(SHH)蛋白N端基因片段的毕赤酵母表达载体.方法 通过BamH 1、Xho 1双酶切、T4连接酶连接,将SHH-N基因片段插入pET22b原核表达载体,构建pET22b-SHH-N质粒;经PCR扩增,产物再与pTA2载体连接,构建pTA2-SHH-N重组质粒;经EcoR 1及Not 1双酶切、T4连接酶连接,将SHH-N端基因片段插入pPIC9K质粒,构建pPIC9K-SHH-N重组质粒;通过线性化、脱磷酸化,将线性化pPIC9 K-SHH-N DNA转染毕赤酵母菌株GS115,最后经PCR扩增和测序鉴定.结果 转染的毕赤酵母经PCR扩增和测序证实含有SHH-N基因片段,与原始的基因片段序列完全一致.结论 成功地构建含SHH-N蛋白基因片段的毕赤酵母表达载体.     

内脂素基因启动子多态性与中国人2型糖尿病脂代谢紊乱的相关性

目的探讨内脂素基因启动子-1535C/T多态性的分布及其与中国人2型糖尿病(T2DM)脂代谢紊乱的关系。方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术,检测208例初诊T2DM患者和162例糖耐量正常(NGT)者的内脂素基因启动子-1535C/T多态性,分析该基因多态性与腰围、BMI、血浆内脂素及血脂代谢指标的相关性。结果 两组内脂素基因型分布及等位基因频率比较无统计学差异(P0.05);但与TC、CC基因型患者比较,T2DM组TT基因型患者甘油三酯升高、HDL-C降低(P0.05)。荧光素酶活性比较,pGL3-1535T的相对荧光素酶表达活性较pGL3-1535C下降了约28%(P0.01)。结论内脂素基因启动子-1535C/T多态性与中国人T2DM脂代谢紊乱有相关性。